Workshop Anvisa Validação Analítica

Workshop de Validao de Metodologia
Analtica
Ministrante: Professora Antonia Maria Cavalcanti de Oliveira

Dezembro - 2012
Objetivos da Palestra
Apresentar a teoria de validao de mtodos luz da Anvisa,
traando paralelo com outras normas nacionais e
internacionais;
Estimular anlise crtica a respeito do tema;
Mostrar a importncia da leitura de artigos cientficos, pois
nenhum tema esgotado por si s em regulamentos
tcnicos;
Na legislao encontramos o que deve ser feito e no o
como fazer;
Refletir a respeito da construo do conhecimento em nossa
prtica diria e a contribuio desta para o regulatrio.
Introduo Validao
Validao
Definio:
Validao um ato documentado que atesta que qualquer
procedimento, processo, equipamento, material, atividade
ou sistema realmente e consistentemente leva aos
resultados esperados. (RDC n 17/2010)
Validao
Os estudos de validao so parte essencial das BPF e
devem ser conduzidos de acordo com Protocolos prdefinidos e aprovados. Relatrio (...) contendo os
resultados e concluses devem ser preparados e
arquivados. (RDC n 17/2010)
Plano Mestre de Validao

Planejamento de todas as atividades de validao com os
objetivos, procedimentos, prazos e responsabilidades
definidos.
Deve conter no mnimo: RDC n 17/2010
I - uma poltica de validao;
II - estrutura organizacional das atividades de validao;
III - sumrio (situao atual e programao);
IV - modelos de documentos ou referncia a eles;
V - planejamento e cronograma;
VI - controle de mudanas; e
VII - referncias a outros documentos existentes.
Protocolo de Validao
um plano escrito que descreve como a validao ser conduzida,
definindo os critrios de aceitao.
Inclui:
Lista de equipamentos
Parmetros de teste
Desenho experimental
Dados que devem ser coletados e medidos

Documentos inerentes
Pontos de deciso e responsabilidades
Relatrio de Validao
um resumo ou sumrio do processo de

validao, contendo todos os dados e resultados
obtidos. Deve concluir se os critrios de aceitao
foram atingidos e relatar as no conformidades.
Validao da Metodologia
Analtica
Validao de Metodologia Analtica

Definio:
o processo pelo qual se estabelece, atravs de
estudos laboratoriais, que as caractersticas de
performance do mtodo, tambm denominadas
parmetros de validao, apresentam os requisitos
necessrios para aplicao analtica pretendida.
(USP 36).
Objetivo:
A validao dos procedimentos analticos tem por
objetivo demonstrar que os mtodos de ensaio
utilizados apresentam resultados que permitem avaliar
objetivamente a qualidade dos medicamentos, conforme
os parmetros especificados.

A Anvisa ressalta a importncia da qualidade analtica
dos resultados como um dos instrumentos
fundamentais para a proteo e promoo da sade
da populao. (Guia para qualidade em qumica
analtica)

Uma das ferramenta que garante a qualidade analtica dos
resultados. Permite:
Verificar adequao ao uso;

Identificar fontes potenciais de erros;
Conhecer as variveis crticas;
Apresentar prova de que o mtodo pode ser usado
para tomada de deciso;
Satisfazer especificaes / requisitos legais;
EURACHEM, 1998
Definies
Mtodo Normalizado:
aquele desenvolvido por um organismo de
normalizao ou outras organizaes, cujos mtodos
so aceitos pelo setor tcnico em questo. (INMETRO DOQ-CGRE-008/2011)
Esto aqui includos os Mtodos Farmacopicos.
Definies
Mtodo No Normalizado:
aquele desenvolvido pelo prprio laboratrio ou outras
partes (por exemplo: pelo laboratrio produtor do
medicamento), ou adaptados a partir de mtodos
normalizados e validados. (INMETRO - DOQ-CGRE008/2011)
Quando Efetuar a Validao do Mtodo?

Segundo INMETRO (DOQ-CGRE-008/2011).
Mtodo no normalizado
Mtodo criado/desenvolvido pelo prprio laboratrio
Mtodo normalizado usado fora do escopo indicado
Ampliaes / Modificaes dos mtodos normalizados
Quando Efetuar a Validao do Mtodo?
Segundo a Anvisa (RE 899/2003).

No caso de metodologia analtica no descrita em
farmacopias ou formulrios oficiais, devidamente
reconhecido pela Anvisa, dever ser validada.
Quando Efetuar a Revalidao do Mtodo?

Segundo a RE 899/2003.
A metodologia analtica dever ser revalidada:
Mudanas na sntese da substncia ativa;
Mudanas na composio do produto acabado;

Mudanas no procedimento analtico.
Determinadas outras mudanas podem requerer validao.
Modificao x Ajuste
Reviso: Pharmacopeial Forum 31(3), pag. 834 835 .
pH da fase mvel (CLAE) + 0,2 unidades,
Concentrao de sais no tampo (CLAE) + 10% (absoluto),

Relao de componentes da fase mvel (CLAE) + 30% (relativo),
Nenhum componente pode ser reduzido a zero (CLAE) ,
Comprimento de onda (CLAE) + 3 nm,
Comprimento da coluna (CLAE, CG) + 70%,

Dimetro interno da coluna (CLAE) + 50%, (CG) + 25%,
Velocidade de fluxo + 50%,
Os Mtodos Normalizados Devem Ser Validados?
No caso de metodologias analtica descrita em

farmacopias ou formulrios oficiais, devidamente
reconhecidos pela ANVISA, a metodologia ser
considerada validada. (RE 899/2003)
O laboratrio deve confirmar que tem competncia para

aplicar o mtodo de modo apropriado e que atinge o
pretendido e que opera bem sob as condies normais de
uso.(DOQ-CGCRE-008-INMETRO/2011)
Para usar metodologia analtica descrita na USP-NF

necessrio verificar sua adequao nas
condies atuais de uso.
Estratgia para Validao de Mtodos Normalizados

Definir escopo da aplicao
N
O mtodo atende ?
S
Verificar competncia do
laboratrio
Documentar resultados
Validao
completa
O que Verificao?
Definio:
Evidncia documentada que um mtodo previamente

validado desempenha como pretendido, no ambiente em
que est sendo aplicado.
Verificao da competncia analtica.

