CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (HPLC):

A cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) é uma técnica usada para separar,
identificar e quantificar componentes em uma amostra líquida. Seus princípios
fundamentais são:
- Fase estacionária e fase móvel: A fase estacionária geralmente é uma coluna
empacotada com partículas de sílica ou outro material poroso, enquanto a fase móvel é
uma solução líquida que é bombeada através da coluna.
- Adsorção seletiva: A separação é realizada por meio da interação seletiva entre os
componentes da amostra e da fase estacionária. Componentes com diferentes afinidades
pela fase estacionaria se separam ao longo do tempo.
- Pressão e fluxo constantes: A HPLC é caracterizada pelo uso de pressão e fluxo
constantes para manter a eficiência de separação elevada. Isso é feito pelo uso de
bombas de alta pressão que empurram a fase móvel na coluna a uma taxa constante.
- Detectores sensíveis: A detecção dos componentes separados é feita com o uso de
detectores sensíveis, como UV-vis, fluorescência, ou detectores de índice de refração.
Eles são capazes de medir a concentração dos componentes conforme eles vão saindo
da coluna.
- Análise: Usada para análises qualitativas e quantitativa (área dos picos).
- Métodos isocráticos e gradiente: São dois métodos diferentes de eluição usados em
HPLC. No método isocrático, a composição da fase móvel permanece constante ao
longo do tempo. Já, no método de gradiente, a composição da fase móvel é alterada
gradualmente durante a análise, a fim de melhorar a separação dos componentes. Para
esse tipo de eluição, o uso de bombas duplas, ternárias ou quaternárias é indicado, pois
permitem uma mudança na composição da fase móvel em linha.
Vantagens da eluição por gradiente: boa resolução e menor tempo de análise.
Desvantagens: os cromatogramas apresentam variações na linha de base e é necessário
de um tempo adicional pra retornar a condição inicial, antes da próxima injeção (tempo
de análise).
- Colunas: São usadas colunas metálicas e fase móvel pressurizada para permitir vazão
mais rápida.
INSTRUMENTAÇÃO PARA HPLC:

- Reservatório de fase móvel: É o local onde se coloca o solvente/mistura de solventes

da fase móvel. O material do reservatório deve ser de vidro ou aço inoxidável, pois
plásticos liberam substâncias contaminantes. No reservatório possui um filtro que é
necessário para a remoção de impurezas particuladas da fase móvel, é poroso (10 a 40
micrometros). A fase móvel deve ser filtrada e desgafeificada (para evitar bolhas na
bomba cromatográfica).
Desgaseificação por vácuo: Envolve a aplicação de vácuo à fase móvel para remover
os gases dissolvidos. Geralmente, a fase móvel é colocada em um recipiente selado e
submetida à vácuo, provocando a liberação dos gases dissolvidos. Método eficaz,
especialmente para solventes com solubilidade alta em água.
Desgaseificação ultrassônica: A fase móvel é submetida a ondas ultrassônicas que
agitam a solução, provocando a liberação dos gases dissolvidos. Realizado em banho de
ultrassom, onde a fase móvel é agitada em uma frequência ultrassônica. Método menos
eficaz, pois, tem que ser reaplicado a cada 12 horas.
A desgaseificação é necessária para um bom funcionamento do sistema, para uma boa
reprodutibilidade da vazão, para estabilidade na linha de base e, também, para
transparência na faixa baixa de UV. Ela não deve mudar a composição da fase móvel.
- Sistema de bombeamento: A função de uma bomba em HPLC é enviar um fluxo
constante e reprodutível de fase móvel para a coluna, logo, são necessários alguns
requisitos, como: pressão até 400atm, vazão contínua sem pulsos, controle de vazão e
reprodutibilidade menor que 1% e inercia química (resistentes à corrosão).
Bomba recíproca/de pistão: Uma das bombas mais comuns em HPLC, utiliza um
pistão para comprimir e descolar a fase móvel na coluna. As bombas de pistão devem
ser de alta pressão em HPLC. Ela é uma pequena câmara que é preenchida e esvaziada
com a fase móvel pela movimentação do pistão. Nessa movimentação, o pistão produz
um fluxo pulsado que deve ter atenuado (bomba de duplo pistão).
Vantagens: pressão elevada, pequeno volume interno e permite gradiente.
Desvantagens: fluxo pulsado, alto custo e maio manutenção.
Bomba pneumática: A bomba pneumática usa ar comprimido ou gás como fonte de
energia para acionar o fluxo da fase móvel. O ar comprimido é fornecido a partir de
uma fonte externa, como um compressor de ar. O ar é direcionado para a bomba, onde é
usado para acionar um pistão ou um diafragma onde, então, o movimento pressuriza a
fase móvel e a força a entrar na coluna. A pressão é controlada ajustando a pressão do ar
comprimido fornecido à bomba, permitindo que a pressão seja constante e precisa, para
uma melhor separação.
Vantagens: baixo custo e livre de pulsações.
Desvantagens: baixa pressão, baixo volume, não permite gradiente e a vazão depende da
pressão de retorno e viscosidade da fase móvel. É menos comum de ser usada.
Bomba de deslocamento: A bomba de deslocamento é um tipo de bomba que opera
usando um mecanismo de deslocamento positivo para fornecer a fase móvel com
pressão constante e precisa durante a análise. Ela é uma das mais usadas, pois fornece
uma pressão estável e uma precisão de fluxo elevada.
A bomba empurra a fase móvel através do sistema usando um embolo, ela possui uma
câmara de bombeamento na qual a fase móvel é comprimida. A câmara é preenchida e
esvaziada repetidamente pelo movimento do embolo. A taxa de fluxo da fase móvel é
controlada ajustando a velocidade e o curso do embolo, permitindo que a bomba forneça
uma pressão constante e precisa. Elas possuem uma alta precisão e estabilidade de
fluxo.
Vantagens: Vazão independe da pressão de retorno e da viscosidade da fase móvel e é
livre de pulsações.
Desvantagens: Baixo volume e não permite gradiente.
Amortecedor de pulso: Conhecido como dampener/pulse damper, é um componente
usado em HPLC para reduzir ou eliminar pulsações de pressão geradas pela bomba.
Essas pulsações podem ocorrer decido ao movimento periódico do
pistão/diafragma/embolo dentro da bomba, que podem resultar em flutuações na pressão
da fase móvel entregue à coluna. Ele absorve as variações de pressão da fase móvel e
fornece um fluxo mais suave e estável para o sistema. Geralmente ele é composto por
um reservatório de volume conhecido conectado à linha de saída da bomba. Quando
ocorrem pulsações de pressão, o fluido dentro do amortecedor de pulso é comprimido
ou expandido, reduzindo a magnitude das pulsações antes que a fase móvel seja
entregue à coluna.

