Universidade de São Paulo

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto

HPLC PREPARATIVA

Letícia Fracarolli
Disciplina: Atualização em Técnicas de Análise Toxicológica:
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e Eletroforese Capilar
 SUMÁRIO
1. Introdução 7. Desenvolvimento de métodos
1.1. Principais diferenças entre HPLC 6.1. Scale-up
analítico e HPLC preparativo 6.1.1. Scale-up otimizado
6.2. Sobrecarga da coluna
2. Colunas
2.1. Fase estacionária 8. Sistema Reciclante
3. Fase móvel 9. Avaliação do resultado de
4. Detectores utilizados em HPLC uma corrida preparativa
preparativo 10. Aplicações
4.1. Splitter 11. Referências
4.1.1. Calibração do tempo de atraso
5. Coletor de frações
6. Preparação da amostra
 1. INTRODUÇÃO
Separação de
misturas por
Cromatografia
distribuição em
duas fases móveis
imiscíveis.

É um processo de
Cromatografia purificação que
líquida de alta usa a
performance cromatografia
preparativa líquida.
 1. INTRODUÇÃO

Esquema de um HPLC preparativo

 1. INTRODUÇÃO
 Parâmetros para otimizar o fator de separação e
resolução de picos:

 Fase estacionária apropriada;

 Fase móvel adequada;

 Temperatura.
1.1. PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENTRE HPLC
PREPARATIVO E HPLC ANALÍTICO

HPLC HPLC
preparativo ≠ analítico

Objetivo de isolamento Objetivo limitado a

ou purificação de determinação qualitativa
substâncias de alto valor. e quantitativa de um
composto.
1.1. PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENTRE HPLC
PREPARATIVO E HPLC ANALÍTICO

HPLC HPLC
preparativo ≠ analítico

Quantidades de amostra Quantidades de amostra

maiores (mg). menores (µg).

O objetivo de uma
purificação preparativa é a
produção máxima de
produto purificado por
injeção.
 2. COLUNAS

 O papel da coluna é fundamental no desenvolvimento de

um método;

 Capacidade do material de embalagem: visando maior

rendimento, colunas com maior capacidade podem
suportar mais material por injeção.

 O custo de colunas preparativas aumenta com o tamanho.

 2. COLUNAS
 Dimensões da coluna: de acordo com a quantidade de
material que se deseja injetar.

Diâmetro interno da coluna (mm) Utilidade

4,6 HPLC preparativo em pequena escala
7,8 HPLC semi-preparativo
>21,2 HPLC preparativo em maior escala
 2. COLUNAS

http://www.phenomenex.com/Products/Search/HPLC
 2.1. FASE ESTACIONÁRIA
 Componentes rígidos e porosos:

Mais
utilizadas:

Sílica – Sílica –
C8 C18
 2.1. FASE ESTACIONÁRIA

 Sua escolha deve ser feita de maneira a proporcionar a

melhor seletividade para os componentes de interesse.
 2.1. FASE ESTACIONÁRIA
 Tamanho de partícula:

HPLC HPLC
≠
preparativo analítico

Partículas de 1,8-3,5 µm não são

utilizadas. As partículas de 5 µm Quanto menor o tamanho
são as mais utilizadas. Para as da partícula maior será a
amostras bem resolvidas, são eficiência.
escolhidas partículas de 7-10 µm.
 3. FASE MÓVEL
 Podem ser utilizados em modo gradiente ou isocrático.

 Alguns fatores que influenciam na escolha do solvente

são os seguintes:

 Fase estacionária e condições de fase móvel com melhor

seletividade para compostos de interesse;

 Características espectroscópicas do solvente da fase móvel;

 3. FASE MÓVEL
 Volatilidade para facilitar a remoção a partir da fração
isolada;

 Viscosidade;

 Pureza;

 Boas propriedades de solubilidade para cargas máximas de

amostra;

 Custo dos solventes utilizados.

 4. DETECTORES UTILIZADOS EM HPLC
PREPARATIVO

 Detectores destrutivos: Espectrômetro de Massas,

Detector Eletroquímico.

