IFAR

Instituto de Estudos Farmacêuticos

TOXICOLOGIA LABORATORIAL

Professor Camargo
 Tópicos que serão estudados
1. Introdução.
2. Métodos Analíticos.
3. Desenvolvimento e validação de métodos analíticos.
4. Toxicologia forense.
 Introdução
É o ramo da toxicologia que se preocupa com o estudo
das metodologias analíticas que envolvem o laboratório
de toxicologia, abordando os exames realizados, tipos de
matrizes e cadeia de custódia; com o objetivo de garantir
a confiabilidade na detecção do agente tóxico e/ou de
parâmetros a ele relacionados.

Toxicologia Analítica
Toxicologia Forense
 Métodos Analíticos
Procedimentos destinados à identificação de substâncias.

Inicialmente eram destinados a identificação de

substâncias em tecidos e fluidos biológicos com o
objetivo de forma prova legal em crimes, em especial no
caso de envenenamentos.

Atualmente possuem diversas aplicações (exames

diagnósticos, exames ocupacionais, exames ambientais,
controle de qualidade etc).
 Desenvolvimento e validação de métodos
analíticos

A preparação de um método analítico. Leva em conta a

avaliação do método e a otimização de condições
(preparo de amostras, detecção, quantificação).

Tem como premissa o emprego de equipamentos

calibrados e analistas qualificados e treinados.
 Desenvolvimento e validação de métodos
analíticos

Demonstração, por meio de estudos experimentais, que

determinado método atende às exigências de aplicação
analítica, assegurando confiabilidade e reprodutibilidade
dos resultados obtidos. É destinado a métodos não
descritos em farmacopéias ou outros formulários oficiais,
reconhecidos pela ANVISA.
 Desenvolvimento e validação de métodos
analíticos

Materiais envolvidos:

Substâncias de referência oficializadas pela farmacopéia

brasileira ou por outros códigos autorizados ou, ainda,
padrões de trabalho (substâncias com identidade e teor
devidamente comprovados).

ISO 17025
 Desenvolvimento e validação de métodos
analíticos
Validação de métodos: confiabilidade e reprodutibilidade

A fim de garantir a confiabilidade e a reprodutibilidade um método deve

compreender:

a) especificidade;
b) linearidade;
c) precisão;
d) sensibilidade (LD);
e) Limite de quantificação;
f) exatidão;
g) robustez.
 Desenvolvimento e validação de métodos
Especificidade
analíticos

Capacidade do método em diferenciar exatamente o composto na presença de

outros componentes.

- Análise qualitativa: demonstração entre compostos com estruturas

relacionadas e que podem estar presentes:
— amostras com o produto e outras estruturas semelhantes
— amostras sem o produto e com outras estruturas
semelhantes

- Análise quantitativa: demonstração por resultados obtidos de amostras

contaminadas com concentração conhecida de impurezas/excipientes/produtos de
degradação.
 Desenvolvimento e validação de métodos
analíticos
Especificidade
 Desenvolvimento e validação de métodos
analíticos
Seletividade

Capacidade do método responder a vários analitos com capacidade de

diferenciá-los entre si.
 Desenvolvimento e validação de métodos
analíticos
Linearidade

Capacidade do método em demonstrar que os resultados são diretamente

proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo
específico.

É obtida pela análise de um mínimo de 5 concentrações diferentes e por meio

de de tratamento estatístico após observação linear.

Fornece o intervalo.
 Desenvolvimento e validação de métodos
analíticos

Linearidade
 Desenvolvimento e validação de métodos
analíticos
Precisão

Proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla
de uma mesma amostra.

— Repetibilidade: concordância entre resultados dentro de um curto período de tempo,

com o mesmo analista e mesmo instrumento.
— nove determinações com três intervalos (baixa/média/alta)
— seis determinações a 100% concentração.

— Precisão intermediária: concordância entre resultados do mesmo laboratório, mas em

dias diferentes e com analistas diferentes e equipamentos diferentes. (mínimo 2 dias)

— Reprodutibilidade: concordância entre resultados obtidos em laboratórios diferentes

como estudos colaborativos (interlaboratorial)
 Desenvolvimento e validação de métodos
analíticos
Exatidão

Proximidade dos resultados obtidos em relação a um valor verdadeiro.

