IMUNOENSAIOS E

CONTROLE DE
QUALIDADE
 IMUNOENSAIO
Teste analítico que utiliza anticorpos
Características:

• Reage com variedade extremamente grande de compostos naturais/artificiais,

biomoléculas, células e vírus.
• Excepcional especificidade que permite detectar quantidades mínimas do
analito. Ex. concentração picomolar (10-12) de hormônios no plasma
• Alta precisão e exatidão
• Permite automatização
• Testes rápidos
• Aplicações: medicina, veterinária, farmacêutica, forense, alimento
 IMUNOENSAIO
PRODUÇÃO DE AC
MONOCLONAL E POLICLONAL

PLANEJAMENTO
Necessidade x viabilidade

SISTEMA DE DETECÇÃO
Marcador x espécie biológica
VALIDAÇÃO

FORMATO HOMOGENEO E HETEROGENEO

APLICAÇÃO
Atividade modulada pelo ligante

Complexação Ac-Ag
 IMUNOENSAIO
Vantagens

i) alta sensibilidade: limites de detecção abaixo de 0,1μgL-1 para análises de

águas e de alimentos e até níveis de 1μgL-1 em outros tipos de amostras
como solos e matrizes biológicas;
ii) elevada especificidade, que torna os imunoensaios capazes de detectar,
com exatidão, um determinado contaminante, mesmo na presença de outro
que possua estreita similaridade química com este;
iii) extrema simplicidade operacional, com possibilidade de se analisar, de uma
só vez, inúmeras amostras.

Em resumo: sensibilidade, especificidade, rapidez,

simplicidade e baixo custo.
 IMUNOENSAIO
Limitações:
i)Reatividade cruzada;
ii)Moléculas com PM baixo
iii)Alteração: pH, força iônica, temperatura, tempo de reação - afetarão de
forma significativa a eficiência do ensaio.

Sistemas de Detecção:
Sistema de detecção Exemplo de marcadores
Eletroquímicos Enzimas: peroxidases, oxidases...
Radioativos Isótopos: 125
I, 14
C, 3H
*Piezoelétricos Macromoléculas (anticorpos)
Fluorimétricos Fluoresceína, quelatos de lantanídeos
Luminométricos Luminol, isoluminol, lucigenina, acridina
*sistema de detecção direta, os demais são, na maioria, indiretos
 CONTROLE DE QUALIDADE

Implantar CQ:

 reproduzir resultados exatos e fidedignos no laboratório.

•CQ: É um sistema estabelecido para assegurar que certos limites para

um resultado de teste ou de um produto sejam mantidos.

•A Emenda de Melhoria dos Laboratórios Clínicos (CLIA88) obriga certos

procedimentos de controle de qualidade.
 CONTROLE DE QUALIDADE

Obrigatório:
• Testar os materiais de controle
• Calibração dos aparelhos
• Manutenção de equipamentos e registros de consertos
• Comparação de métodos de ensaio e a preparação de reagentes
 RDC No. 302/2005 - ANVISA
CONTROLE INTERNO DA QUALIDADE

Objetivo: monitorar a precisão e exatidão de um determinado ensaio

diariamente

• Os programas de Controle Interno da Qualidade (CIQ) e Controle Externo da

Qualidade (CEQ) devem ser documentados, contemplando:

a) lista de analitos;
b) forma de controle e freqüência de utilização;
c) limites e critérios de aceitabilidade para os resultados dos controles;
d) avaliação e registro dos resultados dos controles.
CONTROLE INTERNO DA QUALIDADE (CIQ):
PRIMEIRO PASSO
Definir:
• O sistema analítico:
 Reagentes, lote, validade, registros
 Calibrador, lote, registros
 Calibração, frequência, critérios
 Equipamento.
• O controle da qualidade:
 Materiais, lote, registro
 Níveis e frequência
 Limites de aceitabilidade (Média e DP)
 Critérios de aceitabilidade (Regras Múltiplas)
 Requisitos da qualidade (CV – coeficiente de variação - e Erro Total)
 CV do Fabricante
 Variação Biológica (Imprecisão Máxima Permitida)
 RDC No. 302/2005 - ANVISA

Controle Interno da Qualidade – CIQ

• Para o CIQ, o laboratório clínico deve utilizar amostras controle comerciais,

regularizados junto a ANVISA/MS de acordo com a legislação vigente.

