CROMATOGRAFIALQUIDA

CLSSICAE
CROMATOGRAFIALQUIDA
DEALTAEFICINCIA
(CLAEOUHPLC)
 Eluioemcromatografiadecoluna
Eluio: um processo no qual os solutos so lavados atravs
da fase estacionria pelo movimento de uma fase mvel.

Eluente: um solvente empregado para transportar os

componentes de uma mistura atravs de uma fase estacionria.

Cromatograma o registro do sinal do detector em funo do

tempo de corrida ou um grfico de alguma funo da
concentrao do soluto versus o tempo de eluio.
 Cromatografia em Coluna
Anlise preparativa

Coluna de slica gel Separao por:

Polaridade
Alto poder de adsoro
Tamanho de partcula: 150 a 200 m Tamanho
Grupo funcional
 Cromatografia em Coluna
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

Recheios com partculas menores que 10 m

 InstrumentaoparaHPLC

Equipamento mais sofisticado exigindo o uso de bombas de alta presso

InstrumentaoparaHPLC
 InstrumentaoparaHPLC
Reservatrios de
Solvente

Solventes devem ser filtrados (remoo de material particulado).

 InstrumentaoparaHPLC
Sistema de remoo
de gases dissolvidos

Gs insolvel na fase mvel

Formao de bolhas na coluna (alargamento de banda e rudo no detector)

InstrumentaoparaHPLC

Sistema de mistura
de solventes
Eluio isocrtica vs gradiente

Eluio por gradiente

40:50 (v/v) metanol/gua
Metanol foi aumentado 8%/min

Resoluo
Tempo de anlise

Eluio isocrtica
50:50 (v/v) metanol/gua
InstrumentaoparaHPLC

Bomba
 SistemadeBombeamento

REQUISITOS:
pressesdeat6000psi(~400atm)
vazocontnua,sempulsos(ou,sepulsando,com
amortecedordepulsos)
vazesde0,1a10mLmin1 (aplicaesanalticas)eat
100mLmin1 (aplicaespreparativas)
controledevazoereprodutibilidademelhorque0,5%
inrciaqumica:componentesresistentescorroso
 SistemadeBombeamento
Tipos:
Bombasrecprocas(pistooudiafragma)90%!!!
Vantagens:
Pressoelevada(at10000psi)
Pequenovolumeinterno(35a400L)
Permitegradiente
Desvantagens:
Fluxopulsadoealtocusto
Bombaspneumticas(gscomprimido)
Vantagens:
Barataselivresdepulso
Desvantagens:
Limitaesdecapacidadeepresso(<2000psi)
Bombasdedeslocamento(tiposeringa)
Livredepulsaes
Baixovolumedeestocagem(250mL)enopermitegradientes
InstrumentaoparaHPLC

Amortecedor
de pulsos
InstrumentaoparaHPLC

Injetor
 SistemadeInjeodeAmostra

Aladeamostragemde5a500L
Comala volumefixoereprodutvel

Comseringa volumevarivele
poucoreprodutvel
 InstrumentaoparaHPLC

Pr-Coluna
 PrColuna
Pequenaedeconstituiosimilardacoluna
analtica
Retm:
Materialparticulado
Contaminantesdosolvente
Componentesdaamostraqueseligam
irreversivelmentefaseestacionria
Saturarafasemvelcomafaseestacionria
Custoreduzido
InstrumentaoparaHPLC

Coluna
 ColunaAnaltica
Geralmenteemaoinox
Colunadevidroreforado(limitede600psi)
Colunaempacotada
Preo:>US$3,000.00
emgeralde10a30cm;4a10mmdimetro
internocompartculasde3,5e10m
Microcolunas:4cmx4mmx3m

Termostatizao: em geral coluna operada a temperatura ambiente;

no entanto, cromatogramas de melhor qualidade so obtidos quando a
temperatura da coluna controlada; fornos aquecidos at 100150 C
esto disponveis
 InstrumentaoparaHPLC

?
Detector
DetectoresparaHPLC
Detector:monitoramentodoeluentequesaidacoluna
medidadiferenciadadaspropriedadesdaamostraedafasemvel
medidadeumapropriedadedaamostraquenoapresentadapelafasemvel
detecoapseliminaodafasemvel

Detectores universais ou globais:

Respondem s propriedades do eluato de um modo geral.
Capacidade de trabalhar com todos os tipos de amostras
ndice de refrao, constante dieltrica, densidade, condutividade...

Detectores de propriedades de solutos (seletivo):

Respondem (predominantemente) s propriedades dos analitos.
Mais sensvel e melhor desempenho para a anlise de amostras complexas
Mais utilizado em laboratrios de rotina
absorbncia, fluorescncia, amperometria...
 CaractersticasdeumDetectorIdeal
altasensibilidade,seletividadeebaixolimitededeteco
amplafaixalineardeconcentrao(vriasordensdegrandeza)
respostarpidaatodosossolutos(alargamentodepicos)
insensibilidadeamudanasdetemperaturaenavazodafasemvel
respostaindependentedafasemvel
baixovolumeinterno(pequenacontribuioaoalargamentodopicopelo
volumeextradaceladodetector)
respostaqueaumentelinearmentecomaquantidadedosoluto
nodestruiodosoluto
seguranaeconveninciaparauso
informaoqualitativadopicodesejado(identificao)
 TiposdeDetector
Propriedadespticas:
AbsorbnciaUVVis
Infravermelho
Fluorescncia
ndicedeRefrao
EspalhamentodeLuz
Atividadeptica
Eletroqumicos:
Voltamtrico/Amperomtrico
Condutomtrico(cromatografiadeons)
Potenciomtrico
EspectrometriadeMassas
 Detectorespectrofotomtrico
LmpadadeHg(254nm)