— Padrão de referência (CRM)

— Comparação com resultados de uma segunda metodologia bem
caracterizada, cuja exatidão tenha sido estabelecida
— Ensaios de recuperação
 Desenvolvimento e validação de métodos
analíticos
Precisão (precision) vs Exatidão (accuracy)
 Desenvolvimento e validação de métodos
analíticos
Sensibilidade

Nível de variação da resposta em função da concentração do analito.

Limite de Detecção (menor valor detectável)

Menor quantidade do analito presente na amostras que pode ser detectado,
mas não necessariamente quantificado, nas condições experimentais
estabelecidas.

— soluções de diferentes concentrações decrescentes do analiso, até o

menor nível detectável.
— não instrumental: visual.
— Instrumental: relação 3 vezes o ruído da linha base.
 Desenvolvimento e validação de métodos
analíticos
Limite de Quantificação (menor valor quantificável ou detectável com exatidão e
precisão).

Menor quantidade do analiso presente na amostras que pode ser detectado

com precisão e exatidão aceitáveis, sob condições experimentais estabelecidas.

— análise de soluções de concentrações decrescentes até o menor nível

quantificável o com relação sinal/ruído maior que 10:1
 Desenvolvimento e validação de métodos
analíticos
Robustez

Capacidade do método em resistir a pequenas e deliberadas variações dos

parâmetros analíticos.

— preparo de amostras (estabilização da solução, tempo de extração etc)

— espectrofotometria (variações de pH, temperatura, solventes)
— CLAE (variações de pH da fase móvel, componentes da fase móvel,
diferenças do lote, temperatura, fluxo)
— CG (diferenças de lote, temperatura, velocidade da fase móvel).
 Toxicologia Forense
Cadeia de custódia

É a documentação histórica cronológica da evidência

(registros)
- quem manuseou?
- quando manuseou?
- onde foi obtida (origem)?
- quem obteve?
 Toxicologia Forense
Planejamento:
Fundamental conhecer o histórico do caso a fim de se
determinar o “modus operandi” das análises,
possibilitando a escolha de metodologias mais eficientes,
bem como viabilizando a interpretação correta dos
resultados

Protocolos de análise:
Na área forense, o Perito Criminal Oficial goza de Fé
Pública
Laudo
Crédito que deve ser
Pericial
dado aos documentos
emitidos
Todavia, deve haver o mínimo de padronização Autonomia das atividades
 Toxicologia Forense
Qualidade

a) Intralaboratorial:
- ISO 17025:
-- procedimentos;
-- treinamentos, avaliações e autorizações;
-- análise de controles (+, - e branco);
-- geração de carta controle;
-- reclamações;
-- registro de dados;
-- validação de instrumentos.

b) Interlaboratorial:
- exame de proficiência.
- exame interlaboratorial.
 Toxicologia Forense
Procedimentos – escolha da metodologia

Scientific Working Group for the Analysis of Seizes Drugs

Estabelece critérios para Categoria A

análises forenses, os quais
são baseados em técnicas Categoria B
analíticas comuns à
maioria das substâncias Categoria C
analisadas
 Toxicologia Forense
Categoria A:
Infravermelho
Técnicas principais Espectroscopia de Massas
RMN
Espectroscopia Raman
Difração de Raio-X
Categoria B:
Eletroforese capilar
Técnicas secundárias Cromatografias
Microcristalização e microscopia (Cannabis)

Categoria C: Testes de cor

Fluorescência
Técnicas terciárias Imunoensaios
Ponto de fusão
UV
 Toxicologia Forense
Abordagem:

I) Uma técnica do tipo “A” + outra técnica das categorias

-

“A”, “B” ou “C”

II) Duas técnicas do tipo “B” + uma ou mais técnicas das

-

categorias “B” ou “C”

 Toxicologia Forense
Procedimentos – amostragem

Amostragem: processo de retirada de amostras

referentes a materiais (vestígios) que estarão sujeitos a
análises físico-químicas em laboratórios de toxicologia
forense.