• Formas alternativas descritas na literatura podem ser utilizadas desde que permitam a
avaliação da precisão do sistema analítico.

• O laboratório clínico deve registrar as ações adotadas decorrentes de rejeições de

resultados de amostras controle.

• As amostras controle devem ser analisadas da mesma forma que amostras dos
pacientes.
 Amostras controle e padrões
Soros controle: amostra de preparo laboratorial que simula a composição
química e as características físico químicas das amostras testes,
sendo usada para avaliar as medidas efetuadas nas amostras testes.

 soluções com os mesmos constituintes que são analisados na amostra

do paciente.
 a maioria dos laboratórios usa controles comerciais, que são feitos de
mistura de soros.
 são analisados para uma variedade de constituintes;
 a faixa de valores esperados dos testes de cada componente é incluída
quando os controles são despachados para os laboratórios;
 deve ser apropriado para correr junto com todas as dosagens químicas
que o laboratório executa;
 devem ser analisados junto com as amostras dos pacientes;
 usando os mesmos métodos;
 condições de testes;
 reagentes iguais.
Padrão: amostra de um preparado laboratorial com composição
definida e da qual é exatamente conhecida a característica em
estudo, servido para a comparação com as amostras testes.

• Substância de valor conhecido exato

• Quando pesada ou medida com exatidão, pode produzir uma solução

com concentração exata.
• Conhecidos como material de referência

• São caros,

• Não são usados na rotina diária,

• São usados para calibrar aparelhos quando comprados,

• Recalibrados após um conserto,

• Intervalos recomendados pelo fabricante,

• Quando um método está fora de controle.

 FERRAMENTAS PARA CIQ
• Gráfico de Levey-Jennings: Produção de valores sucessivos de controle de
qualidade
• Média diária dos controles
• Análise de DP (± 2 DP) limite de controle
1.60 A
B C D
1.50
Serum C3c (g/l)

1.40

1.30

1.20

1.10
1.00
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Day of analysis

A) Dois pontos consecutivos fora do limite de 2 DP

Pontos de ação
B) Um único ponto fora do limite de 3 DP
potencialmente
C) Cinco pontos consecutivos em subida ou descida
fora do controle
D) Cinco pontos consecutivos acima ou abaixo da média
RESPOSTA DO ANALISTA EM RELAÇÃO
A CORRIDAS FORA DE CONTROLE

•O que fazer?
 Verificar erros de cálculo
 Repetir as dosagens
 Checar sistemas mecânicos e de fluxo de reagentes
 Preparar e analisar novas diluições dos controles
 Verificar amostra : turbidez e coágulos
 Checar soluções de reagentes e calibradores
 CONSISTÊNCIA INTERNA
• Avaliação da efetividade das variáveis

1) Aceitar a lacuna/exceção apesar de tudo, assistir e esperar.