 Detectores não destrutivos: Detectores UV VIS, DAD,

Detector de Índice de Refração, Detector de
Espalhamento de Luz, Detector de Fluorescência.
 4. DETECTORES UTILIZADOS EM HPLC
PREPARATIVO
 Detectores destrutivos: necessitam de um splitter para
desviar uma pequena parte da amostra para o detector e o
restante para o coletor de frações.
 4.1. SPLITTER
 Divisor de fluxo tradicional: divisor passivo.
 4.1. SPLITTER
 Divisor ativo: tem dois caminhos de fluxo separados e
uma válvula de troca rápida, que transfere o composto a
partir do fluxo principal para o fluxo de make-up.
 4.1. SPLITTER
Possibilidade de selecionar Proporções exatas e
diferentes proporções de constantes, divisão não é
divisão, alterando a afetada pela viscosidade,
frequência de troca da temperatura e comprimento
válvula; da tubulação;

Vantagens do
divisor ativo

Dois caminhos de fluxo

Contra-pressão mínima, não
independentes, permitem o
há o perigo de danificar a
uso de diferentes
célula detectora.
modificadores;
 4.1.1 CALIBRAÇÃO DO TEMPO DE ATRASO
 A troca da válvula tem de ser atrasada até que o
composto passe da célula detectora para a entrada da
válvula de desvio. Este tempo é chamado de tempo de
delay (tempo de atraso) (TD1) e deve ser determinada de
antemão:

Procedimento de
calibração de
atraso
 4.1.1 CALIBRAÇÃO DO TEMPO DE ATRASO
Procedimento de
calibração de
atraso

Usado para determinar o

tempo de atraso entre o
detector e o coletor de
frações.

Injetar um corante concentrado Começar com um volume de

sobre o sistema e controlar o atraso estimado ou
sinal do detector no visor on- calculado.
line do software de controle.
 5. COLETOR DE FRAÇÕES

HPLC HPLC
preparativo
≠ analítico

Amostra vai para o Amostra vai direto

coletor de frações. para o descarte.
 5. COLETOR DE FRAÇÕES
 Disponíveis em diferentes tamanhos e modelos.
Exemplos:

 Coletor de micro fração: é projetado para vazões abaixo de

100 µL / min;

 Coletor de fração em escala analítica: é projetado para vazões

abaixo de 10 mL / min;

 Coletor de fração em escala preparativa: é projetado para

vazões de até 100 mL / min.
 5. COLETOR DE FRAÇÕES
 O coletor de frações desvia o fluxo para um recipiente de
fração através da agulha de coleta de fração.
 Utilizando uma válvula de desvio que pode ser ligada, por
exemplo, através de programação de tempo, ou em função de
um sinal do detector.
 6. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
 A preparação da amostra é de especial atenção ao realizar
HPLC preparativa sobre colunas caras e, embora os
objetivos não são necessariamente os mesmos, muitos
dos procedimentos utilizados são idênticos aos
encontrados em HPLC analítica.
 Correta dissolução;
 Filtração de amostra, etc.
 7. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS

HPLC HPLC
preparativo
≠ analítico

Quantidades de amostra Quantidades de amostra

maiores (mg). menores (µg).

1. Scale-up (ampliação) do
sistema de análise;

2. Sobrecarga da coluna.
 7.1. SCALE-UP
 Scale-up do sistema de análise: colunas de diâmetro
maior, maior vazão e maior volume da amostra com o
comprimento da coluna e concentração da amostra
permanecendo constante.

Os picos permanecem
nítidos e simétricos.

Uso de colunas grandes e

volumes elevados de
solventes, portanto, o
método não seria
econômico.
 7.1. SCALE-UP
 Dois parâmetros devem ser ajustados quando se passa de uma
coluna com D.I menor para uma coluna com D.I maior:
1. Quantidade de amostra aplicada à coluna;
2. Vazão.