- Injeção de amostra: Com alça ou seringa.

Alça: Volume fixo e reprodutível.
Seringa: Volume variável e pouco reprodutível.
-Pré-coluna: Pequena e de constituição similar à da coluna analítica. Ela retem
materiais particulados, contaminantes do solvente e componentes da amostra que se
ligam irreversivelmente à fase estacionária. Tem um custo reduzido.
-Colunas e fornos para HPlC: Três colunas são empregadas em um sistema de HPLC.

Coluna de saturação: Ela é localizada entre a bomba e o injetor. Coluna usada para
pré-saturar a fase móvel com um reagente específico antes de entrar na coluna. Isso é
frequentemente necessário em aplicações onde é necessária uma reação química previa
com a amostra antes da separação. Ela é preenchida com um material poroso que retem
o reagente específico, permitindo que a fase móvel entre em contato com ele e se satura
antes de entrar na coluna principal. Ela evita a degradação do leito cromatográfico.
Coluna de guarda: Localizada entre o injetor e a cabeça da coluna cromatográfica, tem
menor dimensão e tem função de proteger a coluna principal de impurezas e
contaminantes presentes na amostra ou fase móvel. Ela ajuda a prolongar a vida útil da
coluna principal e geralmente é preenchida pelo mesmo tipo de fase estacionária que a
coluna principal.
Coluna cromatográfica: Geralmente é feita de aço inox e pode ser de vidro reforçado
ou empacotada (recheada).

- Fornos: Em geral, a coluna é operada em temperatura ambiente, mas cromatogramas

de melhor qualidade são obtidos quando a temperatura da coluna é controlada por
fornos de 100 a 150°C, e esse processo é chamado de termostatização.

Vantagens do forno: Aumento do processo de difusão do analito na fase estacionaria,