Possivelmente, é o ponto fora da estatística
2) Realizar uma nova corrida em novo tubo com o material do controle de
qualidade. Alguns materiais são menos estáveis que outros –
reconstituição dos controles liofilizados
3) Recalibração e nova corrida
4) Manutenção corretiva e preventiva nos analisados e nova corrida
5) Reconstruir o ensaio com princípios iniciais, levando em consideração
todas as variáveis iniciais
 CONTROLE DE QUALIDADE EM
IMUNOENSAIOS
• A amostra-controle é frasco de soro humano liofilizado, fornecido por
“terceiros” e com valores certificados
• Esses valores certificados por “terceiros” são comprovados no início da
utilização do lote;
• Essa amostra-controle é sempre utilizada pareada com as dosagens dos
respectivos analitos, quer seja realizada por ensaios com diferentes
reatividades
• Os valores encontrados são lançados no Gráfico de Levey-Jenneings,
competindo ao responsável pelo setor técnico a verificação da conformidade
e avaliação dos resultados, para liberação;
 CONTROLE EM IMUNOENSAIOS
• Complexidade dos métodos utilizados
• Variabilidade:
a) fonte de antígenos (tecido, extrato celular, proteína purificada, proteína
recombinante)
b) detecção de anticorpos (afinidade, concentração)
c) sistema de detecção de anticorpo (policlonal, monoclonal)
d) conjugação (enzima, fluorocromo)
• Variações metodológicas:
a) tempo de incubação
b) escolha do substrato
c) volume

Todos esses fatores são levados em conta quando algo está errado!
 CONTROLE EM IMUNOENSAIOS

• Análise quantitativa: resultados obtidos servirão para fixar níveis permissíveis

“mais” ou “menos” para a precisão do ensaio
• Análise qualitativa: somente a reatividade fixada deveria ser detectada

• Critérios adicionais: especificidade da doença, tipo de ensaio usado (ELISA e Ensaio

de Imunoprecipitação) – sensibilidade tecnológica

• Materiais de controle de qualidade: controle originado da diluição do padrão

• Deterioração – erro

• Controle de terceiros

• Calibração separada

• Identificação prévia do erro

 CONCEITOS IMPORTANTES EM
IMUNOENSAIOS
Ex: Em um teste de laboratório para detecção de uma doença, com possíveis resultados as
respostas positivo e negativo, podem-se obter erros de precisão ou mesmo de interpretação
errada. Quando o resultado for positivo, o indivíduo pode ter a doença (verdadeiro positivo -
VP) ou pode não tê-la (falso positivo - FP). Da mesma forma, quando o resultado for negativo,
o indivíduo pode não ter a doença (verdadeiro negativo - VN) como pode tê-la (falso negativo -
FN).
Doença
Resultado Presente Ausente
Verdadeiro
Falso positivo
Positivo positivo
Verdadeiro
Falso negativo
Negativo negativo

Para saber quão preciso é o teste, duas medidas foram criadas: a sensibilidade e a
especificidade. A sensibilidade mede a capacidade do teste em identificar corretamente a
doença entre aqueles que a possuem, ou seja, o quão sensível é o teste. A especificidade
mede a capacidade do teste em excluir corretamente aqueles que não possuem a doença, ou
seja, o quão específico é o teste.
 A sensibilidade é a fração dos que obtiveram resposta positiva no teste entre
aqueles que possuem a doença

Sensibilidade: VP
VP+FN

A especificidade é a fração dos que obtiveram resposta negativa no teste

entre aqueles que não possuem a doença:

Especificidade: VP
VP+FN
• Sensibilidade: “habilidade” que o método tem em detectar uma amostra
verdadeiramente positiva como positivo

• Especificidade: “habilidade” que o método apresenta em detectar uma amostra

verdadeiramente negativa como negativo

• Eficiência: Porcentagem de resultados que sejam resultados verdadeiros, sejam

eles positivos ou negativos
“Cutoff”: ponto de resposta do ensaio abaixo do qual é considerado negativo e acima
do qual é considerado positivo (ou vice versa)

Teste de maconha (THC): imunoensaio de ligação

competitiva – qualitativo.
• “Gold standard”: termo não específico que indica que um processo ou materiais é
a melhor aproximação disponível da verdade – teste considerado como definitivo.
Resultado falso negativo: Resultado de ensaio negativo para uma amostra que seja
positiva para a condição ou constituinte em questão

• Resultado falso positivo: Resultado de ensaio positivo para uma amostra que seja
negativa para a condição ou constituinte em questão

• Valor preditivo negativo

Probabilidade de um individuo, com um resultado de ensaio negativo, não tenha a
patologia ou outras características, a qual o ensaio esteja desenhado para detectar