Considere uma ampliação de uma coluna de 4,6 × 150 mm para uma de 19 × 150
mm:
Sendo assim, podemos
dizer que pode ser aplicado
aproximadamente 17-135
mg de amostra nesta
coluna preparativa.
 7.1. SCALE-UP
Vazão:

Duração do Gradiente:
 7.1. SCALE-UP
 Carregamento (massa) razoável para colunas
preparativas de acordo com o tamanho, no modo
gradiente:
 7.2. SCALE-UP OTIMIZADO
 Otimização e scale-up de uma análise de um método preparativo é feito em
três passos:
Desenvolver e
otimizar a
separação inicial
sobre uma coluna • Como
de tamanho otimizar?
analítica

Sobrecarregar a
coluna, mantendo a
separação adequada
de componentes de
interesse

Aumentar a escala de
acordo com uma
coluna preparativa
com base na
quantidade de
composto necessária
para purificar.
 Coluna: Shim-pack PREP-
ODS(H) Kit
A) 250 mm x 4.6 mm D.I., 5 μm
B) 250 mm x 20 mm D.I., 5 μm

Fase móvel: 0.1% ácido fórmico/

metanol = 1/9 (v/v)

Vazão:
A) 0.8 mL/min
B) 15 mL/min

Temperatura ambiente

Detecção em 254 nm

Picos: 1: Ácido Benzóico

2: 2-naftol
3: Benzeno
4: Naftaleno
5: Bifenilo
6: Fenantreno
7: Antraceno
8: Fluoranteno
Shimadzu Catalogue
 7.2. SOBRECARGA DA COLUNA
 Aumento da quantidade de amostra aplicada nas mesmas
condições de análise;

 Geralmente é o método de escolha;

 Permite separar amostras na gama de mg mesmo em

colunas analíticas.

 Pode ser feito de duas maneiras:

 Sobrecarga de concentração;
 Sobrecarga de volume.
 7.2. SOBRECARGA DA COLUNA
 Sobrecarga de concentração: a concentração da
amostra é aumentada, mas o volume de amostra injetada
permanece o mesmo;
 Sobrecarga de volume: quando o composto tem baixa
solubilidade.

Ambas as técnicas de
sobrecarga são
usadas ​em
combinação.
7.2. SOBRECARGA DA COLUNA
 8. SISTEMA RECICLANTE

 A reciclagem em circuito fechado é um método de

purificação que melhora a separação;

 Reduzir os custos com colunas de grandes

comprimentos.
 8. SISTEMA RECICLANTE
 A amostra é reintroduzida na coluna repetidamente, de
modo que é possível acomodar a separação e purificação
de compostos que são normalmente difíceis de separar;

 Não há necessidade de ligar um número de colunas em

série, de modo que é possível controlar o custo das
colunas, e reduzir o consumo de solvente utilizado como
fase móvel.
8. SISTEMA RECICLANTE
9. AVALIAÇÃO DO RESULTADO DE UMA CORRIDA
PREPARATIVA:

 Três parâmetros importantes: pureza do produto, o

rendimento e produtividade;
 São dependentes uns dos outros, não sendo possível
otimizar um método de HPLC preparativa com respeito a
todos os três parâmetros.
 10. APLICAÇÕES
 Variam de escala para laboratório até escala industrial:

