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Conceitos e Mtodos para a Formao de Tcnicos em Laboratrios de Sade

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FUNDAO OSWALDO CRUZ Presidente Paulo Ernani Gadelha Vieira ESCOLA POLITCNICA DE SADE JOAQUIM VENNCIO Diretora Isabel Brasil Pereira Vice-diretor de Pesquisa e Desenvolvimento Tecnolgico Maurcio Monken Vice-diretora de Ensino e Informao Mrcia Valria Morosini Vice-diretor de Gesto e Desenvolvimento Tecnolgico Sergio Munck INSTITUTO OSWALDO CRUZ Diretora Tnia Cremonini Arajo Jorge Vice-diretora de Pesquisa, Desenvolvimento Tecnolgico e Inovao Mariza Gonalves Morgado Vice-diretora de Ensino, Informao e Comunicao Helene dos Santos Barbosa Vice-diretora de Servios de Referncia e Colees Cientficas Elizabeth Ferreira Rangel Vice-diretor de Desenvolvimento Institucional e Gesto Christian Maurice Gabriel Niel

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Volume 1
ORGANIZADORAS

Etelcia Moraes Molinaro Luzia Ftima Gonalves Caputo Maria Regina Reis Amendoeira

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Copyright 2009 dos autores Todos os direitos desta edio reservados Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/Fundao Oswaldo Cruz

Conselho Editorial Dr. Ana Luzia Lauria Filgueiras Dr. Ftima Conceio Silva Dr. Herman Schatzmayr Dr. La Camillo-Coura Dr. Lycia de Brito Gitirana Dra. Marcia Ferro Dr. Marco Antonio Ferreira da Costa Dr. Margareth Maria de Carvalho Queiroz Dr. Maria Regina Reis Amendoeira Dr. Otlio Machado Pereira Bastos Capa Z Luiz Fonseca Projeto Grfico e Editorao Marcelo Paixo

Fotos Rodrigo Mexas Maria Eveline Castro Pereira Moyses Gomes Marcelino Desenhos Newton Marinho da Costa Jnior Reviso Ana Lucia Proa Melo Secretria Executiva da Coleo Josane Ferreira Filho

Catalogao na fonte Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio Biblioteca Emlia Bustamante
M722c Molinaro, Etelcia Moraes Conceitos e mtodos para a formao de profissionais em laboratrios de sade: volume 1 / Organizao de Etelcia Moraes Molinaro, Luzia Ftima Gonalves Caputo e Maria Regina Reis Amendoeira. - Rio de Janeiro: EPSJV; IOC, 2009. 290 p. : il. , tab. ISBN: 978-85-98768-41-0 1. Tcnicas e Procedimentos de Laboratrio.2. Pessoal de Laboratrio. 3. Laboratrios. 4. Formao de Tcnicos. 5. Sade e Educao. I. Ttulo. II. Caputo, Luzia Ftima Gonalves. III. Amendoeira, Maria Regina Reis. CDD 542.1

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Autores
Cntia de Moraes Borba Biloga, mestre e doutora em Biologia Parasitria pela Fundao Oswaldo Cruz. Pesquisadora Associada do Instituto Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz. Cleide Cristina Apolinrio Borges Biloga, especialista em Entomologia Mdica pelo Instituto Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz. Tecnologista em Sade Pblica do Centro de Criao de Animais de Laboratrio/Fiocruz. Etelcia Moraes Molinaro Biloga, especialista em Criao e Manejo de Animais Silvestres pela Sociedade Nacional de Agricultura e em Zoologia pelo Conselho Regional de Biologia, mestre em Biologia Animal pela UFRRJ. Tecnologista Snior em Sade Pblica da Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/Fiocruz. Joel Majerowicz Mdico Veterinrio, Mestre em Tecnologia de Imunobiolgicos peo IOC/Bio-Manguinhos/ Fiocruz. Tecnologista Snior em Sade Pblica, Diretor do Centro de Criao de Animais de Laboratrio da Fundao Oswaldo Cruz/Fiocruz. Joseli Maria da Rocha Nogueira Biloga, especialista em Microbiologia e Anlises clnicas, mestre em Microbiologia Veterinria pela UFRRJ e doutora em Cincias pela Ensp/Fiocruz, Tecnologista Snior da Escola Nacional de Sade Publica Sergio Arouca/Fiocruz. Professor colaborador da UFRJ e professor adjunto da Unigranrio.

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Marcelo Pelajo Machado Mdico, doutor em Biologia Celular e Molecular pela Fundao Oswaldo Cruz, psdoutor pelo Deutsches Krebsforschungszentrum, Alemanha, Pesquisador Titular da Fundao Oswaldo Cruz, Chefe do Laboratrio de Patologia do Instituto Oswaldo Cruz. Marco Antonio Ferreira da Costa Engenheiro Qumico licenciado em Qumica, mestre em Educao pela Unesa, mestre em Psicopedagogia, Universidade de La Habana, doutor em Cincias, Instituto Oswaldo Cruz/IOC e professor-pesquisador da Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/Fiocruz. Maria Beatriz Siqueira Campos de Oliveira Biomdica, especialista em Microbiologia (Sobeu) e Liofilizao pela Edwards, Crowley, Inglaterra, mestre em Educao pela Unesa, doutoranda em Ensino em Biocincias e Sade pelo IOC/Fiocruz. Tecnologista Snior em Sade Pblica da Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/Fiocruz. Maria Eveline de Castro Pereira Administradora, mestranda no Programa de Ps-graduao Stricto Sensu em Ensino de Biocincia e Sade do Instituto Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz. Analista em Cincia e Tecnologia do IOC/Fiocruz. Mnica Mendes Caminha Murito Engenharia Qumica e mestre em Biocincias e Sade pelo IOC/Fiocruz. Pesquisadora visitante da Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/Fiocruz. Paulo Roberto de Carvalho Qumico Industrial, especialista em Gesto Ambiental pela Unesa, mestre em Sistemas de Gesto em Segurana do Trabalho pela UFF e doutor em Cincias pelo IOC/Fiocruz. Professor-pesquisador da Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/Fiocruz. Pedro Paulo de Abreu Manso Tcnico em Histologia pela Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio, bilogo e mestre em Cincias pelo programa de Biologia Celular e Molecular do Instituto Oswaldo Cruz/IOC. Tecnologista em Sade Pblica do Laboratrio de Patologia do Instituto Oswaldo Cruz, e Professor de Biologia da Secretaria Estadual de Educao.

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Sebastio Enes Reis Couto Medico Veterinrio. Especialista em Planejamento e Produo de Animais de Laboratrio, Gnotobiticos e Livre de Germes Patognicos Especficos/SPF. Tecnologista Snior em Sade Pblica do Centro de Criao de Animais de Laboratrio/Cecal da Fundao Oswaldo Cruz/Fiocruz. Silvio Valle Moreira Mdico Veterinrio, Pesquisador Titular da Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio e coordenador de cursos de Biossegurana na Fundao Oswaldo Cruz. Simone Ramos Biolga, especialista em Virologia pelo Instituto Paulo de Ges UFRJ, mestre em Cincias - Instituto Paulo de Ges UFRJ. Wildeberg Cal Moreira Mdico Veterinrio, mestre em Tecnologia de Imunobiolgicos pelo IOC/Bio-Manguinhos/ Fiocruz. Tecnologista Pleno em sade pblica do Cecal/Fiocruz Virgnia de Lourdes Mendes Finete Qumica e mestre em Qumica Analtica pela Pontifcia Universidade Catlica do Rio de Janeiro. Professora de Qumica na Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio da Fundao Oswaldo Cruz/Fiocruz.

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Sumrio
Prefcio

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Apresentao da coleo 15 Apresentao pelas organizadoras

Captulo 1. Biossegurana e boas prticas laboratoriais

Captulo 2. Conceitos e tcnicas bsicas aplicadas em laboratrio 67 Captulo 3. Microscopia da luz

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Captulo 4. Animais de laboratrio

Captulo 5. Fundamentos em qumica experimental

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PREFCIO
O Chico Trombone costumava me dizer: Isso eu sei fazer, Dr. Luiz Fernando, aprendi com Joaquim Venncio. E era com orgulho que se referia a seu mestre. Vimos, portanto, que a formao de tcnicos j vem dos tempos de Oswaldo. claro que no era institucionalizado como hoje. Eram outros tempos. Joaquim Venncio nasceu na fazenda Bela Vista, em Minas Gerais. Era a fazenda da me de Carlos Chagas, pai. Em 1916, veio trabalhar no Instituto Oswaldo Cruz. Veio e deu certo. O Dr. Lutz teria dito certa vez: No troco o Venncio por nenhum doutor de Oxford ou de Cambridge. Se no disse, pensou. Eficincia nos processos de seleo de pessoal? Competncia do servio de recursos humanos? Evidentemente que no. No havia nada disso nessa poca. As coisas eram muito mais simples, e davam certo. Veio porque era amigo do velho Carlos Chagas. Amigos de infncia. Brincaram juntos na fazenda. Quando Joaquim Venncio faleceu, em 27 de agosto de 1955, teve seu necrolgio publicado na Revista Brasileira de Biologia. Lugar de ne-

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crolgio de cientista famoso. Cito textual: Joaquim Venncio conseguiu, durante cerca de 35 anos que trabalhou ativamente, aprender zoologia que conhecia de modo invejvel. Como decorrncia das contingncias da vida, no teve oportunidade de instruir-se, mas sua mentalidade era de um homem culto. Pela convivncia com o Dr. Lutz, pela observao direta do que via nas excurses e no laboratrio, adquiriu conhecimento detalhado de vrios grupos zoolgicos, principalmente anfbios, moluscos fluviais e trematdeos. Chegou a conhecer muito bem os anfbios e, com grande facilidade, os classificava nas excurses pela voz. Dadas as indicaes feitas pelo Dr. Lutz em seus trabalhos, h casos em que foi citado na literatura como colaborador direto. Joaquim Venncio era, sem dvida, um naturalista. Era competente, tinha o domnio do ofcio, a maestria da arte. E gostava de ensinar. Ensinou muita gente. Certa vez, o Venancinho me disse: Era a Escola do Venncio, n? Foi muito boa, n? * * * Na presidncia de Sergio Arouca, resolvemos atualizar a Escola de Venncio. E foi assim que surgiu a Escola Politcnica, com o nome do seu patrono. Cresceu e abriu vrias frentes, desde a vocao cientfica aos cursos de nvel mdio complementados pela formao de tcnicos. Foi um xito, como a antiga. Aparece sempre nos primeiros lugares nas avaliaes e j se estendeu a outras instituies. * * * E agora surgem os livros didticos. Organizado por Etelcia Moraes Molinaro, Luzia Ftima Gonalves Caputo e Maria Regina Reis Amendoeira, vem luz a coleo Conceitos e Mtodos para a Formao de

Prefcio

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Tcnicos em Laboratrios de Sade , reunindo professores de vrias unidades da Fiocruz.


Os captulos oferecem a histria da tcnica, os seus fundamentos, a maneira moderna de realiz-la, as suas aplicaes, a organizao do laboratrio etc. til para os cursos da Fundao e para outros externos. Mostra, tambm, o quanto as unidades da Fiocruz esto integradas na realizao de suas tarefas. Ensino questo primordial. Sem ele, o pas no se desenvolve. Est de parabns a Fiocruz pela realizao de mais uma tarefa de primordial importncia. Oswaldo Cruz est orgulhoso dos seus continuadores.
Pesquisador Emrito da Fundao Oswaldo Cruz
Luiz Fernando Ferreira

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Apresentao
A coletnea de livros intitulada Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade, organizada por Etelcia Moraes Molinaro, Luzia Ftima Gonalves Caputo e Maria Regina Reis Amendoeira antes de tudo uma obra original, importante e necessria. Original porque no existe na literatura tcnica em sade, na rea biomdica brasileira e internacional, pelo menos que eu saiba, algo semelhante em abrangncia, profundidade e seleo dos temas abordados; importante pelo pblico alvo a que se destina, muito alm da Formao de Tcnicos de Laboratrios, abrangendo certamente todos os profissionais de sade, e necessria porque servir como obra de referncia para a formao dos mencionados tcnicos e de consulta obrigatria para todos os profissionais de sade que necessitem de esclarecimento dos aspectos tcnicos ali abordados. Versada em cinco volumes e 22 captulos, organizados em sequncia lgica, desde a biossegurana e boas prticas de laboratrio, passando por todos os fundamentos das tcnicas laboratoriais, bioqumica bsica, biologia celular e molecular, histologia e ultraestrutura, at atingir o cerne da prtica laboratorial, da imunologia infectoparasitologia virologia, bacteriologia, micologia, protozoologia e helmintologia e seus vetores, com a entomologia mdica e a malacologia. Os autores que escrevem os respectivos captulos,

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so do melhor nvel intelectual e cientfico, com a titulao de mestres, doutores e especialistas, com grande experincia prtica nos assuntos de que tratam. Parabenizo o Instituto Oswaldo Cruz e a Escola Politcnica Joaquim Venncio, que patrocinaram esta obra de referncia, os quais, desde seus primrdios, valorizaram a qualidade da formao dos seus tcnicos e com eles povoaram e esto povoando o Brasil de Norte a Sul e de Leste a Oeste com o que temos de melhor os fundamentos para uma boa pesquisa. Aproveito esta oportunidade para homenagear a figura de Henry Willcox, que no incio da dcada de 1980, quando o convidei para me ajudar na coordenao dos cursos de ps-graduao em Biologia Parasitria e Medicina Tropical do Instituto Oswaldo Cruz, foi o grande incentivador para criarmos paralelamente o Curso de Tcnico em Pesquisa, do qual foi o seu primeiro coordenador. Igualmente parabenizo as organizadoras desta coletnea e a Fiocruz como um todo, pelo lanamento desta obra pioneira.
Jos Rodrigues Coura Pesquisador Titular Emrito Chefe do Laboratrio de Doenas Parasitrias IOC/Fiocruz

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Um sonho quase realizado


(Oswaldo Cruz 1872-1917)

As alteraes pelas quais passa o mundo com a globalizao trazem como consequncia o surgimento de novos paradigmas tecnolgicos, fazendo-se necessrio que o ensino da rea da sade atenda s exigncias do mundo moderno, do trabalho e do atual perfil do tcnico da rea. Os cursos para a formao de tcnicos da Fundao Oswaldo Cruz Fiocruz buscam demonstrar os princpios cientficos envolvidos com as tcnicas laboratoriais, preparando os alunos para as transformaes no mundo do trabalho em sade, decorrentes do desenvolvimento tecnolgico e cientfico. Neste contexto, duas Unidades Tcnicas Cientficas desta instituio, o Instituto Oswaldo Cruz IOC e a Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio EPSJV, historicamente so as responsveis por coordenarem cursos e especializaes tcnicas que se firmaram como modelos desses princpios. Essas Unidades, na rea de ensino tcnico, sempre estiveram intrinsecamente ligadas, e os professores realizam permanente parecerias entre si. Muitos de ns, egressos desses cursos, so hoje docentes e autores desta coleo. Alm da formao tcnica de profissionais em nvel regional e nacional, intensificou-se, na Fiocruz, a demanda para o estabelecimento de cooperaes tcnicas internacionais, que por sua expertise e capacidade de produzir, pas-

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sou a divulgar conhecimentos, elaborando cursos, metodologias e tecnologias educacionais. A Escola Politcnica Centro Colaborador da Organizao Mundial da Sade (OMS) para a educao de tcnicos em sade, desde 2004. A ideia da publicao dessa coleo surgiu da necessidade conjunta das duas Unidades da Fiocruz de produzir material didtico, que atendesse aos alunos dos cursos de Nvel Tcnico em Sade da Fiocruz e de outros locais.Desse modo, o nosso principal desafio oferecer contedo que abarque toda a rea tcnica de sade utilizada nos principais cursos de nvel mdio, e, que ao mesmo tempo, possa manter-se suficientemente atualizado. Dada a complexidade da estrutura instrumental e pedaggica dos Cursos Tcnicos, se fez necessria a publicao de uma coleo, escolhendo-se tpicos de importncia bsica. Para tanto, foram convidados pesquisadores/professores com experincia em ensino de Cursos de Nvel Tcnico e de destacado conhecimento nos temas abordados nos 22 captulos, que constituem os cinco volumes da coleo. A coleo Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade tem como objetivo integrar conhecimentos tericos e prticos, proporcionando ao aluno informaes que possibilitem uma permanente reflexo de seu papel como agente transformador dos processos e atividades de ensino, pesquisa cientfica e desenvolvimento tecnolgico. Outro objetivo inconteste destes livros servir para professores, como norteadores da definio curricular de seus cursos. Visando garantir a autonomia dos autores, e respectivas responsabilidades,foi mantida a formatao original dos textos, inclusive as fotos, figuras, diagramas. Podem ocorrer tambm, algumas repeties de contedo em alguns captulos, mas, a nosso ver, a retirada de partes de captulos j abordadas poderia descontextualizar o texto.

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O pontap inicial deste sonho s foi possvel pelo incondicional apoio dado pelo professor Andr Paulo da Silva Malho, pela Dra. Isabel Brasil Pereira, pessoa-chave desencadeadora do processo, e pela Dra. Tnia Cremonini de Arajo Jorge, que apoiaram e incentivaram institucionalmente este projeto. Agradecemos especialmente aos autores que abraaram este trabalho com muito entusiasmo e que possibilitaram a sua concretizao. E um carinho especial para Josane Ferreira Filho pela organizao paciente de nossas reunies e textos, com a gratido das organizadoras e autores. Agradecemos em especial aos renomados cientistas emritos da Fundao Oswaldo Cruz, doutores Luiz Fernando Ferreira patrono da EPSJV , Jos Rodrigues Coura, que nos deram a honra de apresentar esta coleo. Esperamos assim, estar contribuindo para a sistematizao do conhecimento dos leitores sobre os diversos tpicos abordados em cada captulo, apresentando cada assunto de forma didtica e sinttica, recomendando a consulta literatura especializada sempre que houver necessidade de aprofundamento do conhecimento em determinados temas.
Etelcia Moraes Molinaro Luzia Ftima Gonalves Caputo Maria Regina Reis Amendoeira Organizadoras

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Captulo 1
Biossegurana e boas prticas laboratoriais
Cntia de Moraes Borba Marco Antonio F. da Costa Maria Eveline de Castro Pereira Paulo Roberto de Carvalho Silvio Valle

Introduo

O laboratrio um ambiente extremamente hostil. Convivem no mesmo espao equipamentos, reagentes, solues, microrganismos, pessoas, papis, livros, amostras, entre outros elementos. Para que esse sistema funcione de forma adequada e segura, torna-se necessrio:
Disciplina; Respeito s normas e legislaes pertinentes; Trabalhar no contexto da qualidade e da Biossegurana; Conscincia tica.

O ambiente laboratorial deve ser entendido como um sistema complexo, onde existem interaes constantes entre os fatores humanos, ambientais,

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tecnolgicos, educacionais e normativos. Essas interaes, muitas vezes, favorecem a ocorrncia de acidentes. Um instrumento que pode contribuir para a minimizao dessas ocorrncias desagradveis a Biossegurana, definida como: Conjunto de estudos e aes destinados a prevenir, controlar, reduzir ou eliminar riscos inerentes s atividades que possam comprometer a sade humana, animal, vegetal e o meio ambiente. Nessa linha, devemos entender os conceitos de perigo, risco e acidente.
O perigo uma possibilidade de causar danos, o

PERIGO, RISCO, risco a probabilidade de concretizao desse perigo e acidente a concretizao desse risco. ACIDENTE

BIOLGICO

Relativo a, ou prprio dos seres vivos (Dicionrio Houaiss da Lngua Portuguesa).

No Brasil, a Biossegurana possui duas vertentes: A legal, que trata das questes envolvendo a manipulao de Organismos Geneticamente Modificados (OGMs) e pesquisas com clulas-tronco embrionrias, e que tem uma lei, a de n o 11.105, chamada Lei de Biossegurana, sancionada pelo governo brasileiro em 24 de maro de 2005 (SILVA, PELAEZ e VALLE, 2009; VALLE, 2009; VALLE e BARREIRA, 2007). A praticada, aquela desenvolvida, principalmente, nas instituies de sade e laboratrios em geral, que envolve os riscos por agentes qumicos, fsicos, biolgicos, ergonmicos e psicossociais,

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presentes nesses ambientes, que se encontra no contexto da segurana ocupacional (COSTA e COSTA, 2009; COSTA e COSTA, 2005, 2006; VALLE e TELLES, 2003; CARVALHO, 1999). Este captulo, portanto, tem como objetivo apresentar, de forma didtica, algumas caractersticas da Biossegurana e da qualidade praticadas em espaos laboratoriais. Estando a Biossegurana e a qualidade aliceradas, principalmente, na postura profissional, consideramos importante discutir, tambm, alguns conceitos relacionados tica.
1. Facilitando a prxis da Biossegurana

O homem um ser biolgico, logo, um produto da natureza. Mas tambm um ser social, isto , um produto da cultura, do saber, das suas interrelaes. De acordo com Schramm (2006),
o humano enfrenta seu estado de necessidade e precariedade de vrias maneiras, inclusive com o saber-fazer racional e operacional da tecnocincia. Ademais, neste sculo adquiriu a competncia biotecnocientfica, que visa transformar e reprogramar o ambiente natural, os outros seres vivos e a si mesmo em funo de seus projetos e desejos, fato que se torna, cada vez mais, motivo de grandes esperanas e angstias, consensos e conflitos, em particular do tipo moral.

As preocupaes da citao anterior, oriundas do desenvolvimento tcnico-cientfico do nosso tempo, vm impactando de forma acentuada as relaes humanas e, nesse sentido, torna-se importante compreender alguns conceitos como os de moral, tica, biotica, deontologia, diceologia, Comits de tica em Pesquisa, Comits de tica no Uso de Animais e as relaes desses conceitos com o direito. A devida compreenso desses conceitos facilitar, sobremaneira, o entendimento das relaes que envolvem a Biossegurana (GOLDIM, 2009).

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O funcionrio no tem moral. Ele agiu sem tica. Afinal de contas, o que MORAL e o que TICA? Normalmente, as palavras moral e tica so utilizadas como sinnimos, vinculadas a um conjunto de regras obrigatrias. Esta confuso ocorre h muitos sculos. A prpria etimologia destes termos gera confuso, j que tica vem do grego ethos, que significa modo de ser, e moral tem sua origem do latim, que vem de mores, significando costumes. Podemos definir esses termos da seguinte forma:
um conjunto de normas que regulam o comportamento humano. Estas normas so adquiridas pela educao, pela MORAL tradio e pelo cotidiano, ou seja, pelo processo de culturalizao. A moral algo pessoal e ntimo. Por exemplo: andar com os seios mostra na praia no moralmente aceito no Brasil, porm, em outros pases isso normal. o conjunto de valores que orientam o comportamento humano em sociedade. O que a caracteriza a reflexo sobre a ao humana. Por exemplo: tico jogar resduo qumico na pia?