• Valor preditivo positivo

Probabilidade de um individuo, com um resultado de ensaio positivo, tenha a
patologia ou outras características, a qual o ensaio esteja desenhado para detectar
 PRECISÃO EXATIDÃO

Habilidade de obter um mesmo resultado Aproximação da concordância entre o

de um dado analito cada vez que o resultado de uma medição e um valor
material é analisado verdadeiro mensurado

SITUAÇÕES

a) exatidão b) precisão

c) pior situação d) Situação IDEAL

sem precisão e sem exatidão preciso e exato
 Fatores da imprecisão
• Deterioração de reagentes
• Instabilidade do aparelho
• Problemas operacionais
• Níveis aceitáveis da precisão
• Anticorpos anti-cardiolipina: elevado coeficiente de variação
• Resultados qualitativos: negativo, fraco, moderado ou forte positivo
Curva de ROC: É um gráfico plotado entre 2 eixos, um representando a
sensibilidade (eixo y) e o outro representando 1 – especificidade (proporção de
falsos positivos)

“Receiver Operating Characteristic”

ROC = Curva Característica de Recepção

As curvas ROC facilita o entendimento entre a relação da sensibilidade e a

especificidade de um teste diagnóstico quantitativo ao longo de valores
contínuos de ponto de corte.
 Coeficiente Kappa: É calculado a partir da concordância observada diminuída da
concordância esperada, dividido por 1 menos a concordância esperada

Kappa= P0-Pe

1-Pe

• Avaliar a concordância entre observações em uma mesma unidade amostral.

• Suposição: dois examinadores observam o mesmo número de indivíduos e ambos

avaliam cada indivíduo segundo uma escala que pode variar de 1 a r.

• O coeficiente de kappa varia de –1, quando todos os examinadores discordam em

todas as avaliações e 1, quando concordam em todas as avaliações.
Exemplos de Equipamentos

COBAS E 411

ETS® Plus System (EMIT®)

Sysmex XT 1800i e XT 2000i

Comparação dos testes sorológicos
IFI, TCR, ELISA indireto e ELISA por
competição para a detecção de
anticorpos contra o Anaplasma
marginale em soros de bovinos de
diferentes áreas enzoóticas
 IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

Ac soro positivo CONGLUTINAÇÃO RÁPIDA

Complemento

ELISA INDIRETO
(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
Tabela. Freqüência dos resultados positivos e negativos obtidos para anticorpos contra o Anaplasma
marginale, em soros de 453 bovinos distribuídos de acordo com as técnicas utilizadas.

Testes Resultado (%)

Positivo Negativo Sensibilidade Especificidade Valor Valor k

Preditivo Preditivo
Negativo Positivo

TCR 255 (56,3) 198 (43,7) 73,7% 79,3% 89,5% 57,5% 0,49(M)

IFI 314 (69,3) 139 (28,7) 90,2% 62,8% 77,7% 84,9% 0,57(M)

iELISA 266 (58,7) 191 (42,2) 90,6% 86,6% 90,6% 86,6% 0,77 (S)

cELISA 259 (57,2) 194 (42,8)

k - coeficiente de kappa (< 0,0 a 1,0); P = pobre: < 0.0; F = fraco: 0,0 - 0.20; R = razoável: 0.21 - 0.40; M =
moderado: 0.41-0.60; S = substancial: 0.61 - 0.80; QP = quase perfeito: 0.81 - 1.00.

IFI – 55 soros reagentes a mais (11,3%) que cELISA

IFI – maior sensibilidade e menor especificidade
iELISA – sensibilidade, especificidade, precisão
TCR e IFI – uso em levantamentos epidemiológicos e titulação de soros – testes
rápidos e simples.
 Alguns vídeos

http://www.youtube.com/watch?v=o0ptdqDVuW
s
http://www.youtube.com/watch?v=SPo6bUuS_8A&feature=related