 Separações quirais;
 Purificação de misturas sintéticas complexas;
 Isolamento extrato natural;
 Purificação de peptídeos.
 “Estudos epidemiológicos têm mostrado que o aumento
do consumo de vegetais, como brócolis e couve, pode
reduzir o risco de desenvolvimento de câncer no
pâncreas, pulmão, colo-retal e próstata”.
Brassica oleracea var. Italica:
As cultivares de brócolis
brigadeiro foram cultivadas
até a maturidade de colheita
Foi injetado 2 mL da
amostra filtrada.
A fase aquosa foi filtrada em
um filtro de membrana de
0,22 µm, e preparada para a
injeção em HPLC.
O resíduo resultante foi
dissolvido em 120 mL
de acetonitrila 5% em
água (v /v) e lavado 3 x
com hexano para
remover o excesso de
contaminantes apolares.
Sementes foram
Foram moídas com
selecionadas devido ao
água da torneira.
alto teor de glicorafanina
Desengorduradas 3 x com
excesso de hexano e
deixadas a secar durante a
noite numa coifa.
MATERIAIS E
Os glicosinolatos foram
MÉTODOS hidrolisados por adição de água
(03:01 de água/semente
desengordurada), e a
mistura foi deixada em autólise
durante 8 h à temperatura
ambiente.
A pasta formada foi
extraída 3 x com iguais Foram misturados
volumes de cloreto de cloreto de sódio, a
metileno em excesso, a farinha molhada e
qual foi combinada e sulfato de sódio
secou-se a 32 ° C sob (1:1:0,75).
vácuo num evaporador
rotativo.
MATERIAIS E MÉTODOS
 Coluna: Waters Prep Nova-Pak (19 × 300 mm, 60 Å, 6 µm)
HR C-18 reversed-phase HPLC column (Waters, Milford,
MA);
 Vazão: 9 mL/min;
 FM: 10 % de acetonitrila em água durante 3 min; mudou
linearmente durante 2 min a 25 % de acetonitrila, e mantidas
isocráticamente durante 15 min. A porcentagem de acetonitrila
foi aumentada para 100% mais de 2 min e seguiu assim,
isocraticamente por 2 min para purgar a coluna.
 Detectores: Detector por índice de refração para detectar o
sulforafano nitrila, e a absorvância a 254 nm foi utilizada para
detectar o sulforafano.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Rendimento: para cada pico sulforafano rendeu 3,5 mg
de sulforafano purificada, e a fração de eluato
correspondente a cada pico de sulforafano nitrila rendeu
3,3 mg de sulforafano nitrila purificada. Com base nestes
resultados, cada quilograma de semente extraída pode
produzir 4,8 g de sulforafano e 3,8 g de sulforafano
nitrila.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Concluindo: “Existem vários métodos de purificação ou
de síntese. Porém, estes métodos são concebidos apenas
para a produção de quantidades de mg destes compostos,
e não se prevê a produção de larga escala necessária para
estudos extensivos in vivo. Sulforafano está
comercialmente disponível, mas é muito caro, e
Sulforafano nitrila não está comercialmente disponível
no momento. As sementes de vegetais crucíferos
possuem níveis relativamente elevados de glucosinolatos
por grama, reduzindo a quantidade de material de partida
necessário para se obter um extrato aquoso concentrado
adequado para a separação por HPLC.”
RESULTADOS E DISCUSSÃO
 “Além disso, a utilização de sementes de brócolis
brigadeiro facilitou a extração de grandes quantidades de
sulforafano e sulforafano nitrila, porque verificou-se que
contém níveis elevados de glicorafanina em comparação
com outros cultivares.”
 “Embora não testado no artigo em questão, é provável
que as sementes de outras variedades de brócolis tendo
níveis elevados glicorafanina também proporcionarão
uma boa fonte para purificação de sulforafano e
sulforafano nitrila com o mesmo método.”
 11. REFERÊNCIAS
 AGILENT TECHNOLOGIES. Principles in preparative HPLC. Agilent Technologies Inc,
Printed in Germany, April 2007.

 WELLINGS, D. A. A Practical Handbook of Preparative HPLC. Elsevier, 2006.

 KAZAKEVICH, Y.; LOBRUTTO, R. HPLC for pharmaceutical scientists. Wiley, 2007.

 MEYER, V. R. Practical High-Performance Liquid Chromatography, fourth edition. Wiley,

2004.

 SHIMADZU CATALOGUE. Prominence Preparative HPLC System.

 WATERS CATALOGUE. Preparative LC Columns and Consumables.

 MATUSHESKI, N. V.; WALLIG M. A.; JUVIK, J. A.; KLEIN, B. P.; KUSHAD, M. M.;
JEFFERY, E. H. Preparative HPLC Method for the Purification of Sulforaphane and
Sulforaphane Nitrile from Brassica oleracea. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 1867-1872.
 11. REFERÊNCIAS
 How Does High Performance Liquid Chromatography Work? Disponível em:
<http://www.waters.com/waters/pt_BR/How-Does-High-Performance-Liquid-
Chromatography-Work%3F/nav.htm?cid=10049055&locale=pt_BR> Acessado em:
10/10/2013.

 Scaling Up. Disponível em: <http://www.shimadzu.com/an/hplc/support/prep/prep3.html>

Acessado em: 10/10/2013.

 Recycling Preparative HPLC Instrument. Disponível em:

<http://www.columnex.com/chromatography/instruments/prep-hplc-recycling/> Acessado
em: 17/10/2013.

 HPLC preparativo. Disponível em:

<https://pt.vwr.com/app/Header?tmpl=/chromatography/preparative_hplc.htm> Acessado
em: 17/10/2013.

 Phenomenex Preparative Columns: Disponível em:

<http://www.phenomenex.com/Products/Search/HPLC> Acessado em 24/10/2013.