Segundo a RDC N. 31, DE 11 DE AGOSTO DE 2010
Validao parcial para mtodo de teor.
Especificidade, linearidade, exatido,

(repetibiliddae e intermediria) e intervalo.
preciso
Segundo o FDA.
Verificar a especificidade, a estabilidade da soluo da
amostra e a preciso intermediria.
Estratgia para Validao de Mtodos No

Normalizados
Validao
Otimizao
Desenvolvimento
Desenvolvimento/Otimizao
Resultado obtido com colunas cromatogrficas diferentes.
Coluna
cromatogrfica
C18
1,63
8,93
1969
C8
1,27
9,76
5175
T=Fator de cauda ou assimetria; k= Fator de capacidade; N - Nmero de pratos tericos.
Resultados referentes variao proporo da fase mvel.
Proporo da fase mvel
Rt
75:25
2,93
1,51
4,87
3320
80:20
3,79
1,39
6,58
4055
85:15
5,32
1,27
9,65
5249
Rt = tempo de reteno; T=Fator de cauda ou assimetria; k= Fator de capacidade; N - Nmero de pratos

tericos.
Resultados referentes variao de pH da fase mvel (85:15).
pH
Rt
5,0
5,44
1,29
9,88
5208
6,0
5,45
1,28
9,89
5252
6,5
5,38
1,28
9,77
5165
Rt = tempo de reteno; T=Fator de cauda ou assimetria; k= Fator de capacidade; N - Nmero de pratos

tericos.

Segundo a RE 899.
No caso de metodologia analtica no descrita em farmacopias ou
formulrios oficiais.
Especificidade e Seletividade
Linearidade
Intervalo
Exatido
Repetibilidade
Preciso
Preciso intermediria
Reprodutibilidade
LQ e LD
Robustez
De acordo com
a
classificao
do teste segundo
sua finalidade.
Classificao dos testes segundo sua finalidade

Categoria
Finalidade do teste
Testes quantitativos para determinao do

princpio ativo em produtos farmacuticos ou
matrias-primas.
II
Testes quantitativos ou ensaio limite para

determinao de impurezas e produtos de
degradao em produtos farmacuticos ou
matrias-primas.
III
Testes de performance (por exemplo: dissoluo,

liberao do ativo)
IV
Testes de identificao.
Planejamento (passos) da Validao.

Definir o objetivo do mtodo;
Definir os parmetros de desempenho e critrios de aceitao;
Desenvolver o PROTOCOLO DE VALIDAO;
Definir os experimentos de validao conhecer bem o mtodo
antes de iniciar a validao;
Executar os experimentos preliminares (definio dos testes de
conformidades do sistema);
Ajustar os parmetros do mtodo se necessrio;

Realizar os experimentos completos de validao - Executar o
protocolo de validao;
Desenvolva POP para a execuo do mtodo, na rotina;
Prepare o RELATRIO DE VALIDAO.
Ensaios necessrios para a validao do mtodo.

Parmetro
Categoria I
Categoria II
Quantitativo
Categoria III
Categoria IV
Ensaio limite
Especificidade
SIM
SIM
SIM
SIM
Linearidade
SIM
SIM
NO
NO
Intervalo
SIM
SIM
NO
Repe
Preciso Inter
SIM
**
SIM
**
NO
NO
SIM
**
NO
NO
LD
NO
NO
SIM
NO
LQ
NO
SIM
NO
NO
Exatido
SIM
SIM
NO
SIM
SIM
SIM
NO
NO
Robustez
* pode ser necessrio, dependendo da natureza do teste especfico.

** se houver comprovao da reprodutibilidade no necessria.
Teste de Adequao do Sistema

Parmetros e recomendaes para o teste de verificao da
adequao do sistema (SHABIR, 2003)
Parmetros
Recomendaes
Fator de capacidade (k')
O pico deve estar bem resolvido de outros

picos e do volume morto k' 2,0.
Repetitividade
desejvel um DPR 1% para N 5
Tempo de reteno relativo
No essencial se a resoluo declarada
Resoluo (R)
R 2 entre o pico de interesse e o potencial

interferente que elui mais prximo
Fator de cauda (T)
T2
Nmero de pratos tericos (N)
Em geral deve ser 2000
Definio dos Parmetros de

Validao
Definio dos Parmetros de Validao

Especificidade
a capacidade que o mtodo possui de medir exatamente
um composto em presena de outros componentes tais como
impurezas, produtos de degradao e componentes da matriz.
Para anlise qualitativa (teste de identificao) necessrio
demonstrar a capacidade de discriminao do mtodo.
Para anlise quantitativa (teor) e anlise de impurezas
comparao dos resultados obtidos de amostras contaminadas
(impurezas ou excipientes) com amostras no contaminadas
demonstrar que o resultado do teste no afetado.

Especificidade
Impureza ou
produto de
degradao no
disponveis
Utilizar amostras
armazenadas sob
condies de estresse
(Ex: luz, calor umidade,
hidrlise cida/bsica,
oxidao).
Em mtodos cromatogrficos, deve-se tomar as precaues

necessrias para garantir a pureza dos picos cromatogrficos.
Detector de arranjo de fotodiodos ou espectrometria de massas.
Plano Experimental
Especificidade
Anlise Qualitativa Identificao
Preparar um placebo (matriz),
Contaminar o placebo com o material de referncia,
Comprovar o resultado positivo para o placebo contaminado com
o material de referncia e o resultado negativo para a matriz
em branco.
Exemplo de um estudo de Especificidade.