pois diminui a viscosidade de ambas as fases e tem pouca variação de temperatura.
DETECTORES PARA HPLC:
Os detectores em HPLC são usados para monitorar o eluente que sai da coluna. Para que
um dispositivo seja empregado como detector em HPLC, ele deve:
- Apresentar um volume de residência pequeno, minimizando o alargamento de banda.
- Ser pequeno e compatível com a vazão do líquido.
- Responder a qualquer substância.
- Apresentar uma alta detectabilidade às espécies eluidas.
- Ter boa estabilidade.
- Não ser destrutivo.
- Compatível com eluição por gradiente.
- Detector seletivo: Permite detectar uma de duas ou mais espécies que co-eluam. Em
geral apresentam uma melhor linha base. Eles respondem às propriedades dos solutos,
são mais sensíveis e apresentam melhor desempenho para a análise de amostras mais
complexas. Exemplo: absorbância, fluorescência, amperometria etc.
- Detector universal: Respondem às propriedades da fase móvel de um modo geral e
possuem capacidade de trabalhar com todos os tipos de amostra.
- Detector não seletivo: Útil para quando todas as espécies são separadas.
- Faixa linear de um detector: Faixa linear é a região da curva de calibração que se
ajusta bem a uma reta, quando o detector gera uma ampla faixa linear, significa que ele
tem maior comodidade no dimensionamento do volume de amostra e que ele tem maior
capacidade de acomodar em uma mesmo a corrida cromatográfica, picos referentes a
espécies de concentrações muito diferentes.
- Volume: Um baixo volume interno evita de alargamento nos picos registrados.
- Resposta: O detector deve apresentar sinal que representa um exato instante de uma
porção do caminho, quando o detector é lento, os picos são deformados (baixos e
largos) e possuem uma longa cauda.
- Detector monocanal: É simples, de baixo custo e fornece informações limitadas para
a identificação dos analitos. Os detectores universais são monocanais.
- Detector multicanal: É complexo, tem um custo elevado, permite identificar o analito
mais facilmente e permitem flexibilizar a seletividade. Os detectores seletivos são
multicanais.
- Detectores espectrofotométrico monocanal: É o mais empregado em HPLC. Seu
princípio baseia-se na absorção de luz ultravioleta e visível, por parte da amostra,
quando nela são emitidas radiações eletromagnéticas. O fotodetector mede a luz
transmitida, e o sinal é convertido à uma relação de absorbância, que é proporcional à
concentração do analito na amostra. São detectados substâncias que contem elétrons pi
ou elétrons desemparelhados, compostos contendo Br, I, S, Carbonilas, grupos Nitro,
ions orgânicos e duplas conjugadas.
É um detector insensível às variações de vazões e de temperatura, logo, é compatível
com eluição por gradiente.
Vantagens: Boa detectabilidade, boa estabilidade (temperatura e vazão), compatibilidade
com eluição por gradiente e fácil operação.
Desvantagens: Restrito a um número limitado de substância que absorve região no UV e
não fornece informações da identidade do composto.
- Detector espectrofotométrico multicanal (rede de diodos): É um detector de arranjo
de diodos e multicanal. Ele varre todo o espectro sem a necessidade de interromper o
fluxo da fase móvel e fornece cromatogramas tridimensionais.
Vantagens: Quantificação e identificação dos compostos analisados e permite a
determinação da pureza de um pico.
Desvantagens: Custo elevado e analista capacitado.
- Detectores de fluorescência:
- Detectores índice de refração:
- Detectores eletroquímicos:
- Detectores espectrométricos de massas:
EQUILÍBRIOS DE SEPARAÇÃO USADOS EM HPLC:
- Equilíbrio de partição: É o equilíbrio entre a fase móvel e a fase estacionaria. Os
componentes da amostra podem se distribuir entre essas duas fases com base em suas
afinidades relativa pelas duas fases. Os componentes com maior afinidade pela fase
estacionária tendem a se retardar mais, resultando em uma separação.
- Equilíbrio de adsorção: É o equilíbrio entre os componentes da amostra e os sítios
ativos na fase estacionária. Os componentes da amostra podem se adsorver
reversivelmente à fase estacionária com base em suas propriedades químicas.
Componentes com maior afinidade pela fase estacionária tendem a se reter por mais
tempo na coluna, resultando em maior tempo de retenção e melhor separação.
- Equilíbrio de exclusão: É o equilíbrio que se refere à permeação diferencial de
moléculas através da fase estacionária. Em cromatografia de exclusão molecular, as
moléculas maiores penetram menos na fase estacionária, enquanto as menores penetram
mais. Isso resulta em uma separação baseada no tamanho das moléculas.
- Equilíbrio de troca iônica: É o equilíbrio em que os íons da amostra são trocados por
íons de carga oposta na fase estacionária. A separação é baseada na afinidade relativa
dos íons da amostra pelos íons da fase estacionária.
VANTAGENS HPLC:
- A fase estacionária pode ser recuperada e reutilizada
- É muito versátil pois o único pre-requisito é a solubilidade da amostra nos solventes
usados
- Análise rápida
- Boa técnica para análise qualitativa (detectores)
- Bons resultados quantitativos
- Boa detectabilidade (possibilidade de injeção de volumes maiores que em CG)
DESVANTAGENS HPLC:
- Alto custo de equipamento e manutenção
- Não existe detector universal com boa detectabilidade e baixo custo
- Experiencia do operador é necessária