TICA

Valores so normas, princpios ou padres sociais aceitos ou mantidos por indivduo, classe, sociedade, etc. Vsquez (1998) aponta que a tica terica e reflexiva, enquanto a moral eminentemente prtica. Uma completa a outra, havendo um interrelacionamento entre ambas, pois, na ao humana, o conhecer e o agir so indissociveis. Normas ticas, segundo Christofari (1998: 57),
dizem respeito ao agir humano. So aquelas que disciplinam o comportamento do homem, tanto o de foro ntimo e

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subjetivo, quanto o de natureza exterior e social. Prescrevem deveres para a consecuo de valores. Entretanto, no apenas implicam em juzos de valor, mas impem a escolha de uma diretriz, de carter obrigatrio num determinado grupo social. Sua principal caracterstica a possibilidade de serem violadas.

E Biotica, o que ? Existem vrias definies para o termo Biotica, do grego bios (vida) e tica. Podemos defini-la da seguinte forma:
uma rea do conhecimento interdisciplinar (integrao entre as disciplinas), cuja finalidade compreender e resolver BIOTICA questes ticas relacionadas aos avanos tecnolgicos da Biologia e da Medicina e questes que de alguma forma influenciam as nossas vidas.

A Biotica est apoiada em quatro princpios:


Autonomia; No-maleficncia;

Beneficncia; Justia. Princpio da autonomia o respeito vontade, crena, aos valores morais do indivduo e sua intimidade. Discusses sobre os limites morais da eutansia, do aborto, entre outros, esto no contexto deste princpio. As pessoas tm o direito de decidir sobre as questes relacionadas ao seu corpo e sua vida. Em indivduos intelectualmente deficientes, e no caso de menores de 18 anos, este princpio deve ser exercido pela famlia ou pelo responsvel legal. Princpio da beneficncia Assegura o bem-estar das pessoas, evitando danos, e garante que sejam atendidos seus interesses. Busca-se a maximizao do benefcio e a minimizao dos agravos.

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Princpio da no-maleficncia Assegura que sejam minorados ou evitados danos fsicos aos sujeitos da pesquisa ou pacientes. universalmente consagrado atravs do aforismo hipocrtico primum non nocere (primeiro no prejudicar). Princpio da justia Exige equidade, ou seja, a obrigao tica de tratar cada indivduo de acordo com o que moralmente correto e adequado e de dar a cada um o que lhe devido. Em junho de 2005, em reunio na sede da Organizao das Naes Unidas para a Educao, a Cincia e a Cultura (Unesco), para ser discutida a Declarao Universal sobre Biotica e Direitos Humanos, o Brasil teve um importante papel ao propor e conseguir a aprovao da incluso neste documento dos campos sanitrio, social e ambiental. Esta declarao foi aprovada por aclamao em outubro de 2005, na 33 a sesso da Conferncia Geral da Unesco. O importante dessa declarao que a Biotica no fica restrita s cincias da sade, mas a tudo aquilo que de alguma forma tenha implicao sobre as nossas vidas. Portanto, entre as questes discutidas na Biotica, temos: Aborto Eutansia Clonagem Pesquisas com/em humanos Alimentos transgnicos Fertilizao in vitro Uso de clulas-tronco embrionrias Testes com novos medicamentos Aquecimento global Tratamento e disposio de resduos, entre outros.

E o que Deontologia? A palavra deontologia originria do grego deontos (o que obrigatrio) e logos (estudo). Com isso, podemos defini-la da seguinte forma:

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DEONTOLOGIA

um tratado de deveres e/ou condutas que regem um profissional. O profissional est sujeito a uma deontologia especfica para o exerccio da sua profisso conforme o cdigo de tica da sua classe.

Existem inmeros cdigos de Deontologia, sendo esta codificao da responsabilidade de associaes ou conselhos profissionais. Normalmente, os cdigos deontolgicos tm por base as grandes declaraes universais e esforam-se por traduzir o sentimento tico expresso nestas, adaptando-o, no entanto, s particularidades de cada pas e de cada grupo profissional. Estes cdigos propem sanes, segundo princpios e procedimentos explcitos, para os infratores do mesmo. Alguns cdigos no apresentam funes normativas, tendo apenas uma funo reguladora. CDIGO DE TICA Visa formao da conscincia profissional sobre padres de conduta de uma determinada classe. E Diceologia? Diceologia deriva do grego diceo (direitos) e logos (estudo). Portanto, podemos defini-la como:

DICEOLOGIA

um tratado sobre os direitos profissionais de uma determinada classe, luz do seu cdigo de tica.

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O que so os Comits de tica em Pesquisa? Os Comits de tica em Pesquisa (CEP) com Seres Humanos so espaos acadmicos que avaliam a adequao tica dos projetos de pesquisas que envolvam seres humanos. Quando a pesquisa envolve animais, esses comits so chamados de Comits de tica no Uso de Animais (CEUA). No caso dos CEPs, esta avaliao realizada luz da resoluo n. 196 do Conselho Nacional de Sade (CNS), de 10 de outubro de 1996, e no caso dos animais, luz da Lei de Procedimentos para o Uso Cientfico de Animais, n. 11.794, de 8 de outubro de 2008. Todos os CEPs devem ser credenciados junto Comisso Nacional de tica em Pesquisa (Conep). uma comisso do CNS, criada atravs da resoluo n. 196/96 e com constituio designada pela resoluo n. 246/97, com a funo de implementar as normas e diretrizes regulamentadoras de pesquisas envolvendo seres humanos, aprovadas pelo conselho. Tem funo consultiva, deliberativa, normativa e educativa, atuando conjuntamente com uma rede de CEPs, organizados nas instituies onde as pesquisas se realizam. A Conep e os CEPs tm composio multidisciplinar com participao de pesquisadores, estudiosos de Biotica, juristas, profissionais da sade, das cincias sociais, humanas e exatas e representantes de usurios. Um instrumento obrigatrio nos projetos de pesquisa que envolvem seres humanos o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). A pesquisa s pode ser iniciada se todos os indivduos participantes tiverem acesso aos objetivos da pesquisa, seus benefcios e possveis riscos, mecanismos de proteo, endereo dos pesquisadores, e declararem (ou seus representantes legais) formalmente o aceite para a participao no estudo ou em terapias especficas. uma deciso voluntria.

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2. Legislao Brasileira de Biossegurana

A aprovao da Lei de Biossegurana (lei n. 11.105, de 24 de maro de 2005) teve como motivao principal pr fim aos impasses jurdicos sobre a liberao comercial dos Organismos Geneticamente Modificados (OGMs), tambm conhecidos por transgnicos. Apesar do amplo entendimento existente atualmente com a palavra biossegurana, como podemos constatar nos diversos artigos publicados, no contexto da Lei de Biossegurana vigente no Brasil ela s se aplica aos OGMs como previsto no:
Art. 1 Esta lei estabelece normas de segurana e mecanismos de fiscalizao sobre a construo, o cultivo, a produo, a manipulao, o transporte, a transferncia, a importao, a exportao, o armazenamento, a pesquisa, a comercializao, o consumo, a liberao no meio ambiente e o descarte de organismos geneticamente modificados OGMs e seus derivados, tendo como diretrizes o estmulo ao avano cientfico na rea de biossegurana e biotecnologia, a proteo vida e sade humana, animal e vegetal e a observncia do princpio da precauo para a proteo do meio ambiente.

O legislador, com o objetivo de esclarecer os limites da lei e enfatizar que ela se limita a uma determinada e especfica biotecnologia, previu as seguintes definies:
Art. 3 Para os efeitos desta Lei se considera: I organismo: toda entidade biolgica capaz de reproduzir ou transferir material gentico, inclusive vrus e outras classes que venham a ser conhecidas; II cido desoxirribonucleico ADN, cido ribonucleico ARN: material gentico que contm informaes determinantes dos caracteres hereditrios transmissveis descendncia;

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III molculas de ADN/ARN recombinante: as molculas manipuladas fora das clulas vivas mediante a modificao de segmentos de ADN/ARN natural ou sinttico e que possam multiplicar-se em uma clula viva, ou ainda as molculas de ADN/ARN resultantes dessa multiplicao; consideram-se tambm os segmentos de ADN/ARN sintticos equivalentes aos de ADN/ARN natural; IV engenharia gentica: atividade de produo e manipulao de molculas de ADN/ARN recombinante; V organismo geneticamente modificado OGM: organismo cujo material gentico ADN/ARN tenha sido modificado por qualquer tcnica de engenharia gentica; VI derivado de OGM: produto obtido de OGM e que no possua capacidade autnoma de replicao ou que no contenha forma vivel de OGM.

A Lei de Biossegurana prev que as demais biotecnologias que no envolvam a produo de OGMs e seus derivados, apesar de apresentarem trocas de genes e at a possibilidade de um certo grau de risco biolgico, no so regulados por esse marco legal. Existem alguns procedimentos bsicos e necessrios para a liberao comercial de um OGM: as condies bsicas necessrias para que a instituio requerente solicite a autorizao de uso comercial, a tramitao das solicitaes na Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana (CTNBio), os critrios bsicos para viabilizar a anlise das solicitaes, a tramitao de processos envolvendo a necessidade de estudos e de relatrio de impacto ambiental, as condies para a existncia de audincias pblicas e a possibilidade de recursos administrativos por parte dos agentes interessados nas revises das decises tomadas pela CTNBio. Toda instituio que utilizar tcnicas e mtodos de engenharia gentica ou realizar pesquisas com OGM e seus derivados dever criar uma Comisso Interna de Biossegurana (CIBio), alm de indicar um tcnico principal res-

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ponsvel para cada projeto especfico. Os critrios a serem observados na constituio da CIBio e os mecanismos de funcionamento foram estabelecidos atravs da resoluo normativa n. 1, de 20 de junho de 2006. A CTNBio constituda por 27 membros titulares e respectivos suplentes, assim distribudos: 12 especialistas de notrio saber cientifico e tcnico, em efetivo exerccio profissional (trs de cada uma das reas de sade humana, animal, vegetal e ambiental), nove representantes de rgos, sendo um de cada respectivo ministrio (ministrios da Cincia e Tecnologia, da Agricultura, Pecuria e Abastecimento, da Sade, do Meio Ambiente, do Desenvolvimento Agrrio, do Desenvolvimento, Indstria e Comrcio Exterior, da Defesa, da Secretaria Especial de Aquicultura e Pesca e das Relaes Exteriores) e seis especialistas representantes de organizaes da sociedade civil (nas reas de Defesa do Consumidor, Sade, Meio Ambiente, Biotecnologia, Agricultura Familiar e Sade do Trabalhador). Dentre as competncias da CTNBio, encontra-se a de emitir resolues, de natureza normativa, sobre as matrias de sua competncia. Para pedidos de liberao comercial, a deciso favorvel dever ter o voto de no mnimo 14 dos membros da CTNBio. O Conselho Nacional de Biossegurana (CNBS) um rgo de assessoramento superior do presidente da Repblica, ao qual compete a formulao e a implementao da Poltica Nacional de Biossegurana, o estabelecimento de princpios e diretrizes para a ao administrativa dos rgos e entidades federais relacionados biossegurana, a anlise de recursos interpostos pelos rgos de registro e fiscalizao a decises de liberao comercial dos transgnicos e seus derivados efetuadas pela CTNBio, a anlise dos aspectos de convenincia e oportunidade socioeconmicas e do interesse nacional nos processos de liberao comercial, quando submetidos ao conselho pela CTNBio, e sempre que entender necessrio poder avocar e decidir sobre qualquer processo de liberao comercial de OGM e derivado.

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O CNBS decidir sobre os recursos dos rgos de registro e fiscalizao relacionados liberao comercial e encaminhados no prazo de trinta dias a partir da data de publicao da deciso da CTNBio. Depois de analisados os aspectos de biossegurana pela CTNBio, vencidos possveis recursos e no havendo mais estudos adicionais que os rgos de registro e fiscalizao entendam necessrios para atender s suas reas de competncia, ocorrer o registro no rgo competente, podendo ento ser utilizado comercialmente. Quando a CTNBio entender que o transgnico potencialmente ou efetivamente causador de degradao ambiental, bem como determinar a necessidade de licenciamento ambiental, o processo ser encaminhado ao rgo competente do Ministrio do Meio Ambiente. Ao se apresentar o processo para liberao comercial, de acordo com a lei brasileira, pode-se perceber o grau de complexidade. O objetivo de criar uma lei capaz de agilizar a aprovao de OGM no pas baseou-se fundamentalmente no fortalecimento dos poderes da CTNBio, em detrimento das competncias dos rgos de fiscalizao e controle dos ministrios afins. A incluso de uma srie de dispositivos burocrticos que garantem a possibilidade de recursos s decises tcnicas tomadas pela CTNBio pode fazer com que a lei de biossegurana, diferentemente das expectativas iniciais de simplificao e de agilizao do processo de avaliao comercial, continue sendo a principal fonte de riscos e incertezas comercializao dos transgnicos.
3. Conteno e infraestrutura laboratorial

A conteno laboratorial tem como objetivo reduzir a exposio da equipe de profissionais que trabalha num laboratrio, seja na bancada ou mesmo na limpeza, a riscos biolgicos, qumicos e fsicos, como a radiao ionizante. Para se definir a conteno necessria, importante uma anlise de risco da atividade a ser desenvolvida nesse local, ou seja, quais os agentes qumicos,

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biolgicos e fsicos que sero manipulados. importante que o profissional conhea a composio e os riscos associados a cada material com o qual vai trabalhar, podendo, para tanto, consultar o protocolo do experimento a ser realizado, a Ficha de Informao de Segurana de Produto Qumico (ABNT/ NBR 14725) e/ou o Manual de Biossegurana. Segundo o Ministrio da Sade, a conteno pode ser classificada como primria que visa a garantir a proteo do ambiente interno do laboratrio e secundria, que est relacionada proteo do ambiente externo e proporcionada pela combinao de infraestrutura laboratorial e prticas operacionais (SKARABA, et al., 2004; PESSOA e LAPA, 2003).
3.1. Barreiras primrias

Os equipamentos de proteo so barreiras primrias que visam a proteger o profissional (individual) e o ambiente (coletivo). A Norma Regulamentadora n. 6, do Ministrio do Trabalho e Emprego, estabelece que o empregador deve adquirir e fornecer ao trabalhador equipamentos de proteo individual (EPI), orientando e treinando sobre o uso adequado, guarda e conservao, realizando periodicamente a higienizao e a manuteno, substituindo imediatamente sempre que danificado e extraviado. Toda vez que as medidas de proteo coletiva forem tecnicamente inviveis e no oferecerem completa proteo contra os riscos de acidentes no trabalho e/ou doenas profissionais, o equipamento de proteo individual deve ser utilizado pelo profissional como um mtodo de conteno dos riscos. Historicamente, os trabalhadores da rea da sade que atuam em hospitais, clnicas odontolgicas, veterinrias e laboratrios so considerados como categoria profissional de alto risco, pois esto frequentemente expostos aos riscos biolgicos, principalmente quando manuseiam fluidos corpreos e sangue (NISHIDE e BENATTI, 2004).

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Os equipamentos de proteo individual so todos os dispositivos de uso individual destinados a proteger a sade e a integridade fsica do trabalhador. A seguir, so enumerados os EPIs disponveis na maioria dos laboratrios de pesquisa, clnico e ensino. Protetores faciais Oferecem uma proteo face do trabalhador contra risco de impactos (partculas slidas, quentes ou frias), de substncias nocivas (poeiras, lquidos e vapores), como tambm das radiaes (raios infravermelho e ultravioleta, etc.). Protetores oculares Servem para proteger os olhos contra impactos, respingos e aerossis. importante que sejam de qualidade comprovada, a fim de proporcionar ao usurio viso transparente, sem distores e opacidade. Protetores respiratrios So utilizados para proteger o aparelho respiratrio. Existem vrios tipos de respiradores, que devem ser selecionados conforme o risco inerente atividade a ser desenvolvida. Os respiradores com filtros mecnicos, por exemplo, destinam-se proteo contra partculas suspensas no ar, os com filtros qumicos protegem contra gases e vapores orgnicos. As mscaras, que podem ser semifaciais e de proteo total, so necessrias no caso de uso de gases irritantes como o cloreto de hidrognio. Protetores auditivos Usados para prevenir a perda auditiva provocada por rudos. Devem ser utilizados em situaes em que os nveis de rudo sejam considerados prejudiciais ou nocivos em longa exposio.

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Luvas Previnem a contaminao das mos do trabalhador ao manipular, por exemplo, material biolgico potencialmente patognico e produtos qumicos. Alm de reduzir a probabilidade de que os microrganismos presentes nas mos dos trabalhadores possam ser transmitidos aos pacientes durante um atendimento mdico-hospitalar. Jalecos So de uso obrigatrio para todos que trabalham nos ambientes laboratoriais onde ocorra a manipulao de microrganismos patognicos, manejo de animais, lavagem de material, esterilizao, manipulao de produtos qumicos. Devem ser de mangas compridas, cobrindo os braos, o dorso, as costas e a parte superior das pernas. Calados de segurana So destinados proteo dos ps contra umidade, respingos, derramamentos e impactos de objetos diversos, no sendo permitido o uso de tamancos, sandlias e chinelos em laboratrios. Equipamentos de proteo coletiva (EPC) Tm como funo a proteo do ambiente e a manuteno da sade, alm da integridade dos ocupantes de uma determinada rea. Podem ser de uso rotineiro, como as cabines de segurana biolgica e capelas de exausto qumica, ou para situaes emergenciais, como os extintores de incndio, chuveiro e lava-olhos, que devem estar instalados em locais de fcil acesso e bem sinalizados.

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Cabines de Segurana Biolgica (CSB) Em 2909 a W. K. Mulford Phamaceutical CO, uma indstria farmacutica americana, concebeu o primeiro modelo de cabine para proteger a sade dos profissionais durante a preparao de tuberculina. So equipamentos concebidos para manter uma rea, denominada zona de trabalho, livre de partculas ou de provveis contaminantes, tais como bactrias, que possam alterar o produto com o qual se trabalha, afetar a sade do trabalhador e o ambiente. A proteo se efetiva mediante a combinao de elementos eletromecnicos/eletrnicos (motor, ventilador, filtro, dutos e iluminao) e processos fsicos (fluxo laminar, diferena de presso) que impulsionam o ar atravs de filtros especiais (Hepa) de grande superfcie, que tm uma eficincia mnima de reteno de partcula de 99,99%, quando o tamanho das mesmas de 0,3 m (micrmetros). As cabines devem ser submetidas periodicamente manuteno e a trocas dos filtros e o laboratrio deve possuir relatrio da manuteno mantido disposio da fiscalizao do trabalho.
3.2. Barreiras secundrias (infraestrutura laboratorial)

Uma instalao adequada aquela que est de acordo com o funcionamento do laboratrio e com o nvel de biossegurana recomendado para os agentes manipulados no local, atuando tambm como uma barreira de conteno secundria. Para os laboratrios de Nvel de Biossegurana 1 (NB-1) onde so manipulados agentes biolgicos da classe de risco 1 , so recomendados os seguintes critrios para rea fsica:

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Identificao do nvel de Biossegurana e dos microrganismos (Fi-

gura 1).
Separao do laboratrio do acesso pblico. Laboratrio com acesso controlado. Local para armazenar EPIs de uso exclusivo no

Figura 1- Sinalizao

laboratrio.
Paredes, tetos e pisos, impermeveis e resis-

tentes desinfeco.
Autoclave prxima ao laboratrio, para maio-

res informaes veja captulo 2, pgina 87. Nos laboratrios de Nvel de Biossegurana 2 (NB-2), so manipulados microrganismos da classe de risco 2. Alm dos critrios relacionados no risco 1, so recomendados tambm:
Lavatrio para as mos prximo entrada do laboratrio. Torneira com acionamento sem uso das mos. Sistema central de ventilao. Janelas vedadas. Antecmara. Sistema de gerao de emergncia eltrica. Cabine de segurana biolgica (OPS, 2009; CAMPOS, 2003).

Na figura 2, apresentamos um layout de um laboratrio NB-2, onde consta no seu interior uma autoclave que ser utilizada para inativar os resduos gerados durante o experimento para posterior descarte. Constam tambm o lavatrio para lavagem de mos prximo entrada e o cilindro de gs instalado na parte externa, abastecendo atravs de tubulao a estufa de CO 2 que fica dentro do laboratrio.

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Figura 2 Layout de um laboratrio NB-2

Os laboratrios de Nvel de Biossegurana 3 (NB-3) so aqueles onde so manipulados microrganismos de alto risco individual e moderado risco para a comunidade. J nos de Nvel de Biossegurana 4 (NB-4) so manipulados agentes biolgicos com alto risco individual e para a comunidade. Os critrios recomendados para o funcionamento desses laboratrios so bastante complexos e de elevado custo. Para mais esclarecimentos dos laboratrios citados, consulte a documentao do Ministrio da Sade (2006) sobre as diretrizes para o trabalho em conteno com agentes biolgicos.
Princpios 4. Princpios gerais da qualidade em laboratrios

O mundo vive em permanente desenvolvimento e muitas so as atividades cientficas que se apresentam repletas de incertezas. Nesse sentido, coerncia e responsabilidade se fazem necessrias para se reconhecer e tratar com afinco essas questes (CARVALHO, 2008). A busca permanente da qua-

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lidade total nas atividades cientficas remete necessidade de treinamento, aquisio e domnio de conhecimentos para a execuo das atividades com vistas a assegurar a preciso, a validade, a qualidade dos resultados e a manuteno da integridade das pessoas, das instalaes, das mquinas, dos instrumentos e dos equipamentos. As Boas Prticas de Laboratrio (BPL) so definidas pela Organization for Economic Co-operation and Development (OECD) como um sistema da qualidade relativo ao processo organizacional e s condies sob as quais estudos no-clnicos, ou seja, estudos biomdicos no realizados em humanos, referentes sade e meio ambiente, so planejados, realizados, monitorados, registrados, arquivados e relatados (BRASIL, 2009; BRASIL, 2005; BRASIL, 2001). Segundo a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (Anvisa), os princpios das Boas Prticas de Laboratrio so aplicveis em estudos que dizem respeito ao uso seguro de produtos relacionados sade humana, vegetal e animal e ao meio ambiente. Com o intuito de se garantir a aplicao dos princpios das BPL, um dos instrumentos utilizados nos laboratrios so os Procedimentos Operacionais Padro (POP).
um documento que expressa o planejamento do trabalho com vistas a padronizar e minimizar a ocorrncia de desvios na execuo das atividades e assim garantir aos usurios servios ou produtos livres de variaes indesejveis, independentemente de quem as realize. Um procedimento operacional padro tem como meta garantir que a qualidade dos exames seja a mesma em todas as etapas do processo em qualquer momento.