Cromatograma do Padro 100%.
3
5
0
3
0
0
2
0
0
N
HO
1
5
0
1
0
0
4.39
2.94
3.10
5
0
2.41
Intensity(mV)
5.28,Didanosina
2
5
0
0
0
R
e
t
e
n
t
i
o
nT
i
m
e(
m
i
n
)
NH
N

Cromatograma do Placebo.
4
0
0
3
5
0
3
0
0
2
5
0
1
5
0
1
0
0
5
0
3.29
Intensity(mV)
2
0
0
0
0
R
e
t
e
n
t
i
o
nT
i
m
e(
m
i
n
)

Cromatograma do Placebo contaminado.
3
5
0
3
0
0
5.29,Didanosina
O
2
5
0
2
0
0
1
0
0
4.39
2.94
3.10
3.33
5
0
2.41
Intensity(mV)
HO
1
5
0
0
0
R
e
t
e
n
t
i
o
nT
i
m
e(
m
i
n
)
NH
N
Plano Experimental
Especificidade
Impurezas e produtos de degradao no disponveis, submeter
amostras a condies de estresse: exposio a temperatura,
exposio a luz, hidrlise cida (HCl 0,1N), hidrlise alcalina
(NaOH 0,1N) e Oxidao (H2O2 3%). Comparar os resultados obtidos
com as amostras degradadas e no degradadas.
Resoluo entre picos adjacentes, do componente principal e outros

componentes (Rs) > 2.

Cromatograma obtido aps exposio temperatura de 1000 C
300
5.48,Didanosina
250
200
100
50
4.83
3.03
3.18
2.48
Intensity(mV)
150
0
0
RetentionTime(min)
2.49
Cromatograma obtido aps exposio soluo de cido clordrico 0,1N.

4
0
0
3
0
0
Intensity(mV)
2
0
0
3.26
1
0
0
0
0
R
e
t
e
n
t
i
o
nT
i
m
e(
m
i
n
)

Cromatograma obtido aps exposio soluo de perxido de
hidrognio 3 %
1.62
400
2.51
350
300
250
150
5.66,Didanosina
4.59
3.96
2.30
50
3.26
100
0.24
Intensity(mV)
200
0
0
Ret
enti
onT
ime(min
)

Cromatograma aps injeo da soluo de hipoxantina
8
0
7
0
2.54,Hipoxantina
6
0
5
0
Intensity(mV)
4
0
3
0
2
0
1
0
0
0
R
e
t
e
n
t
i
o
nT
i
m
e(
m
i
n
)

Cromatograma obtido aps injeo da soluo de Didanosina
contaminada com hipoxantina, R= 13,51
350
300
5.79,Didanosina
250
2.51,Hipoxantina
150
100
50
3.34
Intensity(mV)
200
0
0
RetentionTime(min)

Linearidade
a capacidade de uma metodologia analtica demonstrar
que os resultados obtidos so diretamente proporcionais
concentrao do analito na amostra, dentro de um intervalo
especificado.
Recomenda-se que a linearidade seja determinada pela anlise
de, no mnimo, 5 concentraes diferentes.
Estas concentraes devem seguir os intervalos da tabela a

seguir:
Limites percentuais do teor do analito que devem estar contidos no

intervalo de linearidade para alguns mtodos analticos.
Ensaio
Alcance
Determinao quantitativa do analito em De 80% a 120% da concentrao terica

matrias-primas ou em formas farmacuticas
do teste.
Determinao de impurezas
Do nvel de impureza esperado at 120%

do limite mximo especificado. Quando
apresentarem importncia toxicolgica ou
efeitos farmacolgicos inesperados, os
limites de quantificao e deteco devem
ser adequados s quantidades de
impurezas a serem controladas.
Uniformidade de contedo
De 70% a 130% da concentrao terica

do teste.
Ensaio de dissoluo
De 20% sobre o valor especificado para

o intervalo. Caso a especificao para a
dissoluo envolva mais de um tempo, o
alcance do mtodo deve incluir 20%
sobre o menor valor e +20% sobre o maior
valor.
Plano Experimental
Linearidade
Preparar uma soluo me da substncia qumica de

referncia e a partir desta, diluies a fim de obtermos
solues em cinco nveis de concentrao. Por exemplo:
50 %, 75 %, 100 %, 125 % e 150 %, do valor rotulado.
Clculos Estatsticos
Linearidade
Calcular a Mdia, Varincia o DP e o DPR . Prosseguir com
os seguintes clculos.
Elaborar Curva de Calibrao
Calcular coeficiente angular (b)
Calcular coeficiente linear (a)
Clculo do coeficiente de correlao linear (r)

Clculo do erro padro da estimativa (desvio padro residual), (Se )
Clculo da soma dos quadrados dos resduos (SSE)
Clculos Estatsticos
Determinao de Valores Aberrantes.
Um resultado analtico afetado por erro grosseiro difere, quase
sempre de modo visvel, dos demais resultados do conjunto das
determinaes executadas (replicatas) em paralelo na mesma amostra.
Tais resultados so denominados aberrantes, comprometendo a
preciso e a exatido do resultado final.
Portanto o tratamento estatstico dos dados inicia-se pela deteco
de valores aberrantes, que pode ser realizado atravs do teste de
Grubbs.
Este teste estatstico pode ser aplicado quando se deseja verificar se
o menor valor ou o maior valor aberrante, denominado teste de
Grubbs para um valor aberrante, onde n 3.
Clculos Estatsticos
Teste de Grubbs.
Onde :
xi x
s
x i = valor suspeito de ser aberrante.
x = mdia dos valores obtidos.

s = desvio padro dos valores obtidos.
Em funo do nmero de replicatas (n) e um nvel de significncia .