Lmpadadedeutrioe/ou
tungstnio

Presenadefiltrosou mono
cromadores
(comprimentodeondafixo,em
geral,254ou280nm)

Arranjodediodos (obtenodo
espectrointeiroemtemporeal=
identificao!!)
Grande maioria de compostos absorvem a radiao UV, destacando-se todas as
substncias com eltrons nas ligao e as que tm eltrons no emparelhados (ex.
ligaes >C=O, >C=S, -N=O e N=N-).
 Detectores por fluorescncia

Compostos que fluorescem => sensibilidade e

seletividade;
Deteco da ordem de 10-12 g (picogramas),
comparvel com detector de captura de eltrons (CG);
Alta intensidade de fluorescncia: compostos
conjugados simetricamente ou que no podem gerar
estruturas fortemente inicas (destilados de petrleo).
 Detectores por ndice de refrao
Detector universal => acompanha a diferena de ndice
de refrao entre a FM e a amostra;
Sensibilidade geralmente da ordem de 10-6 g
(micrograma);
Controle de temperatura essencial !!!
Desvantagem: variaes devido a alteraes de FM
(vazo e composio eluio por gradiente).
Empregos: cromatografia por excluso (para polmeros
ou amostras biolgicas, que geralmente no absorvem no
UV).
 Detectores eletroqumicos
Alta sensibilidade (muito bons para anlise de traos) e
alta seletividade;
Amperometria ou voltametria: amostra deve ser
constituda por molculas ou ons capazes de oxidar ou
reduzir. Seletividade baseada no potencial aplicado;
Condutomtricos (de baixa e alta freqncia) e
potenciomtricos;
So bons com FM aquosas => cromatografia por troca
inica ou por excluso.
Detector de Espectrometria de Massas (MS)
Acoplamento com HPLC: HPLC-MS

Soluo: Mtodos de ionizao a presso atmosfrica

Eletrospray - mais adequada para a anlise de espcies qumicas
de maior polaridade e massa molecular (por exemplo protenas).
APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) - mais
empregada na anlise de molculas de baixa polaridade e pequena
massa molecular (por exemplo, pesticidas).

=> espectrometria de massa em tandem (MS/MS) ou espectrometria

de massa sequencial
 Ionizao qumica presso atmosfrica
APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization)

Ionizao por electro-spray

ESI (Electrospray Ionization)
Petrolo e genoma
 Cromatografia Gasosa
Espectrometria de Massas (MS)

a. Cromatograma
b. Espectro de massa do pico 1
c. Espectro de massa do pico 2

M+ : on molecular
33
Caractersticas dos detectores
EscopodaCromatografiaLquida
Espcies MM > 104 :
Cromatografia de Excluso

Espcies inicas de baixa

MM: Cromatografia de Troca
Inica

Espcies pequenas e
polares, mas no inicas:
Mtodos de Partio
Espcies no-polares:
cromatografia por adsoro
(ismeros estruturais,
hidrocarbonetos alifticos).
 Aplicaestpicas
Cromatografiadeadsoro:
Compostosrelativamentenopolaresinsolveisemguaecommassasmolares
menoresque5.000.Possuiumaboahabilidadeparaseparaodemisturas
isomricas.
Cromatografiaportrocainica:
Anlisedectionseespecialmentenions.
Cromatografiaporexclusoportamanho:
Determinaorpidadamassamolaroudasdistribuiesdasmassasmolares
depolmerosdecadeialongaoudeprodutosnaturais.
Isolamentodebiomolculasduranteaetapapreparativa
Cromatografiadepartio:faseestacionriaumsegundolquido
imobilizadonacoluna

Farmacutico:antibiticos,sedativos,esterideseanalgsicos.
Bioqumico:Aminocidos,protenas,carboidratos,lipdeos.
Alimentos:Adoantes,antioxidantes,aflotoxinas,aditivos.
Industrialqumico:aromticoscondensados,tensoativos,propelentes,corantes.
Poluentes:pesticidas,herbicidas,fenis,bifenilaspolicloradas(PCBs).
Forense:drogas,venenos,lcoolnosangue,narcticos.
Mdicoclnico:cidosblicos,metablicosdedrogas,extratosdeurina,
estrgenos.
Partio
CromatografiaLquida:Partio(absoro)

Nos trabalhos pioneiros

foram usadas fases
estacionrias altamente
polares (trietilenoglicol
adsorvido sobre slica) e
solventes apolares
(hexano) como fase mvel.

Emfasenormal,ocomponentemenospolarelui primeiro,devidosua
maiorsolubilidadenafasemvel;oaumentodapolaridadedafasemvel
temoefeitodediminuirotempodeeluio.
CromatografiaLquida:Partio(absoro)

Na cromatografia de fase
reversa, a fase
estacionria apolar (por
exemplo, C18) e a fase
mvel relativamente
polar (gua, metanol,
acetonitrila, etc.)

Emfasereversa,ocomponentemais polar elui primeiro, devido a sua

maior solubilidade na fase mvel; aumentando-se a polaridade da
fase mvel, aumenta-se o tempo de eluio.