Amostra: item de ensaio representativo do material que

será analisado.
Objetivo: assegurar a representatividade do material.
Procedimento: divisão em subgrupos (forma, cor, lote,
tipo de embalagem etc).
Técnica: Raiz de N+1 ou NBR 5426/85 - ABNT
Toxicologia Forense
 Toxicologia Forense
Procedimentos – amostragem de materiais biológicos

a)Convencionais

- cérebro (100g)
- fígado (100g)
- sangue (25g coração e 10g periférico)
- humor vítreo
- bile
- urina
- conteúdo gástrico O disponível

- conservação: ao abrigo da luz, calor e umidade; refrigerado ou

congelado; conservantes (fluoreto de sódio), anticoagulantes
(heparina), antioxidantes (ácido ascórbico).
 Toxicologia Forense
Procedimentos – amostragem de materiais biológicos

b) Não convencionais

- cabelo: maior janela de detecção e maior facilidade

para armazenamento e transporte.

Os agentes tóxicos são incorporados ao cabelo por meio do

sangue, suor, ambiente externo.

Local de coleta: parte de trás da cabeça, rente ao couro cabeludo.

 Toxicologia Forense
Procedimentos – extração

Processo que viabiliza a análise de componentes de

interesse. É a sub-fração da amostra original, enriquecida
com as substâncias de interesse analítico. É o processo
de preparação da amostra para exames químicos. Deve
levar em conta informações e características relativas à
amostra.

Obedecer protocolos de segurança e sempre

centrifugar/filtrar as soluções obtidas.
 Toxicologia Forense
Procedimentos – extração

a) Extração líquido-líquido: partição do analito em 2 fases

imiscíveis (orgânica e aquosa).

-Vantagens: simples e vários solventes possíveis.

-Desvantagens: grande volume, formação de emulsões,

gasto de tempo e toxicidade.
 Toxicologia Forense
Procedimentos – extração

a) Extração líquido-líquido:
 Toxicologia Forense
Procedimentos – extração

a) Extração líquido-líquido:

Modos:

- extração direta com solventes de várias

polaridades
- extrações ácido/base.
Toxicologia Forense
 Toxicologia Forense
Procedimentos – extração

b) SPE: cartuchos recheados com sorventes (carvão

ativo, alumina, sílica-gel, silicato-mg, silanos etc),
podendo possuir várias fases para vários grupos (mistos)
ou diferentes fases sorventes (sanduíche).

Adequado a matrizes mais complexas.

 Toxicologia Forense
Procedimentos – extração

b) SPE:
 Toxicologia Forense
Procedimentos – detecção

a) substâncias desconhecidas (pó, comprimido, líquido):

Amostragem – testes colorimétricos – extração – CG/EM e/ou
FT/IR – análises adicionais se necessário.

b) material vegetal:
Amostragem – testes colorimétricos – extração – CG/EM.

c) produtos farmacêuticos/medicamentos:
Amostragem – extração – CG/EM e/ou FT/IR e/ou CLAE/DAD –
análises adicionais se necessário.

d) resíduos em material suporte:

Obter material – testes colorimétricos – extração – CG/EM e/ou
FT/IR – análises adicionais se necessário.
 Toxicologia Forense
Procedimentos – detecção

I – Testes colorimétricos

a) Teste de Scott modificado (cloreto de cobalto + tiocianato de

potássio)

Objetivo: identificação de cocaína

Técnica:
Passo 1: amostra + tiocianato de cobalto + HCl = coloração rosa;
Passo 2: extração orgânica com clorofórmio
Resultado: fase orgânica (com cocaína) na coloração azul.
 Toxicologia Forense
Procedimentos – detecção

I – Testes colorimétricos

b) Teste de Duquenois-Levini modificado

(vanilina/etanol/acetaldeído)
Objetivo: identificação de canabinóides
Técnica:
Passo 1: amostra + solvente apolar (éter de petróleo) = extrato;
Passo 2: evaporação do extrato + reagente de Duquenois.
Passo 3: extração orgânica (clorofórmio)
Resultado: fase orgânica (com canabinóide) na coloração violeta
clara.
 Toxicologia Forense
Procedimentos – detecção