Se G calculado > G tabelado ----- valor suspeito considerado
aberrante, e ento descartado.
Se G calculado < G tabelado ------- valor suspeito no considerado
aberrante.
Clculos Estatsticos
Estudo de caso.
Determinao de valor aberrante. Teste de Grubbs
Padro 50 %
Padro 75 %
Padro 100 %
Padro 125 %
Padro 150 %
Replicata 1
49,94
75,10
100,18
124,35
148,43
Replicata 2
49,88
75,00
100,07
124,31
148,44
Replicata 3
49,99
75,14
99,78
124,15
148,25
Replicata 4
49,96
73,23
99,95
124,04
148,26
Replicata 5
49,99
75,00
99,93
124,43
148,23
Replicata 6
49,99
75,09
100,10
124,30
148,19
xi x
= 74,76
73 , 23 74 , 76
2 , 04
Gcalc > Gtab
0 , 75
= 0,75
Gtab = 1,89
Aberrante, portanto, descartado.
Clculos Estatsticos
Desvio padro (s ou DP).
Desvio padro igual a raiz quadrada positiva da varincia. Deve
ser expresso com dois algarismos significativos.
s
n 1
Varincia (s2 ou V).

A varincia calculada dividindo o somatrio dos quadrados dos
desvios de cada valor em relao mdia, pelo nmero de graus de
liberdade (n-1).
s
2
n 1
Clculos Estatsticos
Homocedasticidade
Verificar a homocedasticidade, ou seja, a independncia da varincia
das respostas do mtodo com as concentraes das amostras
analisadas (homogeneidade da varincia dos resduos) pelo teste de
Cochran, aplicando a frmula que se segue.
2
C cal
2
s maior
s maior
Onde:
= maior varincia
= somatrio das varincias
Clculos Estatsticos
Homocedasticidade:
Se C calculado < C tabelado Homocedasticidade
Se C calculado > C tabelado Heterocedasticidade
Se o critrio de homocedasticidade for aceito, a regresso linear

executada pelo mtodo dos mnimos quadrados, que estima qual a
melhor reta que passa pelos pontos obtidos experimentalmente a
partir da curva de calibrao.
Se no houver relao linear, realizar transformao matemtica
Clculos Estatsticos
Homocedasticidade
2
C cal
s maior
s maior
= 0,020
Como C calculado 0,344 menor que

C tabelado 0,506.
O critrio de homocedasticidade foi
aceito.
= 0,058
Aplicando a frmula, C calculado = 0,344.
Clculos Estatsticos
Curva de calibrao:
Realizada anlise de regresso deve-se apresentar o coeficiente de
correlao linear (r), a inclinao (coeficiente angular), o intercepto
da reta (coeficiente linear), soma residual dos quadrados mnimos
da regresso linear e desvio padro. A regresso linear
representada por uma equao do tipo:
y a bx
Onde,
analito.
y o valor da resposta para uma dada concentrao x do
Clculos Estatsticos
Clculo da soma dos quadrados dos resduos (SSE).
SSE y i y i
Onde,
SSE = soma dos quadrados dos resduos.
yi
= valor observado experimentalmente (valor medido).
y i
= valor previsto pela reta (valor projetado).
Clculos Estatsticos
Clculo da soma dos quadrados dos resduos (SSE).
O critrio da reta de regresso encontrar os coeficientes a e b,
que minimizem a soma dos quadrados dos resduos, procedimento
denominado mtodo dos quadrados mnimos.
Se os pares de valores estiverem contidos na reta ajustada a

soma dos quadrados dos resduos ser igual a zero e a explicao
da reta ajustada ser completa (reta ideal), portanto o objetivo que
a soma dos quadrados dos resduos seja mais prxima de zero
possvel.
Clculos Estatsticos
Clculo do erro padro da estimativa (Se).
se
yi
y i
n2
Onde,
s e = erro padro da estimativa (desvio padro residual)
y i = valor observado experimentalmente (valor medido)

y i = valor previsto pela reta (valor projetado)
= n -2 graus de liberdade
Clculos Estatsticos
Clculo do erro padro da estimativa (Se).
O erro padro da estimativa mede a disperso dos desvios,
denominados resduos, ao redor da reta de regresso.
O conceito do erro padro da estimativa ou desvio padro
residual, equivalente ao do desvio padro que mede a
variabilidade dos valores da amostra ao redor da mdia aritmtica
desses valores.
Atendidas as premissas de regresso linear, se espera que

aproximadamente 95 % dos valores da amostra y se encontrem no
intervalo de + 2 x se de seus respectivos valores projetados pela reta
de regresso , ou seja, que os valores dos resduos se encontrem
neste intervalo (+ 2 x se).
Clculo da Linearidade usando a Planilha Excel.
Clculos Estatsticos
Estudo de caso.
Resultado:
Erro Padro da Estimativa ou Desvio Padro Residual (Se )
Analista 1:
Estatstica de regresso
R mltiplo
0,999972427
R-Quadrado
0,999944855
R-quadrado ajustado
0,999940613
Erro padro
0,27788902
Observaes
15
Critrio de Aceitao:
Os valores dos resduos devem-se encontrar no intervalo (+ 2 x Se ).
Resultado dos resduos.
Clculos Estatsticos
Analista 1:
Identificao da am ostra: Padro Lamivudina INCQS
Concentrao
Y previsto
Resduos
50,32
-0,23
50,32
-0,30
50,32
-0,23
74,95
0,18
74,95
0,10
74,95
0,16
99,59
0,44
99,59
0,35
99,59
0,44
10
124,22
-0,22
11
124,22
-0,23
12
124,22
-0,29
13
148,85
0,06
14
148,85
-0,18
15
148,85
-0,05
Como pode ser observado na tabela o resultado dos resduos foi satisfatrio.
Encontram-se dentro do intervalo de + 2 x 0,28 = + 0,56.
Estudo dos resduos e dos valores medido e previsto para y.
Resduos
Varivel X 1 Plotagem de resduos