POP

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Cabe aqui uma referncia a um tema que j h algum tempo vem sendo discutido e aplicado em alguns cursos de especializao e atualizao na rea da sade, notadamente na Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio (EPSJV) da Fundao Oswaldo Cruz (Fiocruz). Trata-se da aplicao das boas prticas nas atividades laboratoriais com foco diferenciado das BPL, ou seja, capacitar e ampliar conceitos de profissionais que atuam em laboratrios, no que tange s prticas laboratoriais, com vistas a assegurar: o entendimento dos procedimentos, a busca da preciso, da validade e da qualidade dos resultados e a manuteno da integridade das pessoas, das instalaes, dos equipamentos e dos materiais. Equipamentos, materiais e reagentes Equipamentos de laboratrio requerem condies ambientais apropriadas para o devido funcionamento, alm de locais para instalao livres de interferncias (vibraes, correntes de ar, incidncia de luz solar, umidade e calor) e, no tocante instalao na rede eltrica, devem ser conectados a tomadas adequadamente aterradas (CARVALHO, 1999). No que concerne ao funcionamento, os equipamentos devero ser operados por pessoal capacitado, alm de serem atendidos todos os requisitos que preconizam o manual de operao original ou nos manuais traduzidos para a lngua portuguesa, preferencialmente no POP destinado ao mesmo. Os equipamentos que so responsveis pelo controle das condies ambientais indispensveis para o estudo e a gerao de dados devero ter configurao, capacidade e localizao adequadas. Determinados procedimentos so necessrios para que os equipamentos funcionem a contento e os dados por eles fornecidos sejam capazes de expressar a realidade das amostras analisadas. Os equipamentos devem estar em condies de utilizao e devem seguir um plano rigoroso de validao, quali-

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ficao, calibrao e manuteno. Assim sendo, um sistema que contemple limpeza, inspeo peridica, manuteno preventiva e calibrao ser relevante e necessrio, o que implica, para tal, a utilizao de um POP para cada tarefa. Cabe ainda manter no laboratrio os registros escritos de operao, calibrao, manuteno e demais dados considerados relevantes.
Segundo o Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Industrial (Inmetro, 2000), o conjunto de operaes que estabelece, sob condies especificadas, a relao entre os valores indicados por um instrumento de medio ou sistema de medio ou valores representados por uma medida materializada ou um material de referncia, e os valores correspondentes das grandezas estabelecidos por padres (INMETRO, 2000).

CALIBRAO

Ainda no que tange aos equipamentos cientficos, h de se priorizar os processos de manuteno preventiva (tarefas de manuteno previamente planejadas e desempenhadas, objetivando manter as condies satisfatrias de operao) em detrimento da manuteno corretiva (tarefas de manuteno no-planejadas para restaurar as capacidades funcionais de equipamentos ou sistemas falhados). Os equipamentos, devidamente inclusos em sistemas preventivos de manuteno, certamente tero assegurado uma vida til prolongada e reduo nos custos de manuteno, tendo em vista que determinadas causas so de fcil deteco e podem ser tratadas por meio de manutenes preventivas (COUTO et al., 2003; SANTOS et al., 2007). Quanto aos materiais, esses devem ser de origem conhecida e ter assegurado a sua qualidade. Para tanto, necessrio que se estabeleam procedimentos de controle de fornecedores, ou seja, que seja exigido dos mesmos a

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apresentao de certificados de controle de qualidade. Quanto exigncia aos fornecedores, esses devero apresentar materiais devidamente rotulados com as seguintes informaes: origem, identidade, composio, data de produo, validade, condies de estocagem e informaes de periculosidade (simbologias de risco e de preveno). Exemplos de simbologias de riscos
Os smbolos de segurana so, no Brasil, normatizados pela Associao Brasileira de Normas Tcnicas (ABNT). Servem para lembrar o risco do manuseio do produto, representando nos pictogramas os primeiros sintomas com o contato com a substncia.

TXICO

CORROSIVO

OXIDANTE

EXPLOSIVO

INFLAMVEL

NOCIVO

Exemplos de simbologias de preveno

SUJEITO A QUEDAS

CHOQUE ELTRICO

USO DE CULOS

NO FUMAR

EXTINTOR

MANGUEIRAS

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Quando se trata de armazenamento de materiais, algumas regras devem ser estabelecidas e seguidas a risco, de modo a manter a integridade dos mesmos. Para cada material, dever ser reservado um local definido e identificado, bem como se estabelecer um sistema de identificao e codificao de cada produto. H de se estabelecer tambm um fluxo de movimentao para os materiais de grande porte, pesados e que necessitam de cuidados especiais. Produtos biolgicos e os considerados perecveis devero ser organizados e armazenados em locais apropriados (limpo, sem umidade, protegido de insetos e animais) de modo a no ficar por muito tempo estocado, facilitando assim o seu envelhecimento e a sua deteriorao. Os demais produtos, considerados perigosos (gases explosivos e inflamveis, substncias explosivas, comburentes e radioativas), os produtos qumicos e os solventes inflamveis sero armazenados em local apropriado, devidamente demarcado, livre de interferncia (ambiental e pessoal) e sinalizado. A Norma Regulamentadora 26 do Ministrio do Trabalho e Emprego tem como objetivo fixar as cores que devem ser usadas nos locais de trabalho para a preveno de acidentes, identificando os equipamentos de segurana, delimitando reas, identificando as canalizaes empregadas nas indstrias para conduo de lquidos e gases e advertindo contra riscos. Todo laboratrio deve ser sinalizado de forma a facilitar a orientao dos usurios e advertir quanto aos potenciais riscos presentes no local. A utilizao correta e o respeito sinalizao de segurana so entendidos como barreiras primrias das medidas de conteno. As cores no dispensam o emprego de outras formas de preveno de acidentes e devero ser acompanhadas dos sinais convencionais ou da identificao por palavras.

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VERMELHA

Usada para distinguir e indicar equipamentos e aparelhos de proteo e combate a incndio. Pode ser usada excepcionalmente tambm com sentido de advertncia de perigo, como em botes interruptores de circuitos eltricos para paradas de emergncia, etc. Em canalizaes, deve ser empregada para identificar gases no liquefeitos. Tambm pode ser empregada para indicar cuidado, assinalando, por exemplo, meios-fios, corrimos, cavaletes, etc. Empregada em passarelas e corredores de circulao, localizao de bebedouros, coletores de resduos, reas destinadas armazenagem, zonas de segurana, etc. Ser empregada para indicar as canalizaes de inflamveis e combusteis de alta viscosidade, como leo lubrificante, asfalto, leo combustvel, alcatro, piche, etc. Poder ser usada tambm em substituio ao branco ou combinado a este, quando condies especiais o exigirem. Utilizada para indicar Cuidado!, ficando o seu emprego limitado a avisos contra uso e movimentao de equipamentos, que devero permanecer fora de servios. Ser usada tambm em canalizaes de ar comprimido, colocado em ponto de arranque ou fontes de potncia.

AMARELA

BRANCA

PRETA

AZUL

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VERDE

Caracteriza segurana. Dever ser empregada para indicar canalizaes de gua, localizao de EPI , fontes lavadoras de olhos, dispositivos de segurana, mangueiras de oxignio (soldas oxiacetilnica), etc. Dever ser empregada para identificar canalizaes contendo cidos, faces internas de caixas protetoras de dispositivos eltricos, face externa de polias e engrenagens, etc. Dever ser usada para indicar os perigos provenientes das radiaes eletromagnticas penetrantes de partculas nucleares, como, por exemplo, em porta e aberturas que do acesso a locais onde se manipulam ou armazenam matrias radioativas ou materiais contaminados por radioatividade. Empregada para indicar canalizaes que contenham lcalis. As refinarias de petrleo podem utilizar esta cor para a identificao de lubrificantes. O cinza-claro indica canalizaes em vcuo e o cinza-escuro usado para identificar eletrodutos. Utilizada em canalizaes contendo gases liquefeitos, inflamveis e combustveis de baixa viscosidade (exemplo: leo diesel, gasolina, querosene, leo lubrificante, etc.). Pode ser adotada, a critrio da empresa, para identificar qualquer fluido no identificvel pelas demais cores.

LARANJA

PRPURA

LILS

CINZA

ALUMNIO

MARROM

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A utilizao de cores no dispensa o emprego de outras formas de preveno de acidentes. O uso das cores deve ser feito de modo criterioso, a fim de no ocasionar distrao, confuso e fadiga ao trabalhador.
O Ministrio da Sade recomenda que o smbolo de risco biolgico (Figura 3) seja colocado na entrada do laboratrio, informando tambm o microrganismo manipulado, a classe de risco, o nome do pesquisador responsvel, o endereo e o telefone de contato. Alm disso, deve conter a frase: Proibida a entrada de pessoas no autorizadas. Figura 3 Risco Biolgico Figura 3 Risco Biolgico

H de se considerar a possibilidade de incompatibilidades nos locais de armazenagem dos materiais. Nesse sentido, medidas de controle relativo s condies ambientais devero ser estabelecidas. Materiais que sejam considerados relevantes nas atividades em geral sero analisados periodicamente para garantir a inexistncia de contaminantes que possam comprometer a qualidade dos trabalhos.
5. Agentes de risco em laboratrios

O ambiente laboratorial tem sido considerado insalubre por agrupar atividades que requerem o uso de equipamentos, mquinas, reagentes e materiais diversos, alm de viabilizar muitos procedimentos que oferecem riscos de acidentes e doenas para os usurios em geral. Desse modo, cabe a responsabilidade de se informar, treinar e at mesmo capacitar os sujeitos potencialmente expostos aos riscos, de modo a evitar problemas de sade e prevenir acidentes. Consideram-se riscos ambientais os agentes fsicos, qumicos e biolgicos existentes no ambiente de trabalho, que, dependendo da sua natureza, concentrao ou intensidade e tempo de exposio, so capazes de causar

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danos sade dos trabalhadores (CARVALHO, 1999). No que concerne aos riscos ocupacionais, esses esto diretamente ligados s situaes de trabalho que podem romper o equilbrio fsico, mental e social das pessoas, e no somente as situaes que originem acidentes e enfermidades (NISHIDE e BENATTI, 2004). Quando as medidas de proteo coletiva no so tecnicamente viveis e no permitem a completa proteo ao usurio dos laboratrios contra os riscos de acidentes provenientes do trabalho e/ou de doenas profissionais e do trabalho, o EPI ser utilizado pelo usurio como forma de preveno aos riscos inerentes ao ambiente (CARVALHO, 1999). So considerados riscos ambientais aqueles causados por agentes fsicos, qumicos, biolgicos, ergonmicos e de acidentes que, presentes nos ambientes de trabalho, so capazes de causar danos sade do trabalhador em funo de sua natureza, concentrao, intensidade ou tempo de exposio. A NR-5 classifica os riscos ambientais em cinco grupos: FSICOS QUMICOS BIOLGICOS Rudo, vibraes, presses anormais, temperaturas extremas, radiaes, etc. Poeiras, fumos, nvoas, neblinas, gases, vapores que podem ser absorvidos por via respiratria ou atravs da pele, etc. Bactrias, fungos, bacilos, parasitas, protozorios, vrus, entre outros. Trabalho fsico pesado, movimentos repetitivos, jornada prolongada, postura incorreta, tenses emocionais, monotonia, exigncia de uma maior ateno, responsabilidade e concentrao, jornadas longas de trabalho, treinamento inadequado ou inexistente, conflitos, etc.

ERGONMICOS

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ACIDENTES

Arranjo fsico inadequado, mquinas e equipamentos sem proteo, iluminao inadequada, eletricidade, animais peonhentos, probabilidade de incndio ou exploso, etc.

5.1. Agentes biolgicos de risco

O risco por agente biolgico a probabilidade de um indivduo se contaminar com um agente patognico, como, por exemplo, bactrias, vrus, fungos e parasitas. Todos os profissionais que trabalham em laboratrio com agentes ou materiais biolgicos devem estar conscientes dos riscos inerentes a essa atividade e conhecer profundamente o agente e os procedimentos para minimizar o risco de contaminao. Alm disso, as boas condutas de laboratrio devem ser estritamente seguidas de modo a evitar que um procedimento realizado de maneira incorreta ou mesmo displicentemente coloque em risco a segurana do(s) profissional(is) e do ambiente (BRASIL, 2006; TEIXEIRA, 2000). O manual de Biossegurana da Fiocruz (2005) descreve como regra bsica para o trabalho em laboratrio:
Considerar todo material biolgico como infeccioso; Trabalhar com ateno e sem tenso; Sinalizar o risco do agente na entrada do laboratrio; Notificar os acidentes e imediato cuidado mdico.

Alm disso, todo pessoal de laboratrio deve evitar trabalhar sozinho com material infeccioso; ser protegido por imunizao quando disponvel; manter o laboratrio limpo e arrumado; usar roupas protetoras, tais como uniformes, aventais, jalecos e mscaras; usar luvas; no aplicar cosmticos; evitar uso de lentes de contato; lavar as mos aps a manipulao de materiais

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contaminados; nunca pipetar com a boca; no fumar, no comer e no beber no laboratrio; descontaminar a superfcie de trabalho, etc. Outra atividade que requer cuidados especiais o cultivo de microrganismos. Lembre-se de que quando se cultiva um microrganismo visa-se a obter uma quantidade grande de clulas e, por isso, o trabalhador deve estar atento as suas condutas para evitar acidentes. O trabalhador deve abrir cuidadosamente os tubos e frascos, identificados claramente, que contm o agente evitando agit-los. Sempre se deve manipular os tubos, as pipetas e as seringas com as extremidades em direo oposta a si. Os sobrenadantes ou o contedo de pipetas devem ser desprezados sobre material absorvente embebido em desinfetante contido em um frasco de boca larga para evitar a produo de aerossis. Se a atividade laboratorial envolver a infeco de animais de laboratrio, o trabalhador deve tomar os seguintes cuidados: inicialmente, considerar como potencialmente infectado todo animal, seja ele vertebrado ou invertebrado; equipamentos de proteo devem ser utilizados durante o procedimento de inoculao; seringas e agulhas utilizadas durante a inoculao devem ser descartadas em caixas coletoras apropriadas e autoclavadas ao final do procedimento; identificar as gaiolas dos animais com todas as informaes relevantes (nmero de animais, linhagem, sexo, idade, peso, data da infeco, microrganismo inoculado, via e dose de inoculao e nome e telefone do pesquisador responsvel); durante a limpeza da cama e das gaiolas dos animais, equipamentos de proteo individual devem ser utilizados para minimizar o risco de contaminao; autoclavar todos os materiais que tiveram contato com os animais infectados; notificar todo e qualquer acidente/incidente proveniente do manuseio dos animais ou das gaiolas.

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5.1.1. Classificao de risco dos microrganismos

Os agentes biolgicos so classificados de acordo com o risco que oferecem ao trabalhador e coletividade. Assim, segundo o Ministrio da Sade (2006), os microrganismos so classificados quanto ao risco como:
Classe de risco 1

Microrganismo que representa baixo risco individual e para a coletividade. Inclui os agentes biolgicos conhecidos por no causarem doenas em pessoas ou animais adultos sadios. Exemplo: Bacillus subtilis, e os agentes no includos nas classes de risco 2, 3 e 4 e que no demonstraram capacidade comprovada de causar doena no homem ou em animais sadios. Vale lembrar que a no classificao de agentes biolgicos nas classes de risco 2, 3 e 4 no implica na sua incluso automtica na classe de risco 1. Para isso dever ser conduzida uma avaliao de risco, baseada nas propriedades conhecidas e/ou potenciais desses agentes e de outros representantes do mesmo gnero ou famlia.
Classe de risco 2

Microrganismo que representa moderado risco individual e limitado risco para a comunidade. Inclui os agentes biolgicos que provocam infeces no homem ou nos animais, cujo potencial de propagao na comunidade e de disseminao no meio ambiente limitado, e para os quais existem medidas teraputicas e profilticas eficazes. Exemplo: Schistosoma mansoni.
Classe de risco 3

Microrganismo que representa alto risco individual e moderado risco para a comunidade. Inclui os agentes biolgicos que possuem capacidade de transmisso por via respiratria e que causam patologias humanas ou animais, potencialmente letais, para as quais existem usualmente

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medidas de tratamento e/ou preveno. Representam risco se disseminados na comunidade e no meio ambiente, podendo se propagar de pessoa a pessoa. Exemplo: Bacillus anthracis.
Classe de risco 4

Microrganismo que representa alto risco individual e para a comunidade. Inclui os agentes biolgicos com grande poder de transmissibilidade por via respiratria ou de transmisso desconhecida. At o momento no h qualquer medida profiltica ou teraputica eficaz contra infeces ocasionadas por estes. Causam doenas humanas e animais de alta gravidade, com grande capacidade de disseminao na comunidade e no meio ambiente. Esta classe inclui principalmente os vrus. Exemplo: vrus ebola. O Ministrio da Sade descreve ainda uma classe de risco adicional chamada de Classe de Risco Especial. Ela rene os microrganismos que representam alto risco de causar doena animal grave e de disseminao no meio ambiente. Inclui agentes biolgicos de doena animal no existentes no pas e que, embora no sejam obrigatoriamente patgenos de importncia para o homem, podem gerar graves perdas econmicas e/ou na produo de alimentos. Como os microrganismos podem acidentalmente penetrar no hospedeiro? Segundo Sewell (1995), os profissionais de laboratrio microbiolgico esto submetidos a um grande risco de se contaminar durante as suas atividades. Isso se deve a fatores que incluem o modo de transmisso do agente, o desenvolvimento da infeco no hospedeiro, a via e a fonte de infeco e o ambiente laboratorial (ventilao, equipamentos e procedimentos).

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As vias de penetrao dos agentes biolgicos podem ser:


Area Em geral, essa via est relacionada com a produo de

aerossis. Os aerossis se formam dependendo da atividade realizada, como macerao de tecidos, centrifugao, pipetagem, sonicao, agitao de suspenses celulares, abertura de ampolas liofilizadas, flambagem de ala de platina etc. Uma vez formados, os aerossis podem ficar em suspenso e propagar-se distncia contaminando vrios profissionais pela inalao dos mesmos.
Oral A ingesto de microrganismos com maior frequncia ocorre

atravs de pipetagem com a boca, porm, outras formas de contaminao tambm so descritas, como levar boca itens do laboratrio (por exemplo, canetas e lpis) e consumir alimentos e bebidas no local de trabalho, fumar e falta de procedimentos higinicos (lavagem de mos). Outra forma de infeco refere-se s projees de gotculas na boca.
Cutnea Acidentes com inoculao parenteral de material infeccioso

correspondem a uma das principais causas de contaminao do profissional de laboratrio. O microrganismo pode penetrar atravs da pele aps ferimento com agulhas, lminas de bisturi ou vidraria quebrada contaminadas. Outra forma de contaminao por essa via a mordida ou o arranho de animais e ainda picada de insetos.
Ocular A contaminao da conjuntiva pode ocorrer por deposio

de gotculas de suspenses celulares ou mesmo por aerossis de material infectante nos olhos.
5.1.2. Biossegurana no trabalho com os agentes biolgicos

Vrus

Os vrus so transmitidos de um hospedeiro a outro de vrias maneiras. Podemos destacar o contato direto atravs das vias respiratrias, pelo

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contato sexual, por alimentos e gua, pelo contato com sangue e seus derivados. O profissional de laboratrio ou aquele que lida com pacientes est submetido a um significativo risco de contaminao por via respiratria. Assim sendo, esses profissionais devem ter pleno conhecimento dos riscos durante a manipulao dos espcimes clnicos e dos pacientes, levando em considerao as boas prticas de laboratrio e as operaes que envolvem a produo de aerossis para preveno das infeces por esses agentes.
Bactrias

As bactrias podem ser transmitidas ao profissional de laboratrio por diferentes processos. A produo de aerossis e consequente inalao dessas pequenas partculas , sem dvida, a principal via de contaminao. No entanto, existem outras atividades que mal realizadas podem levar o profissional a adquirir uma infeco associada ao laboratrio, como pipetagem, flambagem de ala bacteriolgica, descarte de resduos ou amostras clnicas etc. O uso de equipamentos de proteo e boas prticas de laboratrio minimizam os riscos de infeco.
Fungos

Os fungos produzem estruturas denominadas esporos que facilmente ficam em suspenso no ar. Dessa forma, aquele que trabalha em um laboratrio manipulando fungos est submetido a um grande risco de se expor a uma infeco mictica. As principais vias de contaminao no laboratrio, comprovadas por levantamentos realizados sobre infeces associadas ao laboratrio, esto relacionadas inalao de partculas fngicas, carreadas por aerossis formados durante procedimentos laboratoriais e por injrias causadas por agulhas ou instrumentos perfurocortantes.

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Parasitas

Infeces adquiridas em laboratrio por parasitas como Ascaris spp., Strongyloides spp., Enterobius spp. , Fasciola spp., Shistosoma spp., Giardia lamblia e Cryptosporidium parvum no tm sido relatadas com frequncia em laboratrios clnicos (SEWELL, 1995). Casos de giardase e criptosporidase so mais comuns em profissionais que manuseiam animais infectados. No h registro de infeces associadas ao laboratrio com cestdeos. Os parasitas mais comumente relacionados contaminao durante atividade laboratorial so Toxoplasma gondii, Plasmodium spp., Trypanosoma spp. e Leishmania spp. De um modo geral, o risco de se infectar com esses agentes a autoinoculao com seringas e agulhas contaminadas, contato de formas infectantes com leses de pele ou mucosa ou, ainda, por mordedura de animais infectados. No podemos descartar a contaminao por via oral de algumas formas infectantes presentes em material fecal. Como inativar os agentes biolgicos? Em se tratando de risco biolgico, o procedimento adequado para inativar os resduos e as aes a serem tomadas em caso de acidentes so extremamente relevantes. Durante o descarte e a retirada do material biolgico da rea laboratorial, o microrganismo deve ser inativado por agentes qumicos ou fsicos antes de exp-lo ao contato externo ao laboratrio e desinfetar as superfcies de trabalho antes e aps qualquer procedimento.

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Agentes qumicos para inativar os agentes biolgicos (Fiocruz, 2005)

lcool a 70%

Parasitas, bactrias e retrovrus.

Formol a 4%

Parasitas, bactrias, fungos e vrus.

Cloro ativo a 1%

Parasitas, bactrias, fungos e vrus.

Agentes fsicos para inativar os agentes biolgicos (Fiocruz, 2005)

Calor mido Autoclavao por 30min. a 120C

Parasitas, bactrias, fungos, vrus, inclusive as formas vegetativas e esporuladas de bactrias e fungos.

Incinerao

Destruio de carcaas de animais e resduos previamente autoclavados.

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5.2. Agentes qumicos de risco

No que concerne aos reagentes qumicos, h de se estabelecer critrios rigorosos para a armazenagem, movimentao, uso nas atividades e resduos gerados oriundos dos trabalhos. Tambm ser relevante que os fornecedores disponibilizem todas as informaes sobre a segurana para o produto qumico adquirido. Normalmente, os produtores/fornecedores disponibilizam as Fichas de Informaes de Segurana de Produto Qumico (FISPQ) e essas devero, obrigatoriamente, estar em local acessvel a todos os trabalhadores nos seus locais de trabalho. Alm disso, de extrema importncia que seja incentivada a leitura dessas fichas por todos os que transportam, armazenam, manuseiam os produtos e recolhem os resduos qumicos. As FISPQ contm informaes diversas sobre um determinado produto qumico (substncias ou misturas) quanto proteo, segurana, sade e ao meio ambiente e aes em situao de emergncia. Em alguns pases, essa ficha chamada de Material Safety Data Sheet (MSDS). Ainda com relao aos produtos qumicos, estes podem exercer impacto negativo sobre a sade dos homens e dos animais e afetar sobremaneira o meio ambiente quando as medidas preventivas no so adotadas. Os produtos qumicos, devido s suas caractersticas, podem afetar os trabalhadores de formas variadas, desde leves processos alrgicos at o cncer (COSTA e FELLI, 2005). A diversidade de atividades no ambiente de trabalho promove diversos efeitos sobre a sade do trabalhador, que, na maioria das vezes, no conhece as caractersticas dos produtos qumicos no que tange ao grau de toxicidade, inflamabilidade, corrosividade, explosividade e demais riscos de periculosidade (CARVALHO, 2006).

Biossegurana e boas prticas laboratoriais

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Quanto s caractersticas dos produtos, esses podem ser: carcinognicos (causam cncer); corrosivos (desgastam ou modificam); irritantes (produzem irritaes); txicos (causam envenenamento e/ou morte); teratognicos (causam deformaes); mutagnicos (causam mutaes); alergnicos (causam reaes alrgicas); ionizantes (causam cncer e outras doenas); explosivos (causam exploses); e espontaneamente combustveis (causam incndios e exploses). Outros fatores podero contribuir para afetar a qualidade dos resultados dos trabalhos, alm de atuarem como provveis geradores de acidentes, quando esto presentes envolvendo produtos qumicos: As condies eltricas, eletrnicas e mecnicas dos equipamentos (ausncia de manuteno preventiva e manuteno corretiva deficiente); os hbitos do operador no que concerne desateno e negligncia frente s atividades potencialmente de risco; a no observncia de normas; o excesso de material sobre a bancada de trabalho; a ausncia de cabines de segurana qumica; a desordem nos laboratrios (ausncia de organizao); e a ausncia de polticas de administrao de resduos. Com o intuito de minimizar ao mximo e at mesmo eliminar a possibilidade de acidentes graves nos laboratrios que trabalham com produtos qumicos e demais materiais combustveis, comburentes, inflamveis e explosivos, cabem algumas recomendaes quanto s aes preventivas para controle de incndios em reas crticas de trabalho. A ausncia de cuidados no que concerne preveno de incndios poder gerar situaes extremamente graves. Pequenos focos de fogo requerem a ao imediata de pessoal capacitado, de modo a intervir adotando todas as medidas apropriadas e para controlar a situao. Assim sendo, todos os equipamentos de combate a incndios devero estar disponveis para o combate ao fogo nos seus primeiros momentos.

58 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

O fogo j acompanha o homem desde os tempos remotos e proporciona inmeros benefcios. Acontece que o fogo, quando foge do controle do homem, se transforma em um incndio e provoca estragos no s para as pessoas, mas tambm para os animais, as instalaes prediais e o meio ambiente. O fogo tambm entendido como o produto de uma reao qumica denominada combusto, que produz luz e calor ou somente calor e, para que ocorra, necessita de quatro elementos bsicos: calor, combustvel, oxignio e reao em cadeia. Esses quatro elementos reunidos formaro uma figura geomtrica conhecida por tetraedro. Assim, para o entendimento do que um incndio, preciso conhecer o tetraedro do fogo (Figuras 4 e 5). Figura 4 Representao do tetraedro do fogo

Figura 5 Representao do tetraedro do fogo expandido


Combustvel: o elemento que serve de propagao do fogo. Tem a propriedade de queimar e pode ser slido, lquido ou gasoso. Reao em cadeia: torna a queima autossustentvel. O calor irradiado das chamas atinge o combustvel e este decomposto em partculas menores, que se combinam com o oxignio e queimam, irradiando outra vez calor para o combustvel, formando um ciclo constante. Oxignio: tambm chamado de comburente. Em propores adequadas (+ de 15%), combina com o material combustvel, dando incio ao fogo. O oxignio est presente no ar que nos envolve.

Calor: elemento que serve para dar incio a um incndio. O calor pode ser obtido pela transformao das energias mecnica, qumica e eltrica. O calor mantm e aumenta a propagao.

Biossegurana e boas prticas laboratoriais

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Classe de incndio Os materiais combustveis tm caractersticas diferentes e, portanto, queimam de modos diferentes. Conforme o tipo de material, existem quatro classes de incndios, a saber:
CLASSES DE INCNDIO Classe B Classe C Classe D

Classe A

Classe K

Assim identificado o fogo em materiais slidos que deixam resduos, como madeira, papel, tecido e borracha.

Quando a queima acontece em lquidos inflamveis, graxas e gases combustveis.

Classe de incndio em equipamentos eltricos energizados. A extino deve ser feita por agente extintor que no conduza eletricidade.

Fonte: <www.casaolivetti.com.br/classes.html>.

Classe de incndio, que tem como combustvel os metais pirofricos, como magnsio, selnio, antimnio, ltio, potssio, alumnio fragmentado, zinco, titnio, sdio, urnio e zircnio.

Classificao do fogo em leo vegetal e gorduras de origem animal, em cozinhas.

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Caractersticas de agentes extintores de incndios


AGENTE CLASSE DE INCNDIO VANTAGENS

gua (em jato ou pulverizada)

Deve ser usada sempre que no haja contraindicaes (de preferncia, deve ser pulverizada). Tem bom poder de penetrao. No deixa resduo, o que a torna mais adequada para equipamento sensvel. A mais indicada para lquidos extremamente inflamveis Muito boa para lquidos extremamente inflamveis. Pode ser utilizada em situaes de incndio iminente com ao preventiva. A cobertura de espuma evita reignies. Muito boa para lquidos extremamente inflamveis. A cobertura de espuma evita reignies.

Neve carbnica (extintor com dixido de carbono sob presso que solidifica quando se expande bruscamente) Espuma fsica (produzida a partir de uma mistura de gua e substncias tensioativos por injeo mecnica de ar) Espuma qumica (extintor em que ocorre uma reao que liberta o gs dixido de carbono que fica disperso em um lquido formando espuma) P normal (extintor em que o p bicarbonato de sdio ou de potssio)

BC

AB

AB

BC

Forma uma nuvem de poeira que protege o operador.

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P polivalente (extintor em que o p dihidrogenofosfato de amnio P especial (extintor em que o p grafite ou cloreto de sdio ou p de talco etc.) Areia

ABC

Forma uma nuvem de poeira que protege o operador. Atende a trs classes de fogos. nico extintor adequado para incndios da classe D. Qualquer outro tipo de extintor provoca reaes violentas. Por vezes, o nico meio de extino disponvel para incndios da classe D. Ao se considerar a segurana do pessoal que trabalha em cozinhas e restaurantes, o extintor classe K o mais fcil de ser utilizado. Atua por formao de neblina e o fogo extinto por resfriamento e pelo efeito asfixiante da espuma.

AD

Soluo especial (extintor em que o acetato de potssio se encontra diludo em gua)

Procedimentos quanto s medidas preventivas sero de responsabilidade de todos os funcionrios, de frequentadores dos laboratrios (pessoal de manuteno, estudantes e estagirios) e daqueles que so usurios das instalaes prediais. No que tange s medidas preventivas, algumas so descritas a seguir:
No jogue resduos de produtos qumicos no cesto de lixo comum do

laboratrio. A possvel incompatibilidade dos resduos com outros materiais existentes no cesto (papel, pano, barbante, plstico, etc.) ser uma condio favorvel para o incio do fogo.

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No jogue palitos de fsforos, utilizados para o acendimento de bicos

de gs (Bunsen), diretamente no lixo. Antes de lanar no cesto, molhe o mesmo para se certificar de que no oferece perigo.
No acenda chamas (fsforos, isqueiros, velas, etc.), a no ser que

seja necessrio e com o conhecimento e consentimento do professor ou do monitor da aula.


No caso de falta de energia eltrica no laboratrio, jamais utilize velas,

fsforos e isqueiros para iluminar o ambiente. D preferncia s lmpadas de emergncia ou lanternas de pilhas.
Evite ao mximo o acmulo de lixo em locais no apropriados. Os materiais de limpeza devero ser acondicionados em recipientes

prprios, devidamente identificados e em locais apropriados.


Mantenha desobstrudas as reas de escape e no deixe, mesmo que

provisoriamente, materiais nas escadas e nos corredores.


Mantenha todos os equipamentos eltricos desligados aps a utiliza-

o, desconectando-os das tomadas.


No conecte ou desconecte equipamentos com as mos molhadas. No cubra fios eltricos com livros, cadernos, jalecos e outros materi-

ais que possam servir de combustvel em caso de superaquecimento. No caso da corrente eltrica estar acima da capacidade da fiao, ocorrer o superaquecimento dos fios.
Ao utilizar materiais inflamveis, d preferncia s quantidades mni-

mas, armazenando os frascos na posio vertical, em local apropriado (longe de fontes de calor) e na embalagem original.
Observe sempre as normas de segurana ao manipular gases, inflam-

veis e explosivos. No utilize chamas ou aparelhos superaquecidos prximos a esses tipos de materiais.

Biossegurana e boas prticas laboratoriais

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No improvise instalaes eltricas, nem efetue consertos em tomadas,

interruptores e equipamentos sem que esteja familiarizado com isso.


No sobrecarregue as instalaes eltricas com a utilizao do plugue

tipo T (benjamins). Tomada quente sinnimo de desperdcio e indicao de perigo (possibilidade de fogo).
No permita o uso de extenses, principalmente se essas forem em-

pregadas para ligar diversos equipamentos. Os equipamentos devero ter a sua tomada (macho) conectada tomada (fmea) adequada e devidamente aterrada.
No permita que os fios e cabos sejam emendados. Elimine a possibi-

lidade de utilizar fios e cabos descascados e estragados. Todas as atividades em que o uso da eletricidade necessrio requerem cuidados extremos, principalmente daqueles que esto se iniciando na vida cientfica. A observncia das normas de segurana fundamental, de modo a no se permitir que uma pessoa receba uma descarga eltrica, a qual muitas das vezes poder ser fatal. De tempos em tempos, faa uma reviso nos fios dos aparelhos eltricos e na instalao eltrica do seu ambiente de trabalho, devidamente assessorado por um profissional capacitado. No caso de um equipamento do laboratrio apresentar qualquer defeito, no pense duas vezes para providenciar o conserto.
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Questes para reflexo

1. O ato de jogar na pia de um laboratrio resduos de substncias qumicas ou materiais biolgicos pode ser considerado uma ao antitica? Por qu? 2. Em um laboratrio micolgico de anlises clnicas, trabalhavam um farmacuticobioqumico com grau de doutor (responsvel pelo laboratrio) e dois tcnicos de nvel mdio e um auxiliar de servios tcnicos. O laboratrio realizava diagnstico clnico micolgico de material (sangue, escarro, unha, raspado de pele, cabelo, etc.) suspeito de conter fungos patognicos para o homem. O espao fsico era pequeno, com muitos equipamentos antigos sem manuteno preventiva. O responsvel pelo laboratrio solicitou ao tcnico que providenciasse o exame ao microscpio e a semeadura do escarro, que havia chegado de um paciente com suspeita de paracoccidioidomicose, na tentativa de visualizao e isolamento do fungo Paracoccidioides brasiliensis. O trabalho de rotina no laboratrio era realizado em uma cabine de fluxo laminar horizontal, que havia sido herdada do setor de preparo de meios de cultura e testes de esterilidade. Porm, quando a cabine estava ocupada, o trabalho era feito em bancada na frente de um bico de Bunsen. O tcnico ento preparou lminas e meio de cultura para a semeadura. Durante o trabalho, o tcnico, utilizando a cabine como um equipamento de proteo, usava luvas, mscaras cirrgicas e jalecos de mangas curtas. Durante o manuseio do material, o tcnico acidentalmente se feriu com a ala de platina contendo material clnico suspeito (fungo). Imediatamente comunicou o fato ao responsvel do laboratrio, que o orientou a buscar atendimento mdico. Fazendo uma anlise crtica da situao exposta acima: 2.1 Descreva as principais causas relacionadas ao acidente descrito no laboratrio. 2.2 Cite os erros cometidos por cada profissional do laboratrio que poderiam estar relacionados direta ou indiretamente ao acidente. 2.3 Faa uma anlise crtica do ocorrido levando em considerao a estrutura do laboratrio, a classe de risco do microrganismo envolvido e os equipamentos de proteo utilizados. 3 Quais so as exigncias para que um laboratrio esteja em conformidade com as normas, regras e princpios preconizados pelas boas prticas de laboratrio, no que tange instalao de balanas analticas e demais equipamentos de preciso, com vistas obteno de resultados confiveis?

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Captulo 2
Conceitos e tcnicas bsicas aplicadas em laboratrio
Maria Beatriz Siqueira Campos de Oliveira Joseli Maria da Rocha Nogueira

A preocupao com a organizao do laboratrio e a disposio, o funcionamento e a manuteno dos equipamentos um tpico que deve constar na lista de prioridades do tcnico de laboratrio da rea da sade. O entendimento de alguns conceitos bsicos prprios da rea importante, bem como o conhecimento dos tipos de vidrarias, dos equipamentos e das metodologias aplicadas nos laboratrios. Dessa forma, a interdisciplinaridade uma tnica na rea laboratorial que deve ser enfatizada pelos profissionais no intuito de atender a legislao vigente, as boas prticas de laboratrio e as normas de biossegurana. Nessa perspectiva, as instalaes, a infraestrutura e o layout do laboratrio devem ser cuidadosamente planejados para aumentar a segurana dos profissionais, a vida til e o bom funcionamento dos equipamentos e a qualidade dos ensaios. O primeiro cuidado atender as normas de Biossegurana (ver captulo 1): verificar que as portas abram para fora, para facilitar a sada em casos de

68 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

emergncia, instalar chuveiros e lava-olhos em pontos estratgicos, observar os espaos entre os equipamentos que trabalham com compressor para evitar aquecimento dos mesmos e instalar deionizador ou desmineralizador em salas separadas, uma vez que a regenerao das resinas poder oxidar superfcies metlicas. O projeto de infraestrutura e de iluminao dos laboratrios deve ser elaborado de acordo com as boas prticas de laboratrio ou de produo, dependendo da utilizao dos mesmos. Sendo assim, laboratrios de produo tm um maior rigor de exigncia apresentando os cantos das paredes arredondados, superfcies feitas com material limpvel (tinta epxi, por exemplo), luminrias lacradas com troca de lmpadas pela parte superior do teto. Os aparelhos de ar condicionado e seus filtros tambm requerem ateno especial. Como j mencionado cada tipo de laboratrio de sade vai demandar diferentes necessidades de acordo com as atividades desenvolvidas. O laboratrio de anlises clnicas ou biodiagnstico, por exemplo, exige uma sala separada para coleta e recepo de material biolgico. Alm disso, um cuidado especial deve ser dado aos pronturios, as fichas que acompanham os referidos materiais e a rotulagem das amostras, visto que qualquer erro nessa etapa pode acarretar prejuzos graves. Alm desses itens, outras padronizaes devem ser consideradas para qualquer laboratrio, como tubulaes pintadas com as cores indicadas pela Associao Brasileira de Normas Tcnicas (ABNT/NBR-6493/out. 1994): ALARANJADO produtos qumicos no gasosos (ex.: soda custica) AMARELO gases no liquefeitos (ex.: amnia, oznio) AZUL ar comprimido BRANCO vapor CINZA-CLARO vcuo

Conceitos e tcnicas bsicas aplicadas em laboratrios

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CINZA-ESCURO eletroduto, painis eltricos COR DE ALUMNIO gases liquefeitos inflamveis, combustveis de baixa viscosidade (ex.: diesel, gasolina, querosene, lubrificantes, solventes) MARROM canalizao materiais fragmentados (minrio bruto), petrleo bruto PRETO combustveis de alta viscosidade (ex.: leo combustvel/BPF, asfalto, piche) VERDE EMBLEMA gua, exceto a de combate a incndios VERMELHO gua e outras substncias destinadas a combater incndio Observaes: Embora no conste na NBR, de uso comum distinguir a gua potvel com a cor verde-claro (verde-claro/verde Nilo) da gua de uso industrial com a cor verde emblema. A cor marrom, como no caso citado, utilizada para pintura de tubulao de guas servidas, isto , no de esgoto sanitrio (ex.: gua de descarte em mquinas lavadoras, de ralos e de pias). Importante: a tubulao de inox dever ser pintada com anis no meio de cada seo reta e nas extremidades (iniciais e finais) das linhas. Outros pontos que merecem ateno ao se elaborar as instalaes do laboratrio so a localizao e os procedimentos relacionados aos gases comprimidos, principalmente os gases acondicionados em cilindros. Dessa forma, devem ser observados os seguintes cuidados:
Em cilindros contendo gases fortemente oxidantes, as vedaes jamais

devero ser lubrificadas com graxa, leo ou glicerina.


Somente use cilindros quando estiverem equipados com vlvulas de

reduo.

70 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Ao transportar cilindros deve-se, sempre, ter o cuidado de fechar a

vlvula de sada e nunca esquecer de usar a capa de proteo da vlvula e um carrinho apropriado para transporte.
Nunca esquea os cilindros soltos no laboratrio. Nunca coloque cilindros prximos a fontes de calor ou chama direta.

A temperatura da rea de estocagem no pode ultrapassar 40oC.


Antes de iniciar o trabalho, deve-se verificar a existncia de vazamen-

to, por meio de soluo de gua com sabo.


Cilindros vazios devem ser etiquetados e estocados em reas

separadas.
Gs Hidrognio Sulfeto de hidrognio Nitrognio Oxignio Dixido de carbono Propano Butano Acetileno Risco Fogo, exploso Fogo, irritante, txico Asfixia Fortemente reativo Asfixia e queimadura Fogo, asfixia, exploso Fogo, exploso Fogo, exploso

Em relao s instalaes do laboratrio, devemos considerar um local dedicado ao processo de lavagem e esterilizao, que podero estar contguos ou separados. Neste local ficaro os destiladores ou outro tipo de gua purificada por ultrafiltrao, autoclaves, fornos e geradores de vapor limpo. Devem ser projetados, tambm, uma bancada de ao inox com tanques para lavagem, alm de bancadas onde os materiais sero embalados para esterilizao. Devem estar previstas no projeto tomadas de 110 e 220 volts. Em

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alguns casos, a instalao eltrica deve possuir um disjuntor para cada equipamento, como, por exemplo, a autoclave.
1. Conceitos bsicos 1.1. Desinfeco por agentes qumicos: Limpeza

a remoo da sujidade de qualquer superfcie, reduzindo o nmero de microrganismos. Esse procedimento deve ser obrigatoriamente realizado antes da esterilizao ou desinfeco. Para cada laboratrio deve existir uma padronizao do processo de limpeza, incluindo tipo de gua utilizada (ver item 2 tratamento de gua), sabo e detergente neutro. Deve-se evitar produtos base de cidos forte e oxidante (por exemplo, soluo sulfocrmica) com o objetivo de no causar danos ao solo e ao lenol fretico. Outro cuidado importante a preocupao com o que est sendo jogado nas pias e nos ralos dos laboratrios, pois os restos de meio de cultura, reagentes e corantes que so descartados sem tratamento vo causar danos, s vezes irreversveis ao meio ambiente.
Assepsia

Conceito desenvolvido pelo mdico hngaro Ignaz Semmelweis, em 1851. o conjunto de medidas preventivas que permitem manter um ser vivo ou um meio inerte, isento de microrganismos, evitando a introduo de um contaminante em ambiente ainda no contaminado ou que j foi controlado. Normalmente se utiliza o termo tcnicas asspticas. Em um centro cirrgico ou numa sala limpa de envase de vacinas, por exemplo, deve ser adotado um conjunto de medidas asspticas para se evitar levar microrganismos para aquele local o que causaria contaminao do ambiente.

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Antissepsia

Refere-se desinfeco de tecidos vivos com antisspticos (agentes qumicos), eliminando ou inibindo as formas vegetativas dos microrganismos. Os antisspticos so encontrados no mercado em vrias apresentaes, tais como: soluo, pomada, talco e creme. Em relao classificao dos materiais hospitalares, temos: Materiais crticos Materiais que entram em contato com vasos sanguneos e tecidos livres de microrganismos. O material crtico deve ser esterilizado. Ex.: instrumentais. Materiais semicrticos Materiais que entram em contato com mucosa e pele no ntegra. Esses materiais devem ser esterilizados ou desinfetados de acordo com a necessidade de utilizao. Ex.: inaladores. Materiais no-crticos Materiais que entram em contato com a pele ntegra. Esses materiais devem ser lavados de acordo com o procedimento operacional padronizado e desinfetados, se for necessrio. Ex.: comadre.
Desinfeco

um processo que reduz o nmero de microrganismos, eliminando grande parte dos contaminantes existente em um local ou material. Atua sobre as formas vegetativas, sem atingir necessariamente os esporos. A desinfeco pode ser realizada por meios fsicos ou qumicos e est indicada para materiais semicrticos e no-crticos. Em relao desinfeco de superfcies, devemos sempre partir do local menos contaminado para o mais contaminado. Outra atividade bsica a troca, sempre que possvel, do pano utilizado para a aplicao do desinfetante como, por exemplo, entre bancadas e cho. Alm disso, o nvel de desinfeco depender de variveis como temperatura, tem-

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po e concentrao de germicidas adicionados no processo. Pode ser de alto nvel, intermedirio ou baixo. Desinfeco de baixo nvel so inativadas as bactrias em forma vegetativa, alguns vrus e alguns fungos. O Mycobacterium tuberculosis, os esporos bacterianos, o vrus da hepatite B (HBV) e os vrus lentos sobrevivem. Ex.: lcool etlico e isoproplico, hipoclorito de sdio (100 ppm), fenlicos, quaternrio de amnia. Obs.: tempo de exposio < ou = a dez minutos. Desinfeco de mdio nvel alm dos microrganismos destrudos na desinfeco de baixo nvel so atingidos o Mycobacterium tuberculosis, a maioria dos vrus (inclusive o HBV) e a maioria dos fungos. Ainda sobrevivem o Mycobacterium intracelulare, os esporos bacterianos e os vrus lentos. Ex.: lcool etlico e isoproplico (70 a 90%), fenlicos, hipoclorito de sdio (100 ppm), pasteurizao 75oC a trinta minutos. Obs.: depende da concentrao e/ou do perodo de exposio. Desinfeco de alto nvel resistem apenas alguns tipos de esporos bacterianos mais resistentes e os vrus lentos. Ex.: glutaraldedo, soluo de perxido de hidrognio, hipoclorito de sdio (1.000 ppm), cloro e compostos clorados, cido peractico, orthophtalaldedo, gua superoxidada, pasteurizao 75oC a trinta minutos. Obs.: tempo de exposio > ou = vinte minutos. Caractersticas ideais de um agente desinfetante: amplo espectro; ao rpida; no ser afetado por fatores ambientais (ex.: luz); deve ser ativo na presena de matria orgnica;

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ser compatvel com sabes, detergentes e outros produtos qumicos; atxico (no deve ser irritante para o usurio); compatvel com diversos tipos de materiais (no corrosivo em superfcies metlicas e no deve causar deteriorao de borrachas, plsticos e outros materiais); efeito residual na superfcie; fcil manuseio; inodoro ou de odor agradvel; econmico; solvel em gua; estvel em concentrao original ou diludo; no poluente. Efeitos dos agentes qumicos nas bactrias: Os diferentes agentes qumicos, chamados germicidas, quando contidos nas preparaes qumicas, podem produzir ao bactericida ou ao bacteriosttica: Ao bactericida O agente qumico tem a propriedade de eliminar as bactrias. uma ao irreversvel porque a bactria morta, mesmo que o agente qumico seja removido, no mais capaz de se reproduzir. Ao bacteriosttica O agente qumico tem a propriedade de inibir a multiplicao das bactrias. Quando o agente qumico removido, a multiplicao retomada. Principais desinfetantes: lcool O valor do lcool como germicida foi recentemente revisto, uma vez que o lcool tem mais ao fixadora do que

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desinfetante, dependendo de sua concentrao. Os alcois etlico e isoproplico so bactericidas intermedirios e rpidos, alm de serem notadamente efetivos contra o bacilo da tuberculose, porm no so esporicidas. conveniente usar uma s concentrao de lcool em todo o hospital, sendo a concentrao ideal de 70% de peso por volume, visto que a de 60% tem sua atividade bem diminuda. Os alcois evaporam-se rapidamente, coagulam protenas e so solventes orgnicos. Apesar da rpida evaporao, tm a vantagem de no deixar resduos em superfcies. So necessrias repetidas aplicaes com lcool a 70% para se conseguir a ao adequada. Todavia sua utilizao pode danificar componentes de alguns instrumentais, ressecar artigos de borracha e branquear a cobertura asfltica dos pisos. Deve-se evitar exposies por mais de dez minutos na pele por poder causar irritao, apesar de nesse espao de tempo alcanar toda sua atividade desinfetante considerando sua extraordinria capacidade germicida e bactericida, o etanol a 70% pode ser usado em itens semicrticos e no-crticos. Compostos de cloro O cloro inorgnico, apesar de econmico, tem uso limitado, no podendo ser extensivamente usado devido ao seu poder oxidante em vrias superfcies, principalmente metais. Apesar disso, a tradicional soluo de hipoclorito de sdio a 2% um dos melhores e mais antigos germicidas para desinfeco local. Na concentrao de 4 a 5%, tambm tuberculocida, mas sem capacidade esporicida. Hipoclorito de sdio, onde seja aplicvel, capaz de ter ao de amplo espectro (bactericida e viricida), o que o torna recomendvel como um efetivo desinfetante intermedirio para itens no-crticos e semicrticos.

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Compostos fenlicos O cido fnico ou carblico considerado o mais antigo germicida existente. Apesar de no ser mais usado como desinfetante, seus derivados so muito utilizados e constituem os compostos fenlicos. Essa classe muito popular para desinfeco domstica. Os fenlicos so bons bactericidas, so estveis e permanecem ativos depois de algum tempo secos. Sua diluio a 2 e 3% ativa quando em contato com matria orgnica, por isso so os desinfetantes escolhidos para lidar com contaminao fecal. Porm, os fenlicos so absorvidos por material poroso, alm de serem irritantes para a pele. Consequentemente, seu uso na desinfeco de utenslios ou reas semicrticas limitado. Pelas mesmas razes e porque no so esporicidas, no so usados em reas e material crticos. Formol ou formaldedo um composto lquido claro, com vrias aplicaes. Sua soluo a 37% vem sendo usada, normalmente, como preservativo (peas de anatmico), desinfetante e antissptico. A formalizao ou fumigao uma desinfeco de ambiente realizada por sublimao de formaldedo durante um mnimo de seis horas temperatura de 200oC, usando aquecedor eltrico com timer. Aps a desinfeco, o formol presente no ar desnaturado por evaporao de 3 g/m3 de carbonato de amnia durante duas horas e trinta minutos a 200 oC. Aps a desnaturao, o ar ventilado por duas horas filtros Hepa (High Efficiency Particulate Air) a fim de retirar os eventuais vapores residuais. O operador dever utilizar proteo ocular e mscara de gs com cartucho adequado, uma vez que essa substncia cancergena de mucosa. Glutaraldedo O dialdedo saturado relacionado quimicamente com o formaldedo. Pesquisadores concluram que a ao

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esporicida do glutaraldedo a 2% aquoso igual ao do formaldedo a 8% tambm aquoso, desde que a soluo seja alcalinizada. As solues aquosas de glutaraldedo so cidas e fracamente microbicidas, mas podem ser ativadas pela alcalinizao com bicarbonato de sdio. Apesar disso, sofrem uma significante perda de atividade em temperatura ambiente por duas semanas. O glutaraldedo elimina algumas bactrias rapidamente, vrus no envelopados em dez minutos, bacilo da tuberculose em vinte minutos e esporos em perodo de trs a 12 horas. Portanto, glutaraldedo aquoso a 2% alcalinizado um poderoso germicida-esporicida, podendo ser usado em materiais danificveis pelo lcool. Iodforos Sabidamente, o iodo um dos melhores antisspticos encontrados at os dias atuais talvez o melhor. Muitos iodforos so considerados desinfetantes comprveis para uso geral, nas adequadas concentraes, ainda que instveis na presena de gua pura, calor e matria orgnica. Inativam vrus a 150 ppm e destroem bacilos da tuberculose de 300 a 450 ppm. Consequentemente, na concentrao de 300 a 450 ppm so desinfetantes valiosos no uso em itens no-crticos e semicrticos. Apesar disso, sua ao germicida provm da liberao do iodo livre, o que o torna irritvel para a pele. Metanol-etanol (formaldedo-lcool) A concentrao de 8% do formaldedo um germicida de alto nvel. Essa atividade ainda pode ser aumentada, adicionando-se lcool. Uma combinao de 8% de formaldedo com 65 a 70% de lcool (metanol-etanol) tuberculocida em cinco minutos. Formalina (20%) um timo esporicida, mas o tempo requerido para isso pode ser de trinta horas ou mais. Quando combinado com lcool, apesar de sua

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maior atividade, pode necessitar de at 18 horas dependendo das condies do teste. Combinado com outros compostos qumicos, pode reduzir mais o tempo necessrio para sua ao esterilizante. Um aspecto importante a ser considerado a possvel toxidez das substncias utilizadas e o grau de dano que pode causar s superfcies e aos ambientes. Quaternrios de amnio Os quaternrios tm tido seu uso largamente difundido, tanto como desinfetante quanto como antissptico. Contam com a importante qualidade de serem menos irritantes, por isso so to populares. fundamental considerar a suavidade desta classe de germicida quando for necessrio escolher um desinfetante e/ou antissptico. Avaliao microbiolgica dos desinfetantes: As metodologias de avaliao dos desinfetantes tm sido permanentemente questionadas porque, em alguns casos, a eficcia do composto ativo diferente daquela testada laboratorialmente. Vrias tcnicas vm sendo propostas baseadas na metodologia do coeficiente fenlico, descrita em 1903 por Rideal e Walker e idealizada para comparar a atividade antibacteriana dos derivados fenlicos naturais do cido fnico (fenol). O teste, que era realizado apenas frente Salmonella Typhi, hoje j sofreu vrias adaptaes e inclusive utilizado no s para os compostos fenlicos, mas tambm para outros compostos com ao antibacteriana. O protocolo oficial usado no Brasil desde 1985 est atualmente descrito no manual da Association of Official Analytical Chemist (AOAC) para a avaliao microbiolgica de desinfetantes qumicos. Na qualificao de desinfetantes domsticos, utiliza-se Staphylococcus aureus (ATCC 6538) e Salmonella choleraesuis (ATCC 10708). Para desinfetantes institucionais, inclui-se tambm a Pseudomonas aeruginosa (ATCC

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15442). Para desinfetantes hospitalares, dependendo da rea, pode-se adicionar cepas de Mycobacterium. Coeficiente fenlico Para se estandardizar um desinfetante, necessrio determinar o coeficiente fenlico do mesmo (BREWER, 1943). Este coeficiente consiste na determinao da ao germicida do agente qumico sobre o organismo teste mediante determinadas temperaturas em funo do tempo, comparada com a ao do fenol em condies idnticas. Meio de cultura Extrato de carne ....................................................... 0,5% Peptona .................................................................... 1,0% NaCl ....................................................................... 0,5% Ajustar o pH = 6,8 0,1 Amostras padro para teste em cultura recente (24 horas):

Salmonella choleraesuis (ATCC 10708) Staphylococcus aureus FDA 209 (ATCC 6538) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442)
Distribuir em tubos 25 x 250 ml, 10 ml de meio, e esterilizar. Adicionar a amostra padro, de escolha. Tcnica: a) Separar duas baterias, a primeira contendo dez tubos e a segunda, dois tubos. Na primeira, adicionar 5 cm3 de vrias diluies do desinfetante em teste. Na segunda, adicionar a diluio de fenol de 1/90 e 1/100 partindo de uma soluo de fenol a 5% (titulada por meio de bromo).

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b) Adicionar a cada tubo das duas baterias 0,5 cm3 da cultura padro. Manter os tubos em banho-maria a 20C e tirar repiques (ala 4 mm) de cinco em cinco minutos, isto , aps cinco, dez e 15 minutos e se inocula em outros tubos contendo meio de cultura estril. Os tubos semeados so incubados a 37C por 48 horas, quando so lidos e comparados os resultados. Clculos: Dividir a diluio do desinfetante capaz de matar a S. typhi em dez, mas no em cinco minutos, pela maior diluio de fenol, que produz o mesmo efeito. Exemplo: a) Soluo de cido fnico padro:
Diluio 1/90 1/100 5 min. + + 10 min. + 15 min. +

+ crescimento

- estril

b) Soluo do desinfetante a verificar: Diluio 1/200 1/300 1/400 5 min. + + 10 min. + 15 min. +
Coeficiente fenlico: 300 = 3,33 90

Resultado do coeficiente fenlico:


timo desinfetante, igual ou superior a 3; Bom desinfetante, entre 2 e 3; Mdio desinfetante, entre 1 e 2; Pssimo desinfetante, abaixo de 1.

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Sanitizao Mtodo que envolve diferentes processos, visando a obter o grau de higiene e limpeza adequadas em todos os componentes do ambiente de trabalho, reduzindo, assim, os microrganismos presentes a um nmero compatvel com o produto e aceito pela legislao. O mtodo envolve quatro estgios: 1. Limpeza inicial da sujidade macroscpica e grossa, utilizando gua; 2. Remoo fsica da sujeira promovida por detergentes; 3. Novo enxgue; 4. Aplicao de sanitizantes (desinfetantes).
1.2.Desinfeco por agentes fsicos Pasteurizao

Processo idealizado por Louis Pasteur, em 1864, que verificou que o aquecimento acima de 60oC de certas bebidas e alimentos, por um determinando tempo (chamado de binmio tempo x temperatura), evitava a sua deteriorao, reduzindo de maneira sensvel o nmero de microrganismos presentes na sua composio. A partir desta descoberta, esse foi o tratamento recomendado para reduzir a populao de microrganismos termossensveis (sobretudo no esporulados) presentes em amostras, principalmente nos alimentos, tais como sucos de frutas e leite. Normalmente, empregado para produtos que possuem caractersticas organolpticas e nutricionais altamente suscetveis a altas temperaturas. Este tratamento deve ser associado ao emprego de outros mtodos, como refrigerao, adicionamento de acar ou aditivos e uso de embalagens hermticas.

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Existem, atualmente, trs tipos de pasteurizao: Pasteurizao lenta na qual se utiliza menores temperaturas (por volta de 65oC) durante maior intervalo de tempo (aproximadamente trinta minutos). Podemos denominar o processo como LTLT (low temperature long time) baixa temperatura e longo tempo. Este tipo melhor para pequenas quantidades de leite, por exemplo, o leite de cabra. Pasteurizao rpida na qual altas temperaturas so utilizadas por curtos intervalos de tempo. A temperatura utilizada de 75oC durante 15 a vinte segundos. Podemos denominar esse tipo de pasteurizao como HTST (high temperature and short time) alta temperatura e curto tempo. mais usada no leite de saquinho, do tipo A, B e C. Pasteurizao muito rpida na qual as temperaturas utilizadas so bastante altas (130oC a 150oC) mas durante um tempo extremamente curto (de trs a cinco segundos). Este tipo mais conhecido como UHT (ultra high temperature). utilizada nas caixinhas de leite tipo longa vida.
Tindalizao

Processo vinculado ao fsico ingls Jonh Tindall. uma tcnica de esterilizao fracionada, em que o vapor fluente (gua de 60C a 90C) aplicado durante trinta a sessenta minutos, por repetidas vezes, resfriando-se entre cada aquecimento. Este processo usado quando no se deseja a coagulao das protenas e o seu princpio visa a destruir as formas vegetativas apenas, o que se consegue simplesmente pela aplicao do vapor fluente. Durante o perodo de repouso temperatura ambiente (por volta de 24 horas), as formas de resistncia (esporos) passam para formas vegetativas e

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assim, quando submetidas novamente a vapor fluente, so destrudas. O nmero de operaes pode variar de trs a 12 vezes, dependendo do rigor e da qualidade desejada. um processo muito usado na indstria de alimentos e farmacutica, quando se deseja preservar a qualidade do produto que est sendo esterilizado, pois podem ser mantidos praticamente todos os nutrientes e as qualidades organolpticas do produto, em propores maiores do que quando se utilizam outros tratamentos trmicos. Ex.: produtos aucarados ou que contenham gelatina.
1.3. Esterilizao

O ato de esterilizar visa destruio de qualquer microrganismo existente, incluindo esporos, enquanto o ato de desinfetar preocupa-se apenas com a destruio de formas vegetativas. A esterilizao, dessa forma, o processo que promove a completa eliminao de todos os microrganismos presentes (protozorios, vrus, fungos e bactrias), incluindo os esporos, em um determinado material ou ambiente. Utilizam-se agentes fsicos e qumicos. diferente de limpeza e de assepsia, uma vez que estes conceitos esto mais ligados ao controle de microrganismos, ao passo que a esterilizao se refere eliminao total dos mesmos. De uma maneira geral, os processos de esterilizao so fsicos e os de desinfeco so qumicos (o que no quer dizer que no poderamos fazer uma esterilizao qumica ou vice-versa). Exemplo de esterilizao fsica:
Calor

Os processos mais comuns de controle baseiam-se no uso do calor, sendo a via mida a mais efetiva.

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Flambagem SECO Ar quente

CALOR

Temperatura (50 70C) Pasteurizao gua fervente Temperatura (100C) vapor fluente

Temperatura superior a 100C vapor mido sob presso

Calor seco

De um modo geral, podemos dividir este tipo de esterilizao em duas tcnicas: a utilizao do ar quente e a flambagem (incinerao):

Utilizao do ar seco ou ar quente recomendada quando o contato direto com o calor mido (vapor) sob presso no adequado ao tipo de material, como ocorre com certos tipos de vidraria, leo, ps e substncias similares. O aparelho usado neste tipo de esterilizao um forno (eltrico ou a gs) capaz de atingir altas temperaturas. A despirogeneizao (destruio de pirognioas, substncias capazes de elevar a temperatura corporal, frequentemente polissacardeos que podem ser de origem microbiana ver captulo sobre bacteriologia) s pode ser feita no forno 180oC. A autoclave no elimina o pirognio.

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Obs.: Para esterilizao de vidraria limpa, uma exposio de duas horas a 160oC considerada suficiente.

Incinerao a queima total de um material, usada para destruio de carcaas de animais ou outros materiais infectados. A destruio de microrganismos por calor direto tambm praticada na rotina do laboratrio quando a ala ou agulha de platina levada chama do bico de Bunsen (flambagem). Primeiro se leva a ala chama interna de cor azul, denominada de chama fria, e depois, vagarosamente, se desliza a ala para a chama externa (vermelha) para realizar a flambagem. Quando a ala ou agulha de platina ficar totalmente incandescente, sinal de que foi feita a esterilizao. Esse procedimento evita a formao de aerossis, responsveis pela contaminao do meio ambiente.
Calor mido

O calor sob forma de vapor dgua sob presso considerado o agente mais prtico e eficiente para esterilizao. Proporciona temperaturas mais elevadas que na ebulio, com vantagens como a rpida elevao de temperatura e maior penetrabilidade. O aparelho utilizado para este fim recebe o nome de autoclave. Geralmente, embora no sempre, a autoclave operada numa presso de @15 libras por polegada quadrada (1 atmosfera = 121oC) sendo o tempo varivel de acordo com o material a ser esterilizado. Atualmente, alguns laboratrios j esto adotando normas mais rgidas na autoclavao de seus utenslios, principalmente em casos de material cirrgico. Aps a descoberta de que os prons (protenas infecciosas causadoras de doenas chamadas de encefalopatias espongiformes transmissveis, como Scrapie, Kuru, Creutzfeldt-Jakob e BSE) so capazes de resistir autoclavao

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normal e a vrias substncias qumicas, esto sendo preconizadas autoclavaes a 134oC por duas horas, na certeza de inativao destes elementos. Os materiais que sero autoclavados devero estar devidamente acondicionados para que ao final do ciclo de esterilizao possam ser retirados e utilizados com segurana. Para que isso acontea, alguns critrios devero ser levados em conta na hora da escolha da embalagem para a esterilizao: Deve-se levar em conta o material e o mtodo de esterilizao sendo compatvel e resistente s condies fsicas do processo de esterilizao. Deve proporcionar selagem adequada e barreira microbiana. Deve permitir a penetrao e remoo do agente esterilizante. Deve resistir a rasgos e ser livre de furos. No pode ter na sua composio substncias txicas. Deve apresentar custo-benefcio positivo. Considerando a garantia da qualidade da esterilizao, podemos lanar mo de indicadores qumicos e biolgicos oferecidos de diferentes formas no mercado. Estes devero ser testados pelo controle da qualidade e mantidos na validade e em condies ideais de estocagem. Indicadores qumicos:
Externos: indicam o contato do vapor com a superfcie exposta.Devem ser usados em todos os processos e pacotes. Interno: indicam que o vapor penetrou no interior da embalagem. Fitas ou etiquetas adesivas impregnadas com substncias qumicas termosensveis especficas ao vapor que, ao serem retiradas da autoclave, devero apresentar mudana de cor. Impresso tinta indicativa termosensvel impressa diretamente na embalagem que, ao ser retirada da autoclave, dever apresentar mudana de colorao. Tintas de papel impregnadas com tinta em concentrao graduada com substncias qumicas termosensveis especficas ao vapor que, ao serem retiradas da autoclave, devero apresentar colorao marrom a preto.

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Indicadores biolgicos: So utilizados espcimes bacterianos no patognicos com esporos altamente resistentes ao calor mido e dessecao. O exemplo mais comum o Bacillus (Geobacillus) stearotermophilus, utilizado como desafio, j que, uma vez tendo sido eliminado, todos os outros esporos e formas vegetativas tambm o sero. Para fazer o teste biolgico do funcionamento da autoclave, utilizase os esporos dentro de um recipiente, que ir passar pelo ciclo de esterilizao da autoclave. Coloca-se o pacote teste embaixo junto ao dreno ou, nos modelos verticais, no meio da cmara, que so os pontos respectivamente mais frios em funo da localizao das resistncias. Ao final do ciclo, aps o resfriamento total, abre-se o recipiente expondo os esporos ao meio de cultura. Coloca-se para incubar em estufa bacteriolgica com um controle positivo (outro indicador de controle idntico que no vai para autoclave, mas deve ser ativado da mesma forma, j que a sua finalidade testar tanto a viabilidade dos esporos quanto verificar se a incubadora est funcionando corretamente). O resultado esperado a mudana de cor causada pela alterao de pH da soluo que resulta da atividade microbiana. O teste levado ao autoclave no deve mudar de cor, pois o esperado que os microrganismos tenham sido destrudos no processo de esterilizao. A leitura final feita aps 24 a 48 horas de incubao dos indicadores. A recomendao do Ministrio da Sade e da Vigilncia Sanitria o uso semanal dos indicadores biolgicos.
Irradiao

Os efeitos das radiaes dependem da sua durao, do comprimento de onda, da intensidade e da distncia da fonte. Existem, atualmente,

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pelo menos dois tipos utilizveis no controle de microrganismos. As ionizantes (comprimento de onda mais curto e maior energia) e as no ionizantes. Vamos citar as mais conhecidas: Raios gama Radiao do tipo ionizante, sem induzir aumento na temperatura, destri componentes celulares orgnicos, entre eles as ligaes do DNA, atravs da ionizao da gua e produo de radicais livres (superxidos), destruindo formas vegetativas e, em doses mais elevadas, esporos. Apesar de o custo inicial deste tipo de processo ser elevado, a radiao gama constitui hoje o mtodo de eleio para esterilizar grandes lotes de itens de pequeno volume, como agulhas, seringas, luvas e cateteres. Eventualmente, tambm pode ser usada para vacinas e na preveno da deteriorizao de alimentos. Raios UV Apesar do baixo poder de penetrao, a radiao ultravioleta empregada com sucesso no ambiente hospitalar e no laboratrio (lmpada germicida), funcionando como esterilizante de superfcie aps limpeza com desinfetante. Usada tambm para controle de microrganismos do ar, frequentemente encontrada em centros cirrgicos e capelas de fluxo laminar. No utilizada em larga escala, pois pode causar danos pele e crnea.
Filtrao

Como outro processo considerado de esterilizao, podemos citar a filtrao atravs de substncias capazes de reter os microrganismos. Antigamente, eram usadas velas e filtros de amianto do tipo seitz. Atualmente, so mais utilizadas as membranas de nitrocelulose de pequena porosidade (0,2m), embora de forma efetiva estas funcionem muito bem, pois consideram tambm

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a atrao eletrosttica das partculas e no agem realmente como esterilizantes, j que podem eventualmente permitir a passagem de vrus e alguns gneros bacterianos de menor dimetro.
xido de etileno

Amplo uso como esterilizante de instrumentos. Tem ao esporicida mais rpida que o formaldedo gs. A esterilizao por xido de etileno um mtodo especfico devido a sua complexidade, tanto relativa ao seu alto custo quanto ao longo tempo requerido.
1.4. Medicamentos para controle bacteriano (ver captulo sobre Bacteriologia no volume III) Quimioterpicos

Produzidos por sntese qumica em laboratrio, ao invs de serem produzidos por um microrganismo. Qualidades ideais de um agente quimioterpico: Ser capaz de destruir ou inibir muitas espcies de microrganismos patognicos. Quanto maior o nmero de diferentes espcies afetadas, melhor o agente. Inibir os microrganismos de tal maneira que se evite o desenvolvimento de formas resistentes produtoras de doenas. No produzir efeitos colaterais indesejveis no paciente. No eliminar microrganismos que normalmente habitam o trato intestinal ou outras reas do organismo (flora normal). Ser altamente solvel nos fluidos corporais. No pode ser inativado pelo cido estomacal, deve ser absorvido pelo trato intestinal.

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Antibiticos ou agentes antimicrobianos

So substncias obtidas a partir de microrganismos (principalmente fungos) que so utilizadas no tratamento de doenas, sobretudo de origem bacteriana. A escolha do antibitico no tratamento de uma infeco depende do microrganismo obtido a partir da cultura em laboratrios de anlises clnicas e da sua sensibilidade verificada no antibiograma (ver captulo sobre Bacteriologia), pela gravidade da doena, da toxicidade e dos antecedentes de alergia do paciente. Em infeces graves, pode ser necessrio combinar vrios antibiticos. A via de administrao pode ser oral (cpsulas, comprimidos), tpica (colrios, pomada) ou injetvel (intramuscular, intravenosa). Nas infeces graves, deve-se utilizar a via intravenosa. Para proceder adequadamente a qualidade dos testes e o controle dos microrganismos, lanamos mo de processos de esterilizao, que podem ser fsicos ou qumicos, como veremos a seguir.
Tratamento 2. Tratamento de gua

Sistemas de tratamento de gua A gua que bebemos denominada potvel e, por definio, pode ser consumida por pessoas sem riscos de adquirirem doenas por contaminao da mesma. Ela pode ser oferecida populao das cidades ou de reas rurais e vai ou no precisar de tratamento prvio dependendo da origem do manancial. O tratamento de gua tem como objetivo reduzir a concentrao de poluentes at o ponto em que no apresentem riscos para a sade pblica. O grau e o tipo de tratamento vo variar de acordo com as normas de cada pas e, principalmente, com a qualidade da gua de abastecimento. No Brasil, na maioria das cidades, existe a necessidade de filtros domsticos. Entretanto, o Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Industrial (Inmetro) alerta para alguns cuidados a serem tomados em relao a este sistema de filtrao (www.inmetro.gov.br acesso em 24 out. 2008):

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No se deixe levar pelo ttulo, filtro ou purificador; os ensaios mostra-

ram que estes no tm diferena.


No se impressione com promessas de gua pura ou cristalina, pois

isso no significa que o filtro combata bactrias ou elimine possveis riscos sade.
Em caso de dvida quanto procedncia da gua, no confie somente

no filtro. Nestes casos, ferva a gua por, pelo menos, 15 minutos.


Para os consumidores que se utilizam de fonte de gua in natura,

muito importante que a qualidade da gua seja verificada periodicamente atravs de ensaios microbiolgicos e que a gua seja fervida aps a filtragem.
de fundamental importncia manter a caixa dgua limpa, pois a falta

de higiene nesta pode ser um foco de contaminao da gua. Segundo o Inmetro, a qualidade dos filtros domsticos existentes no mercado nacional preocupante, particularmente no que diz respeito s informaes quanto utilizao e finalidade e quanto ao desempenho na eliminao de bactrias. A inexistncia de normas e regulamentos contribui para atual situao, cabendo ao Inmetro induzir a criao de uma norma brasileira para este produto. Entretanto, a gua que utilizamos em laboratrio tem um nvel de exigncia qumica e biolgica muito maior, mas, assim como nas vidrarias de laboratrio, no podemos generalizar as especificaes da qualidade exigida para os diversos laboratrios, sendo assim, os laboratrios de qumica, de um modo geral, necessitam de gua deionizada, isto , livre de ons, enquanto os de produo de diluentes, vacinas, medicamentos e os de bacteriologia usam sistemas de ultrafiltrao ou destilao que removem coloides, bactrias e pirognios. Dessa forma, iremos descrever um sistema de tratamento de gua, ressaltando que no existe o sistema ideal para todos os laboratrios e a

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escolha deve ser feita tendo em vista a finalidade, a origem do manancial, os recursos financeiros disponveis e o consumo de gua. Na hora de se projetar um sistema de tratamento de gua, deve-se entrar em contato com as empresas fabricantes dos equipamentos para se verificar o consumo de gua, consumo eltrico e gasto de material de consumo.
2.1. gua de alimentao

A origem da gua muito importante para se obter uma gua purificada de qualidade WFI (water for injection). Independentemente se a gua vem de um poo artesiano ou do Centro Municipal de Tratamento de gua, tipo Cedae (no caso do Rio de Janeiro), uma filtrao inicial dever ser realizada. Como o projeto e a operao do sistema de tratamento de gua dependem da qualidade da gua de abastecimento, importante conhecer as caractersticas e evidenciar as alteraes da qualidade da gua, com a mudana das estaes, j que, dependendo da poca do ano, podemos ter na gua elementos slidos provenientes do solo ou de outros locais por onde ela passou, como ocorre nas enchentes, modificando as caractersticas desta gua (dureza, salinidade, pH etc.). A gua de alimentao deve ser monitorada a cada seis meses para se ter certeza de que as caractersticas qumicas esto mantidas. No caso de se ter uma gua muito ionizada, monta-se, ento, um Sistema Softened (como explicado a seguir), para se retirar a grande maioria dos ons e remover as substncias insolveis em suspenso. Caso haja muita matria orgnica, faz-se necessria a colocao de filtros de areia e carvo ativado. A qualidade da gua de origem vai indicar os prximos passos do sistema de tratamento, nesse caso, tubulaes antigas de ferro que levam a gua para as cisternas e caixas dgua obrigaro a colocar na linha, tambm, um Sistema Softened.

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2.2. Sistema Softened (gua sem ferro)

A retirada de ferro da gua realizada por filtrao num leito composto de mistura de calcita (CaCO3) e dolomita calcinada CaMg(CO3)2. A filtrao precedida por uma oxidao sob ar comprimido em um cilindro para oxidar sais de Fe++. Ctions de Fe++ so eliminados por filtrao sob a forma de Fe+++ hidratado Fe(OH)3. O ar comprimido fornece o ar necessrio para a oxidao. A gua ento distribuda para os filtros desferrificadores. Esse tipo de tratamento, normalmente, antecede o sistema de purificao de gua utilizado nos laboratrios, ficando, geralmente, situado fora do prdio. Caso a gua de abastecimento seja fornecida pelo centro de tratamento municipal, essa primeira etapa ser dispensada ou trocada por outra de acordo com a necessidade. Exemplo de utilizao da gua:
Instalaes sanitrias (chuveiro); Circuitos de refrigerao (gua gelada); Alimentao do desmineralizador ou do deionizador; gua para laboratrio de qumica. 2.3. gua desmineralizada

Na realidade, tanto o desmineralizador quanto o deionizador tm o mesmo objetivo: a retirada de ons da gua. Entretanto, convencionou-se que o equipamento de desmineralizao possui duas colunas separadas, cada uma contendo uma resina diferente (aninica e catinica), e no deionizador as duas resinas esto juntas na mesma coluna, isto , coluna de leito misto. A resina catinica contm ons disponveis capazes de remover ctions (Na +, Ca++, Mg++, Fe+++ ,etc.). A circulao da gua do topo para o fundo do leito de resina e a regenerao so realizadas da mesma maneira com cido clordrico (HCl) servindo tambm como agente sanitizante.

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A resina aninica retira os nions da gua (Cl -, SO--). A gua decationizada passa para a forma hidroxlica. A regenerao feita da mesma maneira contra-corrente com soluo alcalina forte (hidrxido de sdio NaOH), a qual funciona tambm como agente sanitizante. A gua desmineralizada distribuda para os laboratrios ou ento vai alimentar o deionizador. Apesar de teoricamente a gua desmineralizada apresentar uma qualidade qumica um pouco inferior que a gua deionizada, no existe a necessidade de ter os dois sistemas em linha (desmineralizador deionizador). Muitos laboratrios que possuem recurso financeiro fazem a opo de ter o desmineralizador abastecendo o deionizador, com o objetivo de proteger o segundo equipamento e com isso aumentar o intervalo entre as regeneraes e diminuir o gasto de produtos e resinas. Regenerao das resinas: O local de entrada do cido e da base para a regenerao das resinas no deve ficar dentro da sala, e sim do lado de fora. Pode ser comprado na concentrao de 30% em tanques adaptveis tubulao. Na maioria dos desmineralizadores, todo processo automtico. A regenerao baseada no volume de gua que passa por aquela resina, a no ser que a condutividade v alm do limite aceitvel (5mS). O nmero de regeneraes em um ano pode variar de dez a vinte. Isto vai depender da produo anual daquele laboratrio e da qualidade da gua de alimentao. Conforme for diminuindo o tempo de intervalo entre uma regenerao e outra, sinal de que a resina est perdendo sua capacidade regeneradora. O controle nesse caso, para ver se necessrio ou no fazer uma nova regenerao, a condutividade da gua. E medida que se vai aumentando o nmero de regeneraes, a tendncia da quantidade de resina diminuir. Uma preocupao importante nos procedimentos de regenerao das colunas quanto biossegurana. Equipamentos de proteo individual e

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coletiva devem ser rigorosamente utilizados, uma vez que qualquer acidente pode colocar o operador em risco de ter queimaduras provocadas por cido e soda ou at mesmo problemas graves de sade por inalao de vapores. Um reservatrio contendo resina sinttica com alto poder de absoro, caso haja derramamento de cido e base no momento do processo de regenerao, deve estar disponvel no laboratrio em local estratgico. Todas as conexes utilizadas na instalao do equipamento devem ser de ao inox para resistir ao oxidante dessas substncias. Exemplo de utilizao da gua: Produo de vapor (tubulao PVC); gua (quente e fria) para lavagem de equipamentos; Alimentao do deionizador; gua para laboratrios de qumica.
2.4. gua deionizada

O tratamento de gua deionizada uma unidade composta de duas colunas de leito misto, trabalhando em srie, chamada de Triobed. Cada Triobed composta de uma resina cido forte, uma resina bsica forte e uma resina neutra (que fica localizada no meio e a mistura das duas resinas). A unidade Triobed trabalha no sistema clssico de leito misto. As resinas so classificadas ou separadas pela diferena de densidade das partculas depois de enxgue da coluna com gua desmineralizada por dez minutos, em contra-corrente. A resina neutra uma camada com cerca de 12 a 25 cm de altura entre as outras duas. A resina cida (camada de baixo) regenerada em contra-corrente e a resina bsica (camada de cima) em cocorrente. Depois de cada ciclo de regenerao, feito o enxgue com gua desmineralizada. Duas bombas coletoras de gua deionizada distribuem gua para o sistema.

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Regenerao das resinas: Mover toda a resina para o topo da coluna e passar HCl a 30%. Retirar o cido, com gua desmineralizada, levando para um tanque de neutralizao, localizado ao lado de fora do prdio. Esta gua cida s ser despejada para o esgoto quando estiver neutralizada com uma soluo alcalina. Proceder da mesma maneira com a resina bsica, s que usando NaOH a 30%. Usa-se tambm o tanque de neutralizao, colocando-se uma soluo cida. Deve-se lavar as resinas com gua desmineralizada, at o condutivmetro, localizado no final da coluna marcar em torno de 1mS. Exemplos de utilizao da gua: Produo de vapor (tubulao em ao inox); gua de lavagem de tanques; Laboratrios de qumica e outros que precisem de gua deionizada; Alimentao das unidades de ultrafiltrao e destilao.
2.5. gua bidestilada (WFI)

A gua de alimentao pr-aquecida num trocador de calor, por condensao de vapor vindo da ltima coluna e dos pr-aquecedores pelo condensado produzido em cada efeito. A gua de alimentao evapora parcialmente na primeira coluna aquecida por vapor industrial. O condensado de vapor passa atravs do trocador e descarrega. O vapor puro produzido do topo segue para o prximo efeito, onde o processo repetido. A gua destilada produzida por condensao de vapor puro vai para o trocador. O processo repetido por todas as colunas da mesma maneira. O vapor produzido no ltimo efeito condensado e resfriado. A gua bidestilada no deve ser armazenada. Se isto precisar acontecer, deve ser feito um sistema de looping a 85oC.

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Exemplos de utilizao da gua:


gua para o preparo de vacinas; gua para o preparo de diluentes e solues (WFI); gua final (enxgue) de lavagem de vidrarias, frascos e rolhas; Laboratrios em geral, principalmente os que precisam de gua

com qualidade microbiolgica muito boa.


2.6. gua ultrafiltrada (WFI):

Existem no mercado vrios modelos de ultrafiltradores que produzem gua purificada do tipo WFI. Os cartuchos de ultrafiltrao so hidrfilos e o fluxo inicial necessrio cada vez que novos cartuchos so usados. Deixe sempre o sistema funcionar por quatro horas (para drenar) antes de usar a gua. Ajuste o ejetor e a passagem das vlvulas para obter uma presso compatvel com a presso transmembrana. A maioria dos equipamentos desta natureza possui timer programvel. A gua ultrafiltrada no deve ser armazenada. Se isto precisar acontecer, deve ser feito um sistema de looping a 85oC. Exemplos de utilizao da gua:
gua para o preparo de vacinas e de diluentes e solues (WFI); gua final (enxgue) de lavagem de vidrarias, frascos e rolhas; Laboratrios em geral, principalmente os que precisam de gua

com qualidade microbiolgica muito boa.

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Esquema de tratamento de gua


gua de entrada Unidade de oxidao Instalaes sanitrias e circuito de refrigerao Unidade desferrificadora Hipoclorito de sdio Estocagem em tanque (20 min) Filtro de carvo ativado Desmineralizador Deionizador Ultrafiltrao Destilador

Detector de cloro Produo de vapor, laboratrio de qumica, lavagem de tanque, etc.


Laboratrio de bacteriologia, imunobiolgicos,produo de WFI

3. Equipamentos 3.1. Autoclave

um equipamento de laboratrio utilizado para esterilizar objetos atravs de calor mido (vapor) combinado com presso. Dessa forma, a esterilizao a vapor realizada em autoclaves, cujo processo possui fases de penetrao do vapor, remoo do ar e secagem. Ao utilizar a autoclave, importante assegurar que o vapor deslocou todo o ar antes que a presso se eleve. Nesse sentido, o vapor saturado, isento de ar, na presso de 1 atmosfera, tem uma temperatura de 121oC. Existem vrios modelos de autoclaves, mas, quanto fundamentao da tcnica de autoclavao, podemos dividi-las em dois grandes grupos:

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Gravitacional: o ar removido pelo vapor que injetado forando sua

sada ou atravs de uma bomba. A fase de secagem limitada, uma vez que no possui capacidade para completa remoo do vapor.
Alto vcuo: introduz vapor na cmara interna sob alta presso com ambien-

te em vcuo. A fase de secagem melhor do que a gravitacional devido alta capacidade de suco do ar realizada pela bomba de vcuo. Os ciclos de esterilizao so orientados de acordo com as especificaes do fabricante, com o tipo e a quantidade de material a ser esterilizado. Para se ter uma boa esterilizao, preciso dispor o material de forma a permitir a passagem de vapor por toda a cmara de forma homognea. Os materiais devem ser montados utilizando papel cristal, kraft ou plstico especial para autoclavao lacrados com fita para autoclave que serve tambm como indicador de que o vapor atingiu aquela superfcie. As autoclaves devem ser calibradas e validadas de seis em seis meses pela Garantia da Qualidade e deve ser feita manuteno preventiva anualmente.
3.2. Microscpio

Os estudos morfolgicos da clula normalmente comeam com o emprego do microscpio tico, mais comumente denominado de microscpio de luz (por utilizar a luz como fonte de formao de imagens) ou microscpio composto (por ser constitudo por dois sistemas de lentes sobrepostas: a objetiva e a ocular). Este instrumento pode ser considerado como a ferramenta bsica em laboratrios da rea da sade, dessa forma dedicamos o captulo 3 desta coleo com detalhamentos da tcnica de microscopia de luz. A observao da clula ao microscpio tico feita por luz transmitida, que exige que o objeto a ser estudado atenda a alguns critrios:

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Ser suficientemente fino, para que a luz possa atravess-lo

o objeto deve ter uma espessura na ordem de 5mm, tornando-se necessrio fazer esfregaos finos ou, em alguns casos, realizar cortes histolgicos para atingir a espessura desejada (Ver detalhes no captulo de Tcnicas Histolgicas e Citolgicas captulo 11 e 12 do volume 2 desta coleo).
Apresentar contrastes, diferenciando as regies celulares. Como os

constituintes celulares tm pouco contraste, necessrio utilizar coloraes artificiais. Os corantes so substncias que absorvem certos comprimentos de onda da luz visvel e tm afinidade por determinados constituintes celulares. O microscpio de luz composto fundamentalmente das seguintes partes: Partes mecnicas
P base do aparelho, suporta todas as outras partes. Brao preso ao p, rgido ou articulado, suporta o canho, a

platina, o condensador e o espelho ou fonte luminosa.


Canho o tubo onde se dispem as partes ticas de

ampliao. Pode ser fixo ao brao ou possuir movimento vertical.


Revlver uma pea giratria onde se conectam as objetivas

e que permite a instantnea mudana das mesmas.


Platina a mesa de trabalho, onde se coloca a preparao

para exame. Possui uma abertura central que d passagem luz proveniente da fonte. Pode ser fixa ao brao ou possuir movimento vertical.
Charriot um dispositivo preso platina, dotado de movimen-

to antero-posterior e lateral, destinado a movimentar a preparao.

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Parafuso macromtrico um dispositivo destinado a dar

grandes e rpidos deslocamentos verticais ao canho ou platina. Serve para focalizao grosseira.
Parafuso micromtrico um dispositivo destinado a dar pe-

quenos e lentos deslocamentos ao canho ou platina. Serve para focalizao fina. Microscpio ptico: Ocular; Revlver; Objetiva; Parafuso macromtrico; Parafuso micromtrico; Platina; Espelho; Condensador. Quanto ao sistema de iluminao, ele pode ser provido de: espelho ou fonte de luz direta, que deve estar preso parte inferior do brao, refletindo ou projetando a luz para a parte inferior do condensador; diafragma ou ris, que, colocado sob o condensador, destina-se a restringir o dimetro de feixe luminoso; condensador, que um sistema tico de refrao, preso parte inferior do brao sob a platina, podendo ou no possuir movimento vertical (e lateral para centralizao), destinado a fazer convergir sobre a preparao a luz proveniente da fonte (consultar cap 3 de Microscopai de Luz). O sistema de ampliao formado pelas objetivas e oculares. A qualidade da visualizao da imagem ser proporcionada pelo poder de

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resoluo, que pode ser definido como a capacidade que este sistema possui de formar imagens distintas e ntidas de dois pontos situados muito prximos em uma preparao.
Objetivas de imerso (abertura numrica de uma objetiva)

Para se aproveitar uma maior quantidade de luz quando a objetiva de grande aumento, trabalha-se com a objetiva imersa em um lquido de alta refringncia, em geral leo de cedro (ndice de refrao de 1,575). Com o emprego desse leo, pode-se fazer convergir o feixe luminoso proveniente do condensador, captando-se aqueles raios luminosos que, com objetivas secas, seriam perdidos. Estas objetivas so denominadas objetivas de imerso. A consequncia direta do emprego dessas objetivas o aumento da luminosidade. No caso de uma objetiva seca, no existe leo, e o ndice de refrao igual ao do ar, que 1.
Manejo do microscpio ptico

Colocar na objetiva de menor aumento e baixar a platina completa-

mente. Se o microscpio foi usado corretamente antes, ele j deve estar nestas condies.
Colocar a lmina com a preparao sobre a platina e prend-la com as

pinas metlicas.
Comear a observao com a menor objetiva (colocar na de 10x para

observao de bactrias).
Para obteno do foco:

a) Aproximar ao mximo a lente da objetiva da lmina, atravs do parafuso macromtrico. Este procedimento dever ser realizado observando-se diretamente o local e no atravs da ocular, para que no haja o risco de incrustar na objetiva a preparao ou mesmo de quebrar a lmina.

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b) Observar, atravs das oculares, a amostra e, atravs do parafuso macromtrico, ir separando lentamente a objetiva da preparao. Quando se observa a nitidez da amostra, gira-se o micromtrico para obter o foco fino.
Ao mudar para a objetiva de 40x, deve-se redobrar a ateno, pois a

partir desta o foco fica muito prximo da lmina, sendo comum a ocorrncia de danos.
Utilizando a objetiva de imerso:

a) Abaixar totalmente a platina. b) Subir totalmente o condensador para visualizar claramente o crculo de luz que nos indica a zona onde devemos pingar o leo de imerso. c) Girar o revlver at a objetiva de imerso deixando-a na metade do caminho entre ela e a objetiva de 40x. d) Colocar uma gota mnima de leo de imerso sobre o crculo de luz. e) Terminar de girar suavemente o revlver at a posio da objetiva de imerso f) Olhando diretamente pela objetiva, levantar a platina lentamente at que a lente toque a gota de leo. Nesse momento, a gota de leo se levanta e se une lente. g) Focar cuidadosamente com o micromtrico. A distncia de trabalho entre a objetiva de imerso e a preparao mnima, menor do que com a de 40x. Deve-se ento ter muito cuidado para no ocorrer qualquer problema durante a visualizao. h) Uma vez que se colocou o leo de imerso sobre a preparao, no se pode voltar a utilizar a objetiva de 40x, pois esta objetiva se mancharia de leo. Portanto, se desejar focar nova-

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mente a mesma lmina, utilize outro campo. Neste caso, deve-se abaixar a platina e repetir a operao a partir do passo trs. i) Uma vez finalizada a observao da preparao, se abaixa a platina e se coloca na objetiva de menor aumento girando o revlver. Neste momento, j se pode retirar a lmina da platina. Nunca se deve retirar a amostra com a objetiva de imerso em posio de observao. j) Limpar a objetiva de imerso com cuidado empregando um papel especial para microscopia. Verificar tambm se a objetiva de 40x est perfeitamente limpa.
Manuteno preventiva

Ao finalizar o trabalho, deve-se deixar o microscpio na objeti-

va de menor aumento em posio de observao.


Quando no se est utilizando o microscpio, deve-se mant-

lo coberto com capa, preferencialmente de tecido, para evitar que se suje e as lentes fiquem danificadas. Se no se utiliza o aparelho com frequncia, deve-se guard-lo em sua caixa dentro de um armrio para proteg-lo do p.
Nunca se deve tocar as lentes com as mos. Se elas se sujarem,

devem ser limpas suavemente com papel de filtro ou papel para lentes.
No se deve deixar lminas sobre a platina quando no se est

utilizando o microscpio.
Depois de utilizar a objetiva de imerso, deve-se limpar o leo

com lenos de papel especiais para tica ou papel de filtro (menos recomendvel). Em qualquer caso, deve-se passar o papel na lente em somente um sentido com suavidade. Se o leo chegar a

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secar na objetiva, deve-se limp-la com uma mistura de lcoolter (9:1). No se deve abusar deste tipo de limpeza, porque o uso em excesso destes solventes poder danificar as lentes. Nunca forar os botes (parafusos) giratrios do microscpio (macromtrico, micromtrico, platina, revlver e condensador).
A mudana das objetivas dever ser realizada girando o revlver

e visualizando diretamente sobre a preparao para prevenir o contato da lente com a amostra. Nunca mudar de objetiva segurando pelo tubo, nem faz-lo observando atravs da ocular.
3.3. Banho-maria

O banho-maria um equipamento utilizado em laboratrios, que permite aquecer substncias de forma indireta (por imerso), ou seja, que no podem ser expostas a fogo direto. Tambm pode ser utilizado para descongelamento ou incubao de produtos biolgicos. Condies gerais: A limpeza do equipamento deve ser feita com gua potvel e sabo neutro (Extran a 10%). Enxaguar bem e enxugar somente com gaze por fora. No utilize solventes, tais como benzina, thiner e lcool. Manejo: a) Verificar a instalao e se a voltagem da tomada compatvel com a do equipamento. b) Verificar o nvel de gua, observando que o volume ideal corresponde metade do volume total. c) Verificar o tipo de gua utilizada que dever ser filtrada.

106 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

d) Depois de ligado o equipamento, a gua leva, em mdia, 15 minutos para aquecer. e) O tempo de uso vai variar de acordo com o material utilizado. f) Verificar sempre o nvel da gua, j que esta evapora e, por isso, dever ser reposta. g) Com o fim do procedimento, retirar a tampa e, em alguns modelos, a capa de revestimento interno, para propiciar o despejo da gua diretamente na pia. h) Aps verificar se o equipamento est seco, recolocar a capa de revestimento e a tampa para que o equipamento fique pronto para novo uso.
3.4. Balana eletrnica de preciso

A balana eletrnica de preciso utilizada para se pesar diferentes substncias no laboratrio de sade. Condies gerais: Observar se a balana est instalada em local livre de altas temperaturas e da ao direta de correntes de ar muito fortes, tais como ventiladores. A balana deve estar instalada em local de fcil visibilidade para o operador e onde no haja vibrao. Devem ser ajustados os ps regulveis da mesma de modo que ela fique bem apoiada e nivelada (verifique a indicao do nvel). Deve-se fechar a porta da balana sempre que se colocar um produto. Procure colocar o produto sobre o prato da balana com suavidade, lembrando-se sempre que se trata de um equipamento sensvel. Para limpeza, utilize um pano mido com gua e sabo neutro. No utilize solventes, tais como

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benzina, thiner e lcool. Ao transportar o equipamento de um local para outro, sempre trave a balana e procure manuse-la com cuidado, tomando todas as precaues para reinstalao. Manejo: a) Verificar a instalao e se a voltagem da tomada compatvel com a do equipamento. b) A balana no deve ser desligada, permanecendo em stand-by. c) Aguarde at que haja marcao no visor. d) Aparte o boto relativo calibrao para iniciar a mesma. e) Calibre de acordo com o manual do fabricante. f) Quando a calibrao estiver completa, aparecer no visor vrios zeros. g) Inicie ento a pesagem. h) Coloque o recipiente a ser descontado sobre o prato da balana, que imediatamente mostrar seu peso no visor. i) Tecle tara para zerar a balana. j) Coloque o produto a ser pesado no recipiente tarado, sem retir-lo de cima do prato, e proceda a operao normal de pesagem. k) Caso queira eliminar a memorizao da tara para obteno do peso bruto, retire o recipiente com o produto da balana e, em alguns segundos, os visores retornaro condio inicial ou aperte a tecla tara com a balana vazia, para que o cancelamento desta funo seja imediato. l) Aps o uso, utilizar um pincel fino para retirar todos os resduos provenientes da pesagem. m) Fechar o gabinete da balana e mant-la em stand-by.

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n) Realizar a manuteno preventiva anualmente ou semestralmente de acordo com o fluxo de utilizao.


3.5. Centrfuga

um equipamento que acelera o processo de sedimentao devido ao movimento centrfugo de rotao acelerado, no qual as partculas de maior densidade so arremessadas para o fundo do tubo. Condies gerais: Observe se a centrfuga est instalada em local livre de altas temperaturas. Os ps regulveis devem ser ajustados da mesma de modo que ela fique bem apoiada e nivelada (verifique a indicao do nvel). Certifique-se das boas condies da instalao eltrica. Para limpeza, utilize um pano mido com gua e sabo neutro. No utilize solventes, tais como benzina, thiner e lcool. Caso a mesma seja refrigerada, deve-se lig-la com antecedncia para que a temperatura esteja adequada antes da sua utilizao. Manejo: a) Verificar a instalao e se a voltagem da tomada compatvel com a do equipamento. b) Os tubos que iro para a centrfuga devem conter a mesma quantidade de material e devem ter o mesmo peso. c) Colocar os tubos, equilibrando no sentido transverso. d) Depois dos tubos equilibrados, deve-se fechar a centrfuga. e) Ligar a chave geral e ajustar o tempo e a velocidade de acordo com

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o que a tcnica pedir. f) Aps o trmino do tempo marcado, o equipamento desliga automaticamente. g) Esperar parar totalmente e abrir a tampa, retirando os tubos. h) Realizar a manuteno preventiva anualmente ou semestralmente de acordo com o fluxo de utilizao.
3.6. Capela e Cmaras de segurana

H muitos tipos de capelas e de cmaras, cada uma com seu prprio projeto e funcionalidade. Para identificar quais tipos voc necessita ou esto presentes em seu laboratrio ou saber exatamente qual tipo est presente em seu laboratrio, apresentamos abaixo uma lista de definies, descries e caractersticas tcnicas, suas vantagens e desvantagens. Capelas para Qumica geral & orgnica Uma capela de exausto um gabinete com ventilao forada, localizado em um ambiente laboratorial cujo layout deve estar corretamente projetado, de modo a proteger o operador mas no danificar o meio ambiente, utilizando um sistema de filtrao que leve para fora do edifcio os efluentes indesejveis provocados por procedimentos efetuados no interior da capela. Estes gabinetes podem ser construdos de alvenaria ou com materiais adequados para cada caso. obrigatrio que as capelas possuam uma

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janela envidraada que abra verticalmente e permanea aberta em qualquer posio (altura), uma vez que est balanceada por um sistema de contrapesos. Em alguns casos, dispe de um sistema defletor para direcionamento do fluxo de ar interno. O termo capela de exausto o mais difundido, mas outros termos tambm so utilizados, como capelas qumicas, gabinetes, etc. As capelas de exausto so, na realidade, um equipamento de proteo coletiva (EPC) do trabalhador em laboratrio, sendo disponveis no mercado em muitas formas, tamanhos, materiais e diferentes revestimentos, e devem ser configurados para acomodar uma grande variedade de procedimentos qumicos. Entretanto, esta flexibilidade pode oferecer equipamentos que resultem em diferentes desempenhos e nveis de proteo ao operador (Para mais detalhes, veja o captulo 1 de Biossegurana). Cmaras ou Cabines de segurana biolgica e fluxos laminares As cmaras ou cabines de segurana biolgicas (CSB) e os fluxos laminares so usados para a manipulao de agentes biolgicos, produo de diluentes e imunobiolgicos, meios de cultura e diversos materiais que precisam ser processados em ambiente estril. Alm disso, algumas capelas de fluxo laminar no apenas protegem o operador da exposio de produtos biolgicos como tambm precisam garantir a segurana do produto e do ambiente. Dessa forma, existem diferentes modelos de cabines, mas todos possuem filtros absolutos ou filtros Hepa, que possuem alta eficincia (no mnimo, 99,97% na coleta de partculas de at 0,3 micros) e devem ser substitudos periodicamente de acordo com sua saturao. Os fluxos podem ser encontrados em dois modelos, chamados de bancada limpa que no so de cmaras debiossegurana, pois ou liberam ar filtrado (HEPA) para a superfcie de trabalho ou para o operador:
Fluxo vertical Protege, principalmente, o operador das substncias

que est manuseando.

Conceitos e tcnicas bsicas aplicadas em laboratrios | 111

Fluxo horizontal Protege, principalmente, o produto que est

sendo processado. Somente podero ser envasados ou manipulados materiais que no tragam riscos de contaminao ao operador. As cabines de segurana biolgica podem ser divididas em 3 classes, sendo a classe II com vrias subdivises:
Classe I Fornece segurana pessoal e ambiental, mas no do produ-

to, funcionando como uma coifa provida de filtro HEPA para proteo ambiental. Sua utilidade no laboratrio muito limitada, geralmente usada para acondicionar equipamentos que podem gerar aerossis, como centrfugas.
Classe II Pode ser subdividida em vrios tipos (A, B1,B2 e B3).

Fornece proteo pessoal ambiental e do produto. O ar captado pela grelha frontal protegendo o operador e passando por filtros HEPA, diminuindo a contaminao na superfcie de trabalho interna. Na do tipo A, o ar filtrado recirculado ao laboratrio, sendo a mais comum nos laboratrios brasileiros devido ao fator custo/benefcio. Dentre as cmaras do tipo B e B1, a mais simples, funcionando como a do tipo A, porm com exausto externa. Na do tipo B2, no h nenhuma recirculao de ar dentro da cmara,o ar que entra filtrado, com reteno biolgica e qumica e filtrado antes de ser eliminado para o exterior. Na B3, a mais cara desta categoria, o cuidado para no haver nenhum tipo de vazamento de resduo qumico ou biolgico maior, protegendo mais o ambiente.
Classe III Fornece proteo mxima ao ambiente e ao operador. Foi

construda para atividades com nvel 4 de biossegurana, hermeticamente fechada com visor fixo, e tem luvas de borracha resistentes e acopladas. Seu acesso feito por caixa de porta dupla que poder ser descontaminada aps a operao, alm de os filtros possurem um incinerador de ar.

112 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Condies gerais: Verificar a voltagem da tomada da capela (110 ou 220 volts). Passar desinfetante no corrosivo antes e depois da operao se a categoria do equipamento permitir. Manejo: a) Ligar a ventilao e a lmpada ultravioleta por dez a quinze minutos. Durante esse tempo, no se deve aproximar da capela. b) Aps esse tempo, desligar a lmpada ultravioleta e ligar a luz fria. c) Se houver mostrador,verificar se a presso da ventilao est ideal. d) Utilizar luvas durante a manipulao do material biolgico, tomando cuidado para no fazer movimento muito brusco para no contaminar o material. e) Durante a manipulao do material, somente as mos do operador podero estar no interior do equipamento. f) Terminado o procedimento, desinfetar a bancada e desligar a luz fria e a ventilao. g) Se o equipamento apresentar algum problema no seu funcionamento, como falta de luz, por exemplo, os fusveis ou as lmpadas devero ser trocadas antes de chamar a manuteno. h) Uma vez por ano, deve-se agendar com o tcnico para que seja feita a manuteno preventiva.

Conceitos e tcnicas bsicas aplicadas em laboratrios | 113

3.7. Forno/estufa

Esse equipamento muito utilizado em laboratrios de sade, mas possui duas possibilidades de uso. A primeira se refere esterilizao de materiais e geralmente isso feito na temperatura de 180o C, durante duas horas. Nesse caso, chamamos de forno para secar e esterilizar materiais (forno Pasteur). A segunda tem como finalidade o acondicionamento de meios de cultura proporcionando o crescimento de microrganismos em temperaturas controladas, geralmente utilizando 36 oC para bactrias e 25 oC para fungos. Condies gerais: Tanto o forno quanto a estufa devem ter cmara externa e interna confeccionadas em ao com isolamento interno e na porta. A porta poder ser do mesmo material da carcaa ou de vidro especial, que permita a visualizao da parte interna. Existem vrios modelos com capacidade que vai de vinte a mais de trezentos litros e nmero variado de prateleiras. Precisam ser providos de termostato de controle, indicador de temperatura (termmetro) e regulador de temperatura. Manejo: a) O equipamento dever ser mantido na temperatura desejada (controle interno com termmetro de mximo e mnimo). b) No se deve abrir toda hora a porta do forno/estufa e nem deixar a porta aberta. c) No se deve guardar nenhum tipo de alimento nem utilizar o equipamento para aquec-los.

114 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

d) Todo material guardado no forno/estufa dever ser etiquetado, inclusive com o nome do responsvel. e) Dever ser observado o tempo de incubao dos lotes e dos diferentes microrganismos de acordo com suas necessidades, no momento da retirada dos produtos armazenados. f) Dever ser observado o tempo necessrio esterilizao/secagem no caso da utilizao como forno. g) A cada dois meses, deve-se proceder limpeza total. A limpeza deve ser feita da seguinte maneira:
Desligue o aparelho no boto on/off e retire a tomada; Abra as portas, deixando-as abertas durante todo o processo; Passe um pano para secar; Passe um pano com desinfetante hipoclorito de sdio (100 ppm). 4. Vidrarias de laboratrio

As vidrarias de laboratrio so categorizadas de acordo com o fim a que se destinam. Sendo assim, cada laboratrio vai demandar caractersticas especficas e muitas vezes com alto grau de exigncia, de tal forma que no se poder generalizar as especificaes, as lavagens e os tratamentos para todas as vidrarias. Por exemplo, um laboratrio de qumica necessitar de vidrarias volumtricas aferidas enquanto um laboratrio de bacteriologia ter como primeira exigncia vidrarias estreis. Se utilizarmos as vidrarias de um laboratrio de qumica para atendermos as necessidades dos microbiologistas, isto , esterilizarmos tal material em forno ou autoclave, deixaremos os tcnicos de qumica na mo, pois, na primeira esterilizao, toda vidraria perder a aferio e as vidrarias volumtricas construdas para se ter preciso no podero mais ser utilizadas para este fim com a dilatao do vidro submetido ao calor, terminase por descalibrar totalmente a referida vidraria.

Conceitos e tcnicas bsicas aplicadas em laboratrios | 115

As vidrarias volumtricas so construdas para conter precisamente um dado volume lquido e, com exceo das pipetas, possuem forma de pera, fundo chato e gargalo comprido. Podem ser providas ou no com tampa esmerilhada e normalmente so feitas de vidro resistente e com qualidade qumica que no altere o produto no seu interior. As vidrarias que tm como objetivo medir volumes lquidos devem ser calibradas para conter ou, ento, para livrar os volumes requeridos. Existem, ainda, utenslios semelhantes aos descritos a seguir, manufaturados em outros materiais como polmeros especiais. Seu uso depende da necessidade do laboratrio e, em alguns casos, podem ser descartveis.
Balo de fundo chato

Utilizado como recipiente para conter lquidos ou solues, ou mesmo para fazer reaes com desprendimento de gases. Pode ser aquecido em banho-maria quando no for necessria sua caracterstica volumtrica precisa.
Balo de fundo redondo

Dever ser utilizado acoplado a um suporte, uma vez que esse tipo de vidraria no possui estabilidade para ser colocado na bancada sem apoio. Normalmente, empregado em sistemas de refluxo e evaporao a vcuo, conectado a um roto-evaporador.
Balo volumtrico

O balo volumtrico um recipiente em forma de pera, de fundo plano e com um gargalo retilneo, comprido, estreito e com tampa que possui volume definido. utilizado para o preparo de solues em laboratrio.

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Erlenmeyer

Este frasco ideal para armazenar, aquecer e misturar produtos, podendo ser tambm utilizado em preparo de meios de cultura. Os modelos graduados so muito usados nos laboratrios de qumica para a realizao de titulaes com auxlio da bureta.
Becker

um tipo de recipiente de uso geral em laboratrio, normalmente utilizado para fazer reaes entre solues, dissolver substncias slidas, efetuar reaes de precipitao e aquecer lquidos. Geralmente graduado, pode ser usado para efetuar medidas imprecisas (normalmente com preciso variante em 5% do marcado). H dois tipos de becker: o de forma baixa e o de forma alta.
Tubo de ensaio

Tubos de vidro empregados para fazer reaes em pequena escala, principalmente em Microbiologia e Hematologia. So utilizados com ou sem tampa, em vrias atividades (ex.: centrifugao, triagem, cultura, etc.). Podem ser aquecidos utilizando acessrios apropriados, diretamente sob a chama do bico de Bunsen, em movimentos circulares.
Pipeta graduada

Vidraria constituda por um tubo de vidro graduado utilizado para medir e transferir

Conceitos e tcnicas bsicas aplicadas em laboratrios | 117

volumes. Permite medir volumes variveis, portanto, no pode ser aquecida. No vidraria de escolha para realizar medies precisas em qumica, uma vez que para tal existem as pipetas volumtricas.
Pipeta volumtrica

Vidraria constituda por um tubo de vidro com um bulbo na parte central. O trao de referncia relativo ao volume definido gravado na parte do tubo acima do bulbo. usada para medir lquidos com elevada preciso. No deve ser aquecida.
Bureta

Aparelho utilizado em anlises volumtricas, que consiste em um tubo longo com graduaes permanentes em linhas bem delineadas a fim de facilitar a leitura. Acompanha torneira de vidro ou teflon que permite o escoamento dos lquidos de forma uniforme. Geralmente, usada em laboratrios de qumica para prticas de titulaes.

Proveta

Instrumento cilndrico graduado utilizado para medir e transferir volumes variveis de lquidos em grandes quantidades, se necessrio. Pode ser encontrada em diferentes volumes. No pode ser aquecida.

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Condensador

Utilizado na destilao, tem como finalidade condensar vapores gerados pelo aquecimento de lquidos. Os mais comuns so os de Liebig e o de serpentina.

Funil de separao

Utilizado na separao de lquidos no miscveis e na extrao lquido/lquido.


Kitassato

Utilizado em conjunto com o funil de Buchner em filtraes (sob suco) a vcuo. constitudo de um vidro espesso e um orifcio lateral.

Dessecador

Recipiente fechado hermeticamente, contendo um agente desumidificante, usado para guardar substncias em atmosfera com baixo ndice de umidade.
Basto de vidro

O basto de vidro utilizado para agitar substncias, facilitando a

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homogeneizao. Auxilia tambm na transferncia de um lquido de um recipiente para outro.


Funil analtico

Usado na filtrao e para reteno de partculas slidas, podendo ser colocado papel de filtro no seu interior. No deve ser aquecido. Pode ser de vidro borosilicato ou de vidro alcalino. Possui diferentes tamanhos que vo definir sua capacidade volumtrica (ex.: 15 ml, 30 ml, 60 ml, 125 ml, 500 ml, 1.000 ml).
Funil de Buchner

Instrumento de porcelana utilizado em filtraes a vcuo. Pode ser usado com a funo de filtro em conjunto com o kitassato.

Vidro de relgio

Pea de vidro de forma cncava usada para separar pequenas quantidades de substncias, evaporar pequenas quantidades de solues, cobrir bqueres e outros recipientes, alm de auxiliar na pesagem de substncias no volteis e no higroscpicas. Por ser frgil ao calor direto, no pode ser aquecido.

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Gral e pistilo

O gral tambm chamado de almofariz. Usado na triturao e pulverizao de slidos em pequena escala. Pode ser de diferentes materiais (porcelana, gata ou polietileno) e diversos tamanhos (100 ml, 180 ml, 305 ml, 610 ml e 1.160 ml).
Cadinho

Pea geralmente de porcelana, mas que tambm pode ser de ferro, chumbo ou platina, cuja utilidade aquecer substncias a seco e com grande intensidade de calor, por isto pode ser levado diretamente ao bico de Bunsen.
Cpsula de porcelana

Pea de porcelana que apresenta paredes finas que no resistem ao atrito, usada para evaporar lquidos das solues e na secagem de substncias em estufas. Pode ser empregada, tambm, para a fuso de materiais slidos e ceras, no devendo ser utilizada na preparao de frmulas farmacuticas, pois podem liberar ons.
4.1. Outros equipamentos Anel ou argola

Acessrio usado para fixar alguns tipos de funil no suporte para a realizao da filtrao.

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Esptulas e colheres

Instrumentos confeccionados em inox ou polipropileno utilizados para transferir pequenos volumes ou misturar solues, sendo encontrados no mercado em diferentes tamanhos e formatos.
Estante para tubos de ensaio

Instrumento confeccionado em madeira ou metal (ao inox, alumnio, etc.), usado como suporte para tubos de ensaio. Possui diferentes dimetros e alturas para diferentes espessuras e comprimento de tubos. Pode ser levada estufa e, em alguns casos, cmara fria.
Garra de condensador

Acessrio de metal utilizado para prender o condensador haste do suporte ou outras peas como bales, erlenmeyers, etc.
Pina de madeira

Acessrio cuja finalidade prender o tubo de ensaio para que ele seja levado chama e possa ser manipulado, muitas vezes, fazendo uma pequena agitao durante o aquecimento.

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Pina metlica

Tambm chamada de tenaz, um acessrio usado para manipular objetos aquecidos, como cadinhos e cpsulas, entre outros.
Pissete ou frasco lavador

Garrafinha plstica com bico acoplado usada para lavagens de materiais atravs de jatos de gua, lcool ou outros solventes. Tambm serve como recipiente para esses lquidos.

Suporte universal

Acessrio feito em ferro utilizado em operaes como filtrao, suporte para condensador, bureta, sistemas de destilao, etc. Serve tambm para sustentar peas em geral.

Trip

Acessrio usado para ser colocado sobre a chama, geralmente, do bico de Bunsen, com o objetivo de efetuar aquecimentos de solues em vidrarias diversas de laboratrio.

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Garra dupla

Acessrio confeccionado em metal utilizado para fixar buretas ao suporte universal, principalmente nas prticas de titulao.

Referncias Bibliogrficas
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Captulo 3
Microscopia de luz
Pedro Paulo de Abreu Manso Marcelo Pelajo Machado 1. Introduo

Os conhecimentos que possumos hoje nas reas de Biologia Celular, patologia e histologia se devem ao desenvolvimento de tcnicas que nos possibilitaram ver um mundo fascinante. Com o avano tecnolgico, estas ferramentas se desenvolveram a um ponto que o microscpio se tornou fundamental em laboratrios de pesquisa e de diagnstico. Conhecer os fundamentos da Microscopia e a forma correta de utilizar um microscpio essencial para qualquer profissional que trabalha nessas reas. Neste captulo, iremos discutir princpios bsicos e algumas modalidades de microscopia de luz. Os microscpios de luz, como o prprio nome sugere, so microscpios que utilizam luz do espectro visvel ou no para gerar uma imagem. Tambm podem ser chamados de fotnicos, ou seja, que utilizam ftons, os quais so partculas de luz. Muitos microscpios, como o confocal, detectam a luz sob esta forma. Muitas vezes, estes microscpios so chamados de pticos, e de fato o so, pois as imagens so geradas com base em princpios da ptica.

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Contudo, os microscpios eletrnicos tambm utilizam princpios pticos para gerar a imagem, embora no usem luz e sim eltrons. Ento, chamamos de microscpio de luz aqueles que possuem uma fonte de luz para gerar a imagem e eletrnicos aqueles que utilizam eltrons.
2.Luz

Para compreender os princpios da microscopia fotnica, preciso conhecer algumas caractersticas da luz. Dependendo da ocasio em que observarmos o comportamento da luz, podemos consider-la como uma partcula ou como uma onda. Para a maior parte das explicaes aqui apresentadas, nos deteremos ao conceito de que a luz uma onda. A luz que enxergamos compreende uma pequena faixa do espectro de ondas eletromagnticas, que chamamos de regio visvel. Esta regio varia do violeta ao vermelho, o que numericamente pode ser expresso por cerca de 400 e 700 nanmetros (nm) de comprimento de onda. A luz branca que observamos normalmente formada pelo somatrio de todos os comprimentos de onda do espectro visvel. Algumas lmpadas especiais utilizadas em microscopia, como as de vapor de mercrio, emitem luz em espectros que ultrapassam essa regio. A luz pode sofrer interferncias que so fundamentais para o processo de formao da imagem, dentre as quais duas devem ser consideradas para o estudo da microscopia: a difrao e a refrao. A difrao est diretamente ligada ao processo de formao da imagem e a capacidade de resoluo de uma lente; j a refrao nos permitir entender tanto por que utilizamos meios de imerso para objetivas quanto o princpio da microscopia de contraste diferencial de interferncia. Para entender o que difrao, tomaremos o exemplo de um telhado de zinco perfurado, muitas vezes citado em msicas e poemas, como o transcrito a seguir, de um trecho da msica Cho de Estrelas, de Silvio Caldas e Orestes Barbosa.

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A porta do barraco era sem trinco Mas a lua furando nosso zinco Salpicava de estrelas nosso cho Tu pisavas nos astros distrada Sem saber que a ventura desta vida a cabrocha, o luar e o violo. (grifos nossos)

As estrelas que salpicavam o cho, to belamente citadas pelo poeta, na verdade fisicamente eram a luz da lua difratada, ao passar por um orifcio circular formado pelo furo no telhado de zinco. Se voc imaginar esta cena, vai perceber que, ao passar pelos pequenos furos no telhado, a luz se espalha formando um cone de iluminao que chega at o cho, onde ilumina, formando pontos circulares que o autor chamou de estrelas. Se observarmos este fenmeno esquematicamente (Figura 1), veremos a luz chegando ao orifcio e sendo difratada, o que gera um espalhamento dessa luz. Figura 1 O fenmeno da difrao da luz

Esquema apresentando o fenmeno da difrao, atravs do exemplo da luz da lua penetrando em um telhado de zinco. A luz que chega ao telhado sofre um espalhamento, formando um cone de iluminao at o cho. No detalhe, as ondas luminosas que chegam ao orifcio circular (furo no telhado) sendo difratada (esquerda). Detalhe de dois orifcios prximos, onde a luz difratada nestes orifcios sofre interaes positivas e negativas, que formaro regies claras e escuras (direita).

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Ao transportar este exemplo para a formao de imagem em um microscpio, vemos que cada amostra observada um telhado de zinco cheio de pequenos furos, onde a luz passa e sofre difrao. Toda amostra possui estruturas que esto separadas por uma distncia, que atuam da mesma forma que furos no telhado. A luz difratada de pontos prximos sofrer interaes positivas e negativas que iro gerar regies de alta luminosidade e de baixa luminosidade, que nos permitiro formar uma imagem da amostra. Alm disso, a capacidade que uma lente possui de distinguir dois pontos (resoluo) dada por sua capacidade de captar raios difratados. Quanto mais raios difratados uma lente captar, maior ser sua abertura numrica e consequente resoluo. A refrao da luz um fenmeno que ocorre devido a diferenas na velocidade em que a luz passa por determinados meios. Dependendo do ndice de refrao de alguns objetos, a luz passa de forma mais rpida ou mais lenta por este, o que pode gerar desvios que influenciam na percepo da imagem. Um exemplo fcil para compreendermos a refrao a viso de um peixe no fundo de um lago (Figura 2). Como o ndice de refrao da gua diferente do ndice de refrao do ar, observamos o peixe acima da profundidade em que ele realmente est, pois a luz sofre um desvio ao mudar de um meio para outro, no caso da gua para o ar. Figura 2 Exemplo de refrao da luz

Um homem observa o peixe no lago acima do nvel onde este realmente est. Isso se deve ao desvio que a luz sofre ao passar da gua para o ar, os quais possuem ndices de refrao diferentes. Arte grfica: Newton Marinho da Costa Jr.

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O caminho que a luz percorre nos microscpios faz com que um feixe luminoso passe por diferentes meios. No caso, por exemplo, da observao de preparados em lminas, a luz sofre refrao ao passar do vidro da lmina para o ar e, em seguida, do ar para o vidro presente na objetiva. Essa mudana de meios pode causar perda de raios luminosos que so refratados. A utilizao de um meio de imerso com um ndice de refrao semelhante ao do vidro reduz quase completamente essa perda.
3. Microscpios

O primeiro microscpio surgiu por volta de 1595, com os trabalhos do fabricante de culos holands Zacharias Janssen, que uniu duas lentes em um mesmo eixo, possibilitando a observao de pequenas estruturas. Em 1665, Robert Hooke construiu o primeiro microscpio que se baseava na utilizao de uma lente ocular prxima ao olho e uma objetiva. Os trabalhos de Hooke culminaram no livro Micrographia, o qual apresenta a descrio de diferentes seres vivos sob Microscopia. Neste tratado, encontra-se a primeira observao de cortes de cortias, onde foram visualizados poros chamados naquela ocasio de clulas. Desde ento, o microscpio vem sendo crescentemente considerado uma poderosa ferramenta para as cincias naturais, sendo aprimorado ao longo dos anos. Os microscpios de hoje so mais complexos que os da poca de Janssen e Hooke, mas seguem a mesma lgica de utilizar lentes associadas para gerar uma imagem ampliada. Na Figura 3, indicamos cada parte do microscpio. Como todo instrumento de preciso, os microscpios possuem uma parte mecnica que os sustentam e permitem sua regulagem. Esta parte composta de uma base e uma coluna, que suportam o microscpio; um tubo que une as objetivas s oculares; o macromtrico e o micromtrico, que fazem o ajuste de aproximao entre a objetiva e a amostra, possibilitando que a amostra seja focalizada; uma platina e um charriot, que permi-

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tem a movimentao da amostra; e o revlver, que sustenta as objetivas e permite a troca destas quando necessrio. Alm dos elementos mecnicos, o microscpio possui ainda componentes pticos, que so: a fonte de iluminao, que normalmente em microscpios convencionais uma lmpada de halognio; o diafragma de campo; o condensador, que concentra os raios luminosos na amostra; o diafragma do condensador que possibilita a regulagem correta do contraste no microscpio; e as lentes objetivas e oculares, que do o aumento e a resoluo da imagem. A ampliao obtida em um microscpio dada pelo produto entre o aumento da objetiva e o aumento da ocular. Portanto, se estivermos utilizando uma objetiva de 40x e uma ocular de 10x, estaremos ampliando o objeto analisado em 400x. Na parte ptica, os microscpios ainda possuem as lentes do tubo, que ficam no interior do canho (ou tubo) e so responsveis por formar a imagem ampliada da objetiva na regio de foco da ocular. Figura 3 Principais elementos pticos e mecnicos de um microscpio de luz

Microscopia de luz | 131

Algumas amostras no podem ser observadas em microscpios retos pois no cabem no espao entre a platina e a objetiva. Garrafas de cultura, por exemplo, no podem ser observadas nestes microscpios, pois a amostra fica muito longe da objetiva. Para este tipo de espcime, utilizamos microscpios invertidos, cuja fonte de iluminao est localizada acima da platina e as objetivas esto posicionadas abaixo desta (Figura 4). Figura 4 Microscpio invertido

Obs.: Note que as objetivas esto abaixo da platina e a fonte de iluminao encontra-se na parte superior.
4. Aumento x resoluo

Durante a rotina em laboratrios de pesquisa e diagnstico, muito frequente a necessidade de utilizar microscpios. Esses equipamentos nos permitem observar muito alm de nossa capacidade visual. As medidas utilizadas em um microscpio ptico so da ordem de micrmetros ( mm), que equivalem milsima parte de um milmetro. Para termos ideia do que isso, podemos pegar uma rgua e tentar dividir o espao de um milmetro em mil pedaos. Isso seria impossvel, pois no somos capazes, sem o auxlio de ferramentas apropriadas, de enxergar ou fazer traos com espessura suficiente.

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Veramos estes traos como um borro. Isso acontece pois nossos olhos no so capazes de aumentar esta rgua a ponto de enxergarmos o espao entre as linhas, alm de no possurem resoluo suficiente para distinguir este espao. Os microscpios no s nos auxiliam aumentando as estruturas observadas, mas tambm a resoluo de nossa viso. A resoluo a capacidade de distinguir dois pontos prximos. A resoluo mxima de nossos olhos em torno de 200 mm, o que quer dizer que dois pontos separados por uma distncia menor que esta so observados como um nico ponto, como no caso das linhas da citada rgua. O microscpio nos permite aumentar esta resoluo para cerca de 0,2 mm. Voltando ao exemplo, observaremos uma rgua micromtrica de 2 mm dividida em duzentas partes. Se tirarmos uma foto desta rgua e ampliarmos com zoom digital, o que observamos uma nica linha na vertical. Isso ocorre porque, embora tenhamos ampliado a imagem, no modificamos a resoluo. Se, em uma outra ocasio, utilizando agora uma lente com maior resoluo, observarmos a mesma rgua, seremos capazes de distinguir os traos que a dividem (Figura 5). Figura 5 Rgua de 2 mm dividida em duzentas partes

(A) Foto com mquina fotogrfica convencional. (B) Zoom digital da imagem A. Houve um aumento sem ganho de resoluo. (C) Imagem adquirida com uma lente objetiva de aumento 2,5x com resoluo superior da mquina fotogrfica. possvel ver os traos maiores. (D) Fotomicrografia com uma lente objetiva de 10x e resoluo superior s anteriores. Podemos observar os traos que compem a rgua.

Microscopia de luz | 133

5. Objetivas

muito comum olharmos para as lentes que ficam afixadas no revlver do microscpio apenas para averiguar qual o aumento com o qual estamos analisando nossa amostra. No entanto, essas lentes, que por serem o elemento ptico mais prximo da amostra so chamadas de objetivas, representam muito mais do que isso. Na verdade, elas so provavelmente o componente mais importante do sistema ptico de um microscpio, sendo determinantes na resoluo da imagem, no contraste com o qual os detalhes so visualizados, na profundidade do espcime do qual obtida informao e tambm no dimetro do campo de anlise. Nesse sentido, os demais elementos pticos do microscpio so importantes e podem at atuar corrigindo ou modificando o padro da luz, mas, de fato, servem mesmo para ampliar e manter a qualidade da imagem gerada pelas objetivas. Entende-se por lente um dispositivo habitualmente feito de vidro, capaz de produzir convergncia ou divergncia de raios luminosos que por ele passem. As objetivas modernas, na verdade, so compostas por vrios desses elementos, chegando a conter at 15 ou 16 lentes na sua construo interna. Existem objetivas de diversas especificaes e, portanto, destinadas a aplicaes mais gerais ou mais especficas. Essas caractersticas, detalhadas a seguir e apresentadas na Figura 6, esto anotadas no corpo da lente: Figura 6 Exemplo de objetiva com indicao dos campos nela gravados

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5.1. Fabricante

Nome da empresa responsvel pela montagem da objetiva.


5.2. Denominao (classe de objetiva e correo cromtica)

A geometria ptica possui limitaes que precisam ser levadas em conta em Microscopia. Nesse sentido, alguns efeitos indesejados podem ocorrer com a luz quando esta atravessa uma lente, aos quais denominamos aberraes. Por exemplo, duas aberraes ocorrem no mesmo eixo da objetiva: a aberrao esfrica, na qual os raios que passam pelo eixo da lente e os que passam pela periferia possuem pontos de foco diferentes; e a aberrao cromtica, na qual o mesmo ocorre em relao aos diferentes comprimentos de onda. O termo grafado neste campo se refere classe e ao tipo de correo que a objetiva possui. Pode variar um pouco de acordo com o fabricante, mas, de forma geral, encontramos as seguintes especificaes: a) Plan: as lentes planas apresentam correo esfrica, ou seja, todo o campo est em foco. Achroplan so mais recomendadas para uso em luz transmitida e Epiplan o so para luz refletida. b) Achromat: lentes acromticas que possuem correo cromtica para duas cores. comum que as correes estejam combinadas. Assim, por exemplo, lentes planacromticas (Planachromat) corrigem tanto o foco das duas cores quanto a homogeneidade de foco do campo de anlise. c) Apochromat: lentes acromticas que possuem correo cromtica para quatro cores. Da mesma forma que o item anterior, podem ter tambm correo esfrica, passando a se chamar planapocromticas (Planapochromat). d) Fluar: lentes que possuem elementos de fluorita (fluoreto de clcio). No possuem o campo plano, mas so excelentes para microscopia de

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fluorescncia. Existem lentes desse tipo com correo esfrica ( PlanFluar ou PlanNeofluar), mas que tm menor taxa de transmisso de luz em fluorescncia, embora sejam excelentes para microscopia de polarizao e de contraste de interferncia. Todas as lentes Fluar possuem correo cromtica para trs ou quatro cores. A classe se refere ao tipo de aplicao para a qual aquela objetiva foi desenhada. Assim, utilizando como exemplo as lentes da fabricante Carl Zeiss, podem constar, entre outros, os seguintes termos: a) LD (long working distance): para trabalho com grande distncia do espcime, como em culturas de clulas sob anlise em microscpios invertidos. b) EC (enhanced contrast): ideais para fluorescncia. c) LCI (life cell imaging): desenhadas para trabalho com clulas vivas. d) C (C-Apochromat): para microscopia confocal. e) W ou WN: desenhadas para aplicaes em eletrofisiologia.
5.3. Magnificao/abertura numrica

O primeiro valor, antes da barra, indica a magnificao, ou seja, quantas vezes aquela objetiva capaz de ampliar a imagem da amostra. Aps a barra, consta a abertura numrica (NA), a qual pode ser expressa pela seguinte frmula: NA = n (sen ), onde: a) n o ndice de refrao do meio entre a objetiva e a lamnula/ amostra; b) metade do ngulo de abertura da objetiva. Assim, importante reparar que, quanto maior a abertura numrica de uma objetiva, mais curta ser a sua distncia de trabalho. Na prtica, lentes

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com NA maior que 0,95 tendem a necessitar de um meio de imerso para boa captao da luz. fundamental observar tambm que a NA que indica a verdadeira capacidade de resoluo (d) daquela lente, uma vez que esta ltima diretamente proporcional ao comprimento de onda (l) e inversamente proporcional ao dobro da abertura numrica (NA), como expresso na equao: d = l / 2NA A partir dessa frmula, podemos observar que, sob um mesmo comprimento de onda (543 nm, por exemplo), uma objetiva 100x/0,75 tem uma resoluo (d = 362 nm) inferior de uma 63x/1,40 (d = 194 nm).
5.4. Mtodo de contraste

Se a lente contiver um anel de fase no seu interior (destinado microscopia de contraste de fase), ela indicar Ph, seguida de um nmero, o qual varia de acordo com o fabricante. Para esse tipo de microscopia, importante que se observe que este nmero deve ser o mesmo em relao ao indicado no anel que ser colocado no condensador. A presena desse anel no interior dessas lentes reduz a quantidade de luz por elas transmitida, de maneira que no so habitualmente indicadas para microscopia de fluorescncia. Da mesma forma, as inscries Pol e DIC se referem adequabilidade da lente microscopia de polarizao e de contraste de interferncia, respectivamente.
5.5. Meio de imerso

As lentes que exigem a utilizao de meio de imerso e, portanto, no devem trabalhar com ar entre elas e o espcime sob anlise trazem escrita uma das opes a seguir:

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a) Oil : leo de imerso para microscopia. Este habitualmente tem ndice de refrao (n) prximo a 1,51. Alguns fabricantes produzem leos especiais, com este mesmo n, mas especialmente desenvolvidos para uso em microscopia de fluorescncia. b) W : gua. Deve-se empregar gua destilada. O uso de leo de imerso nessas lentes pode danific-las. c) Korr: Essas lentes possuem um anel que as ajusta para o uso com leo para microscopia, gua ou glicerina (Gly). Cabe mencionar que, de maneira geral, o mais adequado usar um meio de imerso que tenha um n semelhante ao meio de montagem da amostra que est sendo analisada. Nesse sentido, se precisarmos usar uma lente que exija imerso, habitualmente escolhemos, por exemplo, uma que trabalhe com leo para amostras montadas em blsamo do Canad e uma que trabalhe com gua para clulas em cultura. A no observncia dessa regra pode ocasionar uma grande queda na intensidade da luz captada e no contraste, por conseguinte gerando uma imagem de qualidade inferior desejada.
5.6. Comprimento do tubo

Indica se aquela objetiva foi desenhada para trabalho em distncia fixa (habitualmente 160 mm) ou se corrigida para ptica infinita ( ou ICS). Essa distncia chamada de comprimento mecnico do tubo e vai da base da objetiva at a insero das oculares.
5.7. Espessura mxima da lamnula

Habitualmente, indica algo como 0,17 ou 0,19 0,15, que corresponde espessura de lamnulas padro. A presena de um sinal de negativo (-) aponta que esse ndice no interfere na qualidade da imagem da objetiva. Por sua vez, o nmero zero (0) indica que essa lente deve ser

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usada em preparaes sem lamnula. Assim como ocorre em algumas lentes de imerso, algumas objetivas possuem um anel de regulagem para a espessura da lamnula. Cabe mencionar que, por vezes, a espessura do material presente entre o espcime e a objetiva pode ser bem maior que os valores mencionados, como o caso de placas ou garrafas usadas em culturas de clulas. Nesses casos, habitualmente empregamos microscpios invertidos dotados de lentes LD, que permitem o trabalho com distncias de mais de um milmetro. Ainda sobre todas essas informaes contidas nas objetivas, cabe comentar que alguns fabricantes usam cores diferentes nas letras ou anis coloridos para indicar, por exemplo, o mtodo de contraste que aquela lente possui, sua magnificao e o meio de imerso necessrio.
6. Como utilizar um microscpio

O microscpio um equipamento caro e frgil. Deve, portanto, ser manipulado com muito cuidado. Para observar uma lmina ao microscpio, preciso: a) Ligar o microscpio na tomada, observando a voltagem correta, a fim de evitar danos aos componentes eletrnicos do equipamento. b) Aumentar a intensidade da luz aos poucos. c) Colocar a lmina na platina e focaliz-la com a menor objetiva. d) Regular o microscpio pelo ajuste de Khler (ver a seguir). e) Trocar a objetiva sempre focalizando, at chegar ao aumento de interesse. f) Ao final da observao, a luz deve ser diminuda e em seguida desligada. g) Com o auxlio do macromtrico, a platina deve ser afastada totalmente da objetiva.

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h) A lmina deve ser retirada. i) A menor objetiva deve ser selecionada. j) Retirar da tomada a fonte de alimentao. l) Cobrir o microscpio com uma capa de pano, para proteg-lo de poeira. Se objetivas de imerso forem utilizadas, deve-se retirar o leo da objetiva com o auxlio de um papel absorvente, passando-o delicadamente para no arranhar a lente. A limpeza das lentes objetivas e oculares do microscpio deve ser feita com uma soluo de lcool-ter (9:1). O uso de xilol e outros solventes orgnicos deve ser evitado, pois pode causar descolamento das lentes.
7. Iