Cromatografia e suas aplicações em

purificação de proteínas e peptídeos

Alexandre Rosolia – Assessor Técnico - HPLC
1 - Cromatografia Líquida
História e Evolução
Alexandre Rosolia – Assessor Técnico - HPLC
O que é a Cromatografia

• A Cromatografia é
um método analítico
de separação e
quantificação de
compostos em uma
mistura.
Cromatografia Líquida

• Primeiro experimento de
Cromatografia Líquida foi
efetuado por Tswett em 1906,
onde um extrato de folhas foi
percolado com diferentes
solventes por uma coluna de
vidro recheada com uma mistura
de carbonato de cálcio e
alumina, até a separação do
mesmo em faixas coloridas. Daí
o nome Cromatografia ou
“Escrita por Cores”
 Cromatografia Líquida Clássica

• Novos materiais tornaram

a cromatografia líquida
clássica uma técnica
viável para separação e
quantificação de
substâncias, porém foi
alcançado um patamar
aonde somente a força da
gravidade não é suficiente
para percolar o solvente
através das novas fases
e s t a c i o n á r i a s .
Cromatografia Liquida de Alta
Eficiência - HPLC

• Para superar a resistência das novas

fases estacionárias com tamanho de
p a r t í c u l a s m e n o res, o solvent e é
impulsionado por um sistema de
bombeamento contínuo, a amostra
introduzida através de uma válvula de
amostragem e as substâncias após
separadas são detectadas através de
sist em as “ on- line ” com pletamente
computadorizados, o qual interpreta os
dados provenientes do sistema.
Cromatografia Liquida de Alta
Eficiência - HPLC

UV
TesteSppedrod002
125
RetentionTime 125
Name

0.460
100 100

75 75

mAU

mAU
0.762
50 50

25 25

0 0

0.327
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
Minutes

Cada pico corresponde

à um componente
presente na amostra.
A área destes picos
correspondem ao teor
do componente.
2 - Instrumentação Cromatográfica

Alexandre Rosolia – Assessor Técnico - HPLC

Estrutura do Sistema

• Componentes:
– Bomba - Impulsiona a fase móvel pelo sistema
– Injetor de amostras - Coloca amostra no sistema
– Coluna - Aonde ocorre a separação da amostra
– Detector - Transforma a amostra em sinal elétrico
– Sistema de dados - Coleta de dados e controle do sistema
Bomba de HPLC
Bomba de HPLC
Cabeça da Bomba
 Modo de Eluição

• GRADIENTE: Onde há alteração da composição da Fase Móvel ao longo

do tempo de análise

• ISOCRÁTICO: Onde não há alteração da composição da Fase Móvel ao

longo do tempo de análise

0 4 8 12 16 20 24
Minutes
Sistemas de Gradiente
Alta Pressão
Sistemas de Gradiente
Baixa Pressão
Válvula Rheodyne
Válvula Rheodyne
Amostrador Automático
Amostrador Automático
Forno para Colunas
Detector UV
Detector DAD
Detector DAD
Detector de Condutividade
Coletor de Frações
3 -Técnicas de Separação
Cromatográfica
Alexandre Rosolia – Assessor Técnico - HPLC
Mecanismos de separação
para proteínas e peptídeos

• Exclusão de tamanho (SEC)

• Iônica (IEX)

• Afinidade

• Interação Hidrofóbica

• Fase Reversa (RP)

Exclusão de Tamanho (SEC)

• Conhecida também como

Cromatografia de Filtração em
Gel (GFC).
• Efeito de separação
completamente físico.
• Utiliza-se resinas de porosidade
controlada de acordo com a
faixa de peso molecular
desejado na eluição.
• A ordem de eluição é sempre da
molécula mais pesada
(excluída) para a molécula mais
leve (permeada).
Exclusão de Tamanho (SEC)
Exclusão de Tamanho (SEC)
Exclusão de Tamanho (SEC)
Cromatografia de Troca Iônica (IEX)