0,50
0,00
-0,50
200
400
600
800
Varivel X 1
PLOTAGEM DE AJUSTE DE
LINHA.
200
Y
0
0
200
400
Varivel X 1
600
800
Y previsto

Exatido.
A exatido de um mtodo analtico a proximidade dos
resultados obtidos pelo mtodo em estudo em relao ao valor
verdadeiro.
Para o Frmaco:
Aplica-se a metodologia analtica proposta, na anlise de uma
substncia de pureza conhecida (padro de referncia).
Ou compara-se os resultados obtidos com aqueles resultantes
de uma segunda metodologia bem caracterizada, cuja
exatido tenha sido estabelecida.

Exatido.
Para o Produto (Forma Farmacutica).
Analisa-se uma amostra, na qual foi adicionada uma
quantidade conhecida do frmaco a uma mistura dos
componentes do medicamento (placebo contaminado).
No caso de todos os componentes do medicamento no estarem
disponveis, aceita-se a anlise pelo mtodo de adio de padro,
no qual adiciona-se quantidades conhecidas do analito (padro de
referncia) ao medicamento.

Exatido.
Para Impurezas.
Utiliza-se o mtodo de adio de padro, no qual adiciona-se
quantidades conhecidas de impurezas e/ou produtos de degradao
ao medicamento ou ao frmaco.
No caso da indisponibilidade de amostras de certas impurezas
e/ou produtos de degradao, aceita-se a comparao dos
resultados obtidos com um segundo mtodo bem caracterizado
(metodologia farmacopica ou outro procedimento analtico
validado).

Exatido.
A exatido do mtodo deve ser determinada aps o
estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da
especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de:
no mnimo, 9 (nove) determinaes contemplando o

intervalo linear do procedimento, ou seja, 3 (trs)
concentraes, baixa, mdia e alta, com 3 (trs) rplicas
cada.
A exatido expressa pela relao entre a concentrao mdia
determinada experimentalmente e a concentrao terica
correspondente, acrescida do intervalo de confiana.
Plano Experimental
Exatido.
Preparar uma soluo me concentrada e efetuar as diluies na
matriz a fim de obter trs concentraes diferentes. Partir da soluo
me tambm para a calibrao, para evitar erros de pesagem.
Efetuar nove determinaes, em trs concentraes diferentes,
com trs rplicas cada, por exemplo: 75%, 100% e 125% do valor
rotulado, em triplicata de injeo.
Realizar as anlises no mesmo dia usando o mesmo analista.
Clculos Estatsticos
Exatido.
geralmente expressa como porcentagem de recuperao (R%) da
substncia de interesse, calculada segundo a frmula, acrescida
dos intervalos de confiana.
R %
x 100
x
Onde,
R % = porcentagem de recuperao.
x = mdia dos resultados (valor determinado experimentalmente).

x = concentrao terica correspondente (valor esperado).
Clculos Estatsticos
Exatido.
Quando no h possibilidade de preparar matriz limpa da amostra,
adiciona-se quantidades conhecidas do analito (padro de
referncia) ao medicamento, para determinar a Exatido, que
calculada segundo a frmula.
R %
100 x ca x sa
xa
Onde,
R % = porcentagem de recuperao
x ca = conc. medida na amostra com adio do analito ou padro

x sa = conc. medida na amostra sem adio do analito ou padro
x a = concentrao adicionada
Clculos Estatsticos
Exatido.
Calcular a Mdia,
Calcular o Desvio padro (DP),
Calcular o Desvio padro relativo (DPR),
Calcular o percentual de Recuperao,
Calcular o Intervalo de confiana.
Critrios de Aceitao - Exatido
Para ensaios de teor (maior componente) a recuperao mdia
deve ser de 100% + 2% para cada concentrao na faixa de 80 a
120% da concentrao alvo ou de estudo.
Clculos Estatsticos
Intervalo de confiana (IC).
o intervalo dentro do qual o valor verdadeiro se encontra.
ts
Portanto:
= valor verdadeiro
x = mdia dos valores obtidos
IC
ts
n
Onde,
s = desvio padro
n = tamanho da amostra (nmero de replicatas)
t = valor tabelado, em funo de:

n0 de graus de liberdade, = n 1
nvel de significncia ().
Clculos Estatsticos
Exatido.
Analista 1:
Identificao das amostras: Placebo contaminado - Lamivudina comprimido revestido
Concentrao da
amostra
75%
100%
125%
Replicata A1
98,02
99,34
99,26
Replicata A2
98,31
99,48
99,18
Replicata A3
98,35
99,51
99,14
Replicata B1
100,71
98,32
99,44
Replicata B2
100,51
98,40
99,36
Replicata B3
100,56
98,39
99,42
Replicata C1
98,63
99,12
99,36
Replicata C2
98,68
99,38
99,38
Replicata C3
99,18
99,21
99,46
Mdia
99,22
99,02
99,33
DP
1,08
0,50
0,11
DPR
1,09
0,51
0,12
% Recuperao
99,22
99,02
99,33
IC
+0,83
+0,38
+0,08
Clculos Estatsticos
Exatido.
Nvel de 75%.
IC
ts
n
IC
2 ,306 1, 08
% R = 99,22 + 0,83%
0 ,83
ttab = 2,306.
= n 1 = 8
Nvel de 100%.
IC
2 ,306 0 ,50
% R = 99,02 + 0,38 %
0 ,38
Nvel de 125%.
IC
2 ,306 0 ,11
9
0 , 08
% R = 99,33 + 0,08 %
Critrios de Aceitao - Exatido