I – Testes colorimétricos

c) Teste de Fast-Blue Salt B

Objetivo: identificação de canabinóides
Técnica:
Passo 1: amostra + solvente apolar (éter de petróleo) = extrato;
Passo 2: impregnação de papel filtro com o extrato + reagente de
Fast Blue Salt B + gotas de NaOH 0,1mol/L.
Resultado: desenvolvimento de coloração avermelhada.
 Toxicologia Forense
Procedimentos – detecção
I – Testes colorimétricos
d) Teste de Marquis (ácido sulfúrico/formaldeído)
Objetivo: identificação de opiáceos e anfetaminas
Técnica:
Passo 1: amostra + reagente de marquis = extrato;
Resultado:
- opiáceos (desenvolvimento de coloração roxa)
- anfetamina e metanfetamina (desenvolvimento de coloração
laranja/marrom)
- MDMA/MDA (desenvolvimento de coloração roxa/preta)
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Procedimentos – detecção
I – Testes colorimétricos
e) Teste de Simon modificado
Objetivo: identificação de aminas primárias e secundárias
Técnica:
Passo 1: amostra + carbonato de sódio 2% + solução de
nitroprussiato de sódio/acetaldeído;
Resultado:
- metanfetaminas e aminas secundárias (desenvolvimento de
coloração violeta)
- anfetaminas e aminas primárias (desenvolvimento de coloração
rosa avermelhada)
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Procedimentos – detecção

I – Testes colorimétricos

f) Teste de Ehrlich (PDAMB/metanol)

Objetivo: identificação de LSD
Técnica:
Passo 1: amostra + reagente de Ehrlich
Resultado:
- LSD (desenvolvimento de coloração violeta)
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Procedimentos – detecção

II – Testes de cátions e ânions

a) Teste de Sódio (acetato de uranilo e magnésio)

Objetivo: identificação de íons sódio

Técnica:
Passo 1: amostra + reagente de acetato de uranilo e magnésio
Resultado:
- precipiatado amarelo
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Procedimentos – detecção

II – Testes de cátions e ânions

b) Teste de Cálcio (oxalato de amônio 2,5%)

Objetivo: identificação de íons cálcio

Técnica:
Passo 1: amostra + reagente de oxalato de amônio 2,5%
Resultado:
- precipitado branco
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Procedimentos – detecção

II – Testes de cátions e ânions

c) Teste de Cloreto (nitrato de prata 1%)

Objetivo: identificação de íons cloro

Técnica:
Passo 1: amostra + ácido nítrico 5mol/L
Passo 2: adição de solução nitrato de prata 1%
Resultado:
- precipitado branco
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Procedimentos – detecção

II – Testes de cátions e ânions

d) Teste de Sulfato (cloreto de bário 10%)

Objetivo: identificação de íons sulfato

Técnica:
Passo 1: amostra + ácido nítrico 5mol/L
Passo 2: adição de cloreto de bário 10%
Resultado:
- precipitado branco
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Procedimentos – detecção
III – Cromatografia
- método de separação de substâncias baseada na afinidade entre
os elementos presentes na amostra, que é deslocada por meio de
fase móvel, com outra fase, denominada fase estacionária.

Fase que Fase fixa por

“empurra” a Gasosa; onde a mistura Sólida;
mistura, Líquida; de substâncias Líquida;
fazendo-a Supercrítica passará e será Quimicamente
passar por toda responsável ligada
fase pelas diferentes
estacionária. taxas de
retenção.
Adsorção
Partição
Troca iônica
Exclusão
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Procedimentos – detecção

III – Cromatografia

- uma vez separada a amostra (retenção na fase estacionária) é

necessário detectá-la, de forma a se emitir algum sinal para
sistema registrador.