• Técnica mais comum em

purificação de proteínas
• A natureza anfótera das
proteínas fazem elas adquirirem
carga dependendo do pH do
meio. A proteína é neutra no
ponto iso-elétrico (pI). Em pH
mais alto, ela é um ânion e em
pH mais baixo, um cátion.
• A separação ocorre com a
interação diferencial entre as
cargas da proteína e da resina
• Após a proteína ser capturada
pela resina iônica, pode-se eluir
a mesma alterando o pH do
meio ou sua salinidade, quando
a proteína perde sua carga.
Cromatografia de Troca Iônica (IEX)

• Tradicionais
• Resinas Aniônicas Fortes
– TMAE
• Resinas Aniônicas Fracas
– DEAE
– DMAE
• Resinas Catiônicas Fortes
– SO3-
– SE
• Resinas Catiônicas Fracas
– COO-
Cromatografia de Troca Iônica (IEX)

• Fractogel
• Resinas Aniônicas Fortes
– TMAE
• Resinas Aniônicas Fracas
– DEAE
– DMAE
• Resinas Catiônicas Fortes
– SO3-
– SE
• Resinas Catiônicas Fracas
– COO-
Cromatografia de Troca Iônica (IEX)
Cromatografia de Troca Iônica (IEX)
Cromatografia de Afinidade

• A separação por cromatografia

de afinidade ocorre com a
interação reversível entre a
proteína (ou grupo de proteínas)
e um ligante acoplado à matriz
da resina.
• A troca da condição de eluição
(pH, salinidade ou polaridade)
faz com que a proteína se
desacople do ligante, assim
eluindo para fora da coluna.
• Existem vários tipos de ligantes,
desde interações covalentes até
interações com anti-corpos
específicos.
Cromatografia de Afinidade

• Fractogel
• Resinas de Afinidade
– Quelato – para uso por
afinidade metálica
– Amino – para uso por afinidade
por grupo NH2
– TA – para uso por afinidade por
adsorção tiofílica
– Epoxy – para uso por afinidade
por imobilização.
Cromatografia de Afinidade
Cromatografia de Interação
Hidrofóbica

• Separa proteínas com

diferenças nas áreas
OR hidrofóbicas.
RO H
O • A interação entre a resina e a
N proteína aumenta na presença
N
O de alta concentração de íons.
H
RO OR
• A eluição ocorre diminuindo a
O H concentração de sal no buffer.
N N
• A força de ligação aumenta na
H O OR
RO seguinte ordem dos ligantes:
éter, isopropil, butil, octil, fenil
Cromatografia de Interação
Hidrofóbica
Cromatografia de Interação
Hidrofóbica
Cromatografia de Fase Reversa

• A separação ocorre por

diferença de hidrofobicidade
entre a proteína e a fase ligada
(normalmente C4, C8 ou C18).
• A eluição ocorre com o aumento
da quantidade de solvente
orgânico no buffer de (eluição
em gradiente).
• Utilizada normalmente como
estágio final de purificação de
peptídeos e oligonucleotídeos.
• Técnica ideal para separação
em escala analítica e “scouting”
para escala preparativa.
Peptídeos em Fase Reversa

• O mecanismo de partição das moléculas pequenas não se aplica na

cromatografia de proteínas e peptídeos.
• Estes são adsorvidos na fase estacionária até que uma concentração
crítica de solvente orgânico entre na coluna e cause a desorpção.
• O mecanismo de Fase Reversa separa os peptídeos e proteínas
baseado na diferença nas áreas hidrofóbicas das moléculas, isto é,
diferenças de conformação e seqüência de amino-ácidos.
Cromatografia de Fase Reversa

• Gráfico de retenção x % de
solvente orgânico na fase
móvel.

• O mecanismo de partição
tradicional mostra uma gradual
perda de retenção conforme
ocorre o aumento da % de
solvente orgânico na fase
móvel.
Cromatografia de Fase Reversa

• Gráfico de retenção x % de
solvente orgânico na fase
móvel.

• A retenção de uma proteína ou

poli-peptídeo cai drasticamente
com uma pequena variação da
% de solvente orgânico na fase
móvel.

• Após a desorpção, praticamente

não existe interação entre a
coluna e o analito.
Cromatografia de Fase Reversa

• Gráfico de retenção x % de
solvente orgânico na fase
móvel.

• A retenção de um peptídeo leve

mostra um misto do mecanismo
de partição e adsorção na
coluna cromatográfica.

• Após a desorpção, ainda é

possível controlar a retenção do
analito.
Cromatografia de Fase Reversa
Cromatografia de Fase Reversa
Fase Reversa x Iônica
Influência da Polaridade da F.M.

• Por causa do mecanismo de

adsorção / desorpção e do
melhor controle do alargamento
dos picos, trabalhar sempre com
gradientes de solvente orgânico,
mesmo que a diferença entre as
condições inicial e final seja
pequena.
Influência do Tempo de Gradiente
Influência do pH da Fase Móvel
Influência do tipo de Buffer
Influência da Temperatura
Influência do Tamanho de Poro

• A fase estacionária é
extremamente porosa e a
maioria dos sítios ativos da
coluna encontram-se dentro dos
poros.
• A proteína deve permear dentro
destes poros para ser adsorvida
e separada corretamente
• A escolha do tamanho de poro
da coluna é crucial neste tipo de
separação.
Fases Estacionárias
Coluna Monolítica
Influência do Tamanho de Poro
Influência do Tamanho de Poro
Colunas Wide-Pore
Peptídeos e Colunas Monolíticas
Peptídeos e Colunas Monolíticas
Influência da Carga de Amostra
4 - Purificação de Proteínas e Peptídeos
por Cromatografia Preparativa
Alexandre Rosolia – Assessor Técnico - HPLC
Cromatografia Preparativa

• A cromatografia líquida foi

desenvolvida originalmente
como uma técnica de
separação e quantificação de
substâncias em uma mistura.
• Com o advento da
separação, é possível alterar
a escala do sistema
cromatográfico para
conseguir coletar grandes
quantidades de substâncias
puras, passando assim à um
sistema de separação e
purificação de materiais
Diferenças entre a cromatografia
analítica e preparativa

Sistema Analítico Sistema Preparativo

Objetivo da análise Seletividade e Produtividade e

Eficiência Capacidade
Tamanho de partícula de 2 à 10um de 10 à 300um
Dimensão da coluna < 5 mm 10 à 1000 mm
Razão Comp:Diam 60:1 4:1
Formato dos picos Gaussiano Deformado
Nr. de frações 10 ou mais até 5
Fluxo < 10 mL/min de 10 a 1000 mL/min
Quantidade de amostra < 1mg de g a Kg
Como transferir a separação

Scale-up
Equação de Scale-Up

XA XP 1
2
= 2
⋅
π ⋅ rA π ⋅ rP CL
XA - Fluxo na coluna Analítica
XP - Fluxo na coluna Preparativa
rA - Raio da coluna Analítica
rP - Raio da coluna Preparativa
CL - Razão Comprimento Preparativa
Comprimento Analítica
Colunas Preparativas

Dimensão da Fluxo Capacidade Volume de

Coluna (ml/min) de Carga Carga
L / D ( mm) (mg) (µl)
250 - 4 1 5 5 - 80

250 - 10 6 30 30 – 500

250 – 25 39 200 200 – 3.000

250 – 50 156 800 800 –12.500

400 – 100 625 5120 5.120 –

80.000
Scale-up - Exemplo

• Escala analítica • Escala preparativa

• Coluna: 250 x 4 mm • Coluna: 250 x 50 mm

• Fluxo: 1,5 mL/min • Fluxo: 234 mL/min
• Concentração: 5 mg/mL • Concentração: 780 mg/mL
• Volume de injeção: 20 uL • Volume de injeção: 3.120 uL

XA XP 1
= ⋅ Fator de escala: 156 x
2 2
π ⋅ rA π ⋅ rP C L
Separação Preparativa
 Etapa 1 – Otimização da Separação

2250 2250
D AD - C H 1 2 5 4 n m
S c o u t M i x g r a d 0 -7 5 p c t 5 m i n 0 0 7

2000 2000

1750 1750

1500 1500

1250 1250
mAU

mAU
1000 1000

750 750

500 500

250 250

0 0

-2 5 0 -2 5 0
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
M in u t e s
 Etapa 2 – Estudo de Sobrecarga

2250 2250
D AD -C H 1 2 5 4 n m D AD -C H 1 2 5 4 n m D AD -C H 1 2 5 4 n m D AD - C H 1 2 5 4 n m
Sco u t 1p ct 450u l 004 S co u t 1p ct 200u l 003 S co u t 1p ct 10u l 001 S co u t 1p ct 100u l 002

2000 2000

1750 1750

1500 1500

1250 1250
mAU

mAU
1000 1000

750 750

500 500

250 250

0 0

-2 5 0 -2 5 0
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
M in u t e s
 Etapa 2 – Estudo de Sobrecarga

D AD -C H 1 2 5 4 n m D AD -C H 1 2 5 4 n m D AD -C H 1 2 5 4 n m D AD - C H 1 2 5 4 n m
Sco u t 1p ct 450u l 004 S co u t 1p ct 200u l 003 S co u t 1p ct 10u l 001 S co u t 1p ct 100u l 002

275 275

250 250

225 225

200 200

175 175

150 150
mAU

mAU
125 125

100 100

75 75

50 50

25 25

0 0

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
M in u t e s
 Etapa 2 – Estudo de Sobrecarga

2250 2250
D AD -C H 1 2 5 4 n m D AD -C H 1 2 5 4 n m
S c o u t M i x g r a d 0-7 5p c t 5 m i n 0 0 7 Sco u t 1p ct 450u l 004

2000 2000

1750 1750

1500 1500

1250 1250
mAU

mAU
1000 1000

750 750

500 500

250 250

0 0

-2 5 0 -2 5 0
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
M in u t e s
 Etapa 3 – Transferência para o
Sistema Preparativo
P 311
te s te p r e p 0 0 2
3000 3000

2500 2500

2000 2000

1500 1500
mAU

mAU
1000 1000

500 500

0 0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
M in u t e s
 Etapa 4 – Fracionamento dos
picos e análise das frações
P 311
teste prep 002
3000 3000

2500 2500

2000 2000

1500 1500
mAU

mAU
1000 1000

500 500

0 0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
Minutes
 Etapa 4 – Fracionamento dos
picos e análise das frações
P 311
teste prep 002

2750 2750

2500 2500

2250 2250

2000 2000

1750 1750

1500 1500
mAU

mAU
1250 1250

1000 1000

750 750

500 500

250 250

0 0

3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4.0 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8
Minutes
Etapa 5 – Escolha das frações
cromatograficamente puras
Etapa 6 – Automação do
processo de purificação

Composto de interesse - Coletado

Sistema LaPrep
Sistema LaPrep

• Bombas de Fase móvel – P110

– Isocrática / Gradiente de alta e baixa pressão (até 3 solventes)
– Cabeças de bombeamento de 100, 250, 500 e 1000 mL/min
– Fácil mudança de escala
– Programável
– Controlada via Software
– Uso de mixer dinâmico
Sistema LaPrep

• Injeção de amostras
– Bomba de injeção de amostras – P130
• Cabeças de 10 e 50 mL/min
– Injetor manual Rheodyne
– Válvulas de injeção automatizadas
– Autosamplers opcionais
Sistema LaPrep

• Detectores
– Comprimento de onda fixo – P310
– Comprimento de onda variável – P311
– Multi-comprimento de onda – P314
– Índice de refração – P320
– Células intercambiáveis
– Opção para Fibra Óptica *
Sistema LaPrep

• Válvulas automáticas
– P202 – Chaveadora 6 x 2 – Injeção / troca de coluna / reciclo
– P206 – Coletora de Fração 7 canais
– P212 – Coletora de Fração 12 canais
– P216 – Coletora de Fração 16 canais
Sistema LaPrep

• Software EzChrom Elite

– Plataforma única
– Controle integral sobre o LaPrep
– Sistema de aprendizado de coleta
Empacotador de Colunas

• Sistema completo com coluna,

prensa e acessórios

• Opção de colunas encamisadas

para aquecimento (forno)

• Custo operacional mais baixo

que colunas prontas

• Diâmetros de 25, 50 e 100 mm

• Opera com qualquer fase

estacionária
Empacotador de Colunas
Solventes Prepsolv

• Próprios para cromatografia

preparativa

• Baixo resíduo de evaporação

• Custo mais baixo que a linha de

solventes LiChrosolv

• Fornecimento em tambores para

maior comodidade e automação
em processos contínuos de
purificação
Cromatografia e suas aplicações em
purificação de proteínas e peptídeos
Alexandre Rosolia – Assessor Técnico - HPLC