Critrio De Aceitao : AOAC, 2000
Concentrao
100 %
Concentrao
Fracional
1,0
Recuperao mdia
%
98 102
10 %
0,1
98 102
1%
0,01
97 103
0,1 %
0,001
95 105
0,01 %
0,000 1
90 107
1 ppm
0,000 001
80 110
10 ppb
0,000 000 01
60 115

Preciso.
A preciso a avaliao da proximidade dos resultados
obtidos em uma srie de medidas de uma amostragem mltipla
de uma mesma amostra. Esta considerada em trs nveis.
Repetibilidade (preciso intra-corrida): concordncia entre os

resultados dentro de um curto perodo de tempo com o mesmo
analista e mesma instrumentao.
Preciso intermediria (preciso inter-corridas): concordncia
entre os resultados do mesmo laboratrio, mas obtidos em dias
diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes.

Preciso.
Reprodutibilidade (preciso inter-laboratorial): concordncia
entre os resultados obtidos em laboratrios diferentes como em
estudos colaborativos, geralmente aplicados padronizao de
metodologia analtica, por exemplo, para incluso de metodologia
em farmacopias.
Estes dados no precisam
concesso de registro.
ser apresentados para a

Preciso.
A repetibilidade do mtodo verificada por, no mnimo, 9
(nove) determinaes, contemplando o intervalo linear do
mtodo, ou seja, 3 (trs) concentraes, baixa, mdia e alta,
com 3 (trs) rplicas cada ou mnimo de 6 determinaes a
100% da concentrao do teste.
Para a determinao da preciso intermediria recomenda-se um
mnimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes.
Plano Experimental
Preciso.
Verificar a preciso nos nveis repetibilidade e preciso
intermediria. Efetuar seis determinaes, a 100% do valor
rotulado, atravs da analise de trs amostras diferentes.
No nvel repetibilidade realizar as seis anlises, de cada uma
das amostras, no mesmo dia e com o mesmo analista.
Para o parmetro preciso intermediria, com as mesmas
amostras descritas acima, executar trs tipos de comparao:
Repetir as anlises, usando um analista diferente.
Repetir as analises, utilizando um equipamento diferente.
Clculos Estatsticos
Preciso.
Repetibilidade
Calcular a Mdia,
Calcular o DP,
Calcular o DPR.
Preciso Intermediria Teste de F

Calcular as varincias (s2),
Calcular o valor de F para cada uma das comparaes utilizadas
para avaliao da preciso intermediria.
Clculos Estatsticos
Preciso.
Repetibilidade
Calcular a Mdia,
Calcular o DP,
Calcular o DPR.
Amostra
Laboratrio A Laboratrio B Laboratrio C
A1
101,84
100,16
96,97
A2
102,61
100,52
97,32
B1
101,54
98,05
96,55
B2
101,71
98,26
96,78
C1
100,58
99,27
98,27
C2
100,57
99,31
98,46
D1
101,85
98,56
96,41
D2
101,74
98,72
95,80
E1
101,18
98,52
96,35
E2
101,19
98,78
96,15
F1
100,54
99,00
96,83
Mdia
101,33
99,02
96,89
DP
0,67
0,73
0,79
DPR
0,66
0,74
0,82
Clculos Estatsticos
Preciso.
Repetibilidade
Critrio de Aceitao segundo a RE 899/2003:
O valor mximo aceitvel deve ser definido de acordo com a
metodologia empregada, a concentrao do analito na amostra, do
tipo de matriz e a finalidade do mtodo, no se admitindo valores
superiores a 5% (RE 899).
Critrios de Aceitao - Preciso

Frmula emprica de Horwitz
Analito %
100
10
1
0,1
0,01
0,001
0,0001
0,00001
0,000001
0,0000001
RSD r 2(1 - 0,5 log c). 0,67

Horwitz
2
2,8
4
5,6
8
11
16
23
32
45
Calculado DPR r %
1,3
1,9
2,7
3,7
5,3
7,3
11
15
21
30
c concentrao fracional: representa a concentrao percentual

dividida por cem.
Clculos Estatsticos
Preciso Intermediria Teste de F

Calcular as varincias (s2),
Calcular o valor de F para cada uma das comparaes
utilizadas para avaliao da preciso intermediria.
Clculos Estatsticos
Comparao de varincias (s2): Teste de F.
Para comparao de varincias pelo Teste-F, partimos da
hiptese nula de que no h diferena significativa entre as
varincias comparadas, ou seja:
2
1
H0 : s
2
2
H1 :
s s
2
1
2
2
O teste de hiptese aqui realizado, ou seja para comparao

de varincias, um teste em duas caudas, portanto a tabela de F
utilizada a bicaudal.
Clculos Estatsticos
2
Fcalc
s1
s
2
2
s s
2
1
2
2
O Ftab encontrado na tabela de F, para:

o (nvel de significncia) definido;
para os graus liberdade (para o numerador)
1 n1 1
e para os graus liberdade (para o denominador) 2 n 2 1
Clculos Estatsticos
2
Fcalc
s1
s
2
2
s s
2
1
2
2
Para que a hiptese nula seja aceita, Fcalc < Ftab ou Fcrit .
O valor de Fcalc sempre maior que a unidade.
Preciso Intermediria
H 0 : s12 s 22
H1 :
s1 s 2
2
Fcalc. = 0,45/0,34
Fcalc = 1,32
Ftab= 3,43
Fcalc< Ftab
H0 aceita.
Analistas diferentes:
satisfatria
Identificao das amostras: Amostras do laboratrio A

analisadas por analistas diferentes.
Amostras
Laboratrio A
Analista 1
Equip. 2
Analista 2
Equip. 2
A1
101,84
100,36
A2
102,61
100,54
B1
101,54
99,46
B2
101,71
99,55
C1
100,58
101,53
C2
100,57
99,89
D1
101,85
100,24
D2
101,74
100,39
E1
101,18
100,05
E2
101,19
100,02
F1
100,54
100,85
F2
100,58
100,84
Mdia
101,33
100,31
DP
0,67
0,58
DPR
0,66
0,58
s2
0,45
0,34
H 0 : s12 s 22
H1 :
s1 s 2
2
Fcalc = 0,49/0,34
Fcalc = 1,44
Ftab= 3,43
Fcalc< Ftab
H0 aceita.
Equip. diferentes:
satisfatria
Identificao das amostras: Amostras do laboratrio A analisadas

com equipamentos diferentes.
Amostras
Laboratrio A
Analista 2
Equip.2
Analista 2
Equip.1
A1
100,36
99,21
A2
100,54
98,80
B1
99,46
100,41
B2
99,55
100,83
C1
101,53
99,50
C2
99,89
99,64
D1
100,24
100,41
D2
100,39
100,07
E1
100,05
99,02
E2
100,02
99,03
F1
100,85
99,02
F2
100,84
98,80
Mdia
100,31
99,56
DP
0,58
0,70
DPR
0,58
0,70
S2
0,34
0,49
Clculos Estatsticos
A ANOVA (anlise de varincia) utilizada para comparao de
duas ou mais anlises, a partir da distribuio F, utilizada para
realizar o teste de hiptese, onde a hiptese nula de que no
h diferenas estatisticamente significativas entre as anlises,
se Fcalc < Ftab aceita-se a hiptese nula ( H 0 : ).
Ftab para o nvel de significncia adotado.

Intervalo
Intervalo especificado a faixa entre os limites de
quantificao superior e inferior de um mtodo analtico.
estabelecido pela confirmao de que o mtodo apresenta:

Exatido,
Preciso,
Linearidade
... adequados quando aplicados a amostras contendo quantidades
de substncias dentro do intervalo especificado.
O intervalo depende da aplicao pretendida.

Limite de Deteco (LD).
O Limite de Deteco a menor quantidade do analito
presente em uma amostra que pode ser detectado, porm no
necessariamente quantificado, sob as condies experimentais
estabelecidas.
O limite de deteco estabelecido por meio da anlise de
solues de concentraes conhecidas e decrescentes do analito,
at o menor nvel detectvel.

A avaliao do limite de deteco (LD) pode ser: Visual,
Relao sinal/rudo - 3:1,
Desvio Padro da resposta e inclinao.
LD = 3 x DP
DP = Desvio padro
IC
IC = Inclinao da curva de calibrao
A inclinao pode ser estimada da curva de calibrao do analito.

A estimativa do desvio padro DP pode ser feita :
Desvio padro do Branco.
Baseado na Curva de Calibrao - Construir trs curvas de
calibrao na faixa do LQ, o DP da interseco Y pode ser usado
como DP.

Limite de Quantificao (LQ).
O Limite de Quantificao a menor quantidade do

analito presente em uma amostra que pode ser determinada
com exatido e preciso aceitveis, sob as condies
experimentais estabelecidas.
O limite de quantificao estabelecido por meio da anlise de
solues de concentraes conhecidas e decrescentes do analito,
at o menor nvel determinvel com preciso e exatido aceitveis.

Limite de Quantificao (LQ).
Relao sinal/rudo - 10:1,
Desvio Padro da resposta e inclinao.
LD = 10 x DP
DP = Desvio padro
IC
IC = Inclinao da curva de calibrao
A inclinao pode ser estimada da curva de calibrao do analito.
A estimativa do desvio padro DP pode ser feita :
Desvio padro do Branco.
Baseado na Curva de Calibrao - Construir trs curvas de
calibrao na faixa do LQ, o DP da interseco Y pode ser usado
como DP.

Robustez.
A robustez de um mtodo analtico a medida de sua
capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variaes dos
parmetros analticos. Indica sua confiana durante o uso normal.
Caso haja susceptibilidade do mtodo variaes nas condies

analticas, estas devero ser controladas e precaues devem ser
includas no procedimento.

Robustez.
Fatores que devem ser considerados na determinao da robustez
do mtodo analtico:
Preparo das
Amostras:
Estabilidade das solues analticas

Tempo de extrao
Espectrofotometria:
Variao do pH da soluo
Diferentes fabricantes de solventes
Cromatografia Lquida: Variao do pH da fase mvel

Variao na composio da fase mvel
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
Temperatura
Fluxo da fase mvel

Robustez.
Cromatografia Gasosa.
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas

Temperatura
Velocidade do gs de arraste
Avaliao da Robustez
A verificao da robustez deve ser realizada aps a
validao do mtodo;
Planejamento experimental para avaliar a robustez pelo
mtodo de Youden matriz de experimento;
Avaliar qual o impacto das variaes teor (exatido)
Bibliografia
ANVISA, Habilitao de Laboratrios Analticos em sade segundo os
requisitos da ISO/IEC 17025 Procedimento GGLAS 02/17025, 2. ed, Braslia,
2002.
ANVISA, Guia para Qualidade em Qumica Analtica Uma Assistncia a