Universais Geram sinais para quaisquer compostos

Seletivos Geram sinais para determinadas classes de compostos

Geram sinais para compostos que possuam
Específicos determinado elemento em sua estrutura
Toxicologia Forense
 Toxicologia Forense
Procedimentos – detecção

III – Cromatografia

- CP: partição líquido/líquido. Útil para separação de compostos

polares.
- CCD: adsorção líquido/sólido. Simples, visual e econômico. Útil
para acompanhamento de reações orgânicas, purificação e
identificação de substâncias. Etapa crítica é a escolha da fase
móvel. Revelação por meio de técnicas específicas destrutivas
(corantes) ou não destrutivas (fluorescência)
- CL: partição líquido/líquido. Útil no isolamento de produtos
naturais e purificação de produtos originários de reações químicas.
Etapa crítica é o empacotamento da coluna.
 Toxicologia Forense
Procedimentos – detecção

III – Cromatografia

- CG: partição líquido/gás. A fase estacionária (líquida) consiste de

filme aplicado diretamente às paredes da coluna. Alto poder de
resolução (detecção de picogramas) todavia a amostra deve ser
volátil e estável termicamente. Emprega colunas maiores em
comprimento e menores em diâmetro. Os gases de arraste devem
ser puros e inertes em relação a fase estacionária (ex: hidrogênio,
hélio e nitrogênio). Alguns detectores empregados são ionização
em chama e condutividade térmica.
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Procedimentos – detecção

III – Cromatografia

- CLAE: emprego de suporte com partículas diminutas que são

responsáveis pela eficiência do método, porém requerem o
emprego de bombas de alta pressão para eluição da amostra. A
fase móvel deve possuir alta pureza e ser livre de oxigênio e outros
gases. Emprega detectores de UV, fluorescência. Índice de
refração etc. Pode ser normal (fase estacionária mais polar),
reversa (fase estacionária menos polar) ou quimicamente ligada
(para compostos quirais). Útil para compostos naturais, vitaminas,
hormônios etc.
 Toxicologia Forense
Procedimentos – detecção

III – Cromatografia

- CI: relativamente nova. Emprega conceitos de troca iônica (troca

de íons de mesmo sinal entre solução e corpo sólido insolúvel por
meio de um trocador de íons, normalmente resina). A resina deve
ser hidrofílica, permitir a difusão de íons por sua estrutura e conter
número suficiente de trocadores de íons, além de ser quimicamente
estável. Emprega detector de condutividade (baseia-se da
condutância elétrica) referente à propriedade dos íons em solução.
Desta forma o íon é retido em sítios ativos da coluna e
posteriormente é regenerado permitindo sua detecção
separadamente. Útil para detecção de espécies iônicas orgânicas e
 Toxicologia Forense
Procedimentos – detecção

III – Cromatografia
 Toxicologia Forense
Procedimentos – detecção
III – Cromatografia
 Toxicologia Forense
Procedimentos – detecção

III – MASSA
- Técnica destrutiva e bastante sensível. Consiste na fragmentação
dos componentes da amostra (impacto de elétrons – feixe de
elétrons a 70eV em moléculas gaseificadas - ionização térmica,
plasma com ablação a laser etc) produzindo íons que atravessam
campo magnético em diferentes trajetórias, relacionadas às suas
massas.
- Métodos de separação:
-- Deflexão em campo magnético
-- Quadrupolo

- Aplicabilidade para doping, controle ambiental, medicamentos,

drogas etc.
 Toxicologia Forense
Procedimentos – detecção

III – FTIR

Objetivo: identificação de substâncias orgânicas e

inorgânicas puras, mediante interpretação de dados
referentes aos níveis de absorção na região do
infravermelho.
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Procedimentos – detecção

III – FTIR

Princípio da técnica: método baseado na capacidade das

moléculas em absorverem energia de acordo com suas estruturas
por meio de excitação eletrônica que promove vibrações
rotacionais das ligações covalentes das moléculas
(“comportamento de mola”).

Emprega luz na região do IV (800 a 105nm), com medições entre

4000 e 400cm-1, cujas medições são repetidas várias vezes
(“scan”) a fim de se formas um gráfico.
 Toxicologia Forense
Procedimentos – detecção

III – FTIR
 Toxicologia Forense
Procedimentos – detecção

III – FTIR
 Toxicologia Forense
Procedimentos – detecção

III – FTIR
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Procedimentos – detecção

III – FTIR
Obrigado