Acreditao, v. 1, 1. ed, Braslia, 2004.
ANVISA, Informe Tcnico n 1 de 15 de julho de 2008 Esclarecimento sobre o
item 2.9 do anexo da Resoluo RE n 1 de 29/07/2005, que trata do Guia para
Realizao dos Estudos de Estabilidade.
BRASIL, Resoluo (RE) n 899, de 29 de maio de 2003. Determina a

publicao do "Guia para validao de mtodos analticos e bioanalticos". Dirio
Oficial [da] Republica Federativa do Brasil, Braslia, DF, 02 de junho de 2003.
Bibliografia
BRASIL, Resoluo (RDC) n 210, de 04 de agosto de 2003. Atualiza as Boas
Prticas de Fabricao de medicamentos com o objetivo de acompanhar o
desenvolvimento de novas tecnologias. Dirio Oficial [da] Republica Federativa do
Brasil, Braslia, DF, 14 de agosto de 2003.
BRITO, N.M. Avaliao da Exatido e da Preciso de Mtodos de Anlise de
Resduos de Pesticidas Mediante Ensaios de Recuperao. Pesticidas:
R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 12, p. 155-168, jan./dez. 2002
CDER (Center for Drug Evaluation and Research). Validation of Chromatografic

Methods, nov. 1994.
FURMAN,W. B. Pharm.Techn. 22, (6), 1998, 54 -65.
INMETRO DOQ-CGCRE-008 Orientaes sobre Validaes de Mtodos de
Ensaios Qumicos. RJ, Brasil, 20003.
LAPPONI, J.C. Estatstica usando Excel. So Paulo: Lapponi treinamento e editora,

2000.
Bibliografia
NBR ISO/IEC 17025, Requisitos Gerais para a Competncia de Laboratrios de
Calibrao e de Ensaios. ABNT, RJ, Brasil, 2001.
PHARMACOPEIAL Forum. USP Monographs.
Procedures, 31(2), Mar-Abr, 2005, p. 555-558.
Verification
of
Compendial
PHARMACOPEIAL Forum. USP Monographs. 31(3), May-June, 2005, p. 834-835.

SHABIR, G. A. Validation of high-performance liquid chromatography methods for
pharmaceutical analysis Understanding the differences and similarities between
validation requirements of the US Food and Drug Administration, the US
Pharmacopoeia and the International Conference on Harmonization. Journal of
Chromatography A, 987, p. 57-66, 2003. Disponvel em http://www.sciencedirect.com,
Acesso em: 16 de abril de 2003.
USP (THE UNITED STATES PHARMACOPEIA). Chromatography, 27 ed. Rockville:
United States Pharmacopeial Convention, 2004, p. 2272 2284.
Obrigada!
Contato: antonia.mcavalcanti@gmail.com
Tel: (21) 8596-6780

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Workshop de Validao de Metodologia

Ministrante: Professora Antonia Maria Cavalcanti de Oliveira

Plano Mestre de Validao

Dados que devem ser coletados e medidos

um resumo ou sumrio do processo de

Validao de Metodologia Analtica

Validao de Metodologia Analtica

Validao de Metodologia Analtica

Validao de Metodologia Analtica

Verificar adequao ao uso;

Esto aqui includos os Mtodos Farmacopicos.

Quando Efetuar a Validao do Mtodo?

Quando Efetuar a Validao do Mtodo?

Segundo a Anvisa (RE 899/2003).

Quando Efetuar a Revalidao do Mtodo?

Mudanas na composio do produto acabado;

Determinadas outras mudanas podem requerer validao.

Concentrao de sais no tampo (CLAE) + 10% (absoluto),

Comprimento da coluna (CLAE, CG) + 70%,

Os Mtodos Normalizados Devem Ser Validados?

No caso de metodologias analtica descrita em

Os Mtodos Normalizados Devem Ser Validados?

O laboratrio deve confirmar que tem competncia para

Os Mtodos Normalizados Devem Ser Validados?

Para usar metodologia analtica descrita na USP-NF

Estratgia para Validao de Mtodos Normalizados

Evidncia documentada que um mtodo previamente

Verificao da competncia analtica.

Especificidade, linearidade, exatido,

Estratgia para Validao de Mtodos No

Resultado obtido com colunas cromatogrficas diferentes.

T=Fator de cauda ou assimetria; k= Fator de capacidade; N - Nmero de pratos tericos.

Proporo da fase mvel

Rt = tempo de reteno; T=Fator de cauda ou assimetria; k= Fator de capacidade; N - Nmero de pratos

Rt = tempo de reteno; T=Fator de cauda ou assimetria; k= Fator de capacidade; N - Nmero de pratos

Validao de Metodologia Analtica

Classificao dos testes segundo sua finalidade

Testes quantitativos para determinao do

Testes quantitativos ou ensaio limite para

Testes de performance (por exemplo: dissoluo,

Planejamento (passos) da Validao.

Ajustar os parmetros do mtodo se necessrio;

Ensaios necessrios para a validao do mtodo.

* pode ser necessrio, dependendo da natureza do teste especfico.

Teste de Adequao do Sistema

Fator de capacidade (k')

O pico deve estar bem resolvido de outros

desejvel um DPR 1% para N 5

Tempo de reteno relativo

No essencial se a resoluo declarada

R 2 entre o pico de interesse e o potencial

Fator de cauda (T)

Nmero de pratos tericos (N)

Em geral deve ser 2000

Definio dos Parmetros de

Definio dos Parmetros de Validao

Definio dos Parmetros de Validao

Em mtodos cromatogrficos, deve-se tomar as precaues

Exemplo de um estudo de Especificidade.

Exemplo de um estudo de Especificidade.

Exemplo de um estudo de Especificidade.

Resoluo entre picos adjacentes, do componente principal e outros

Exemplo de um estudo de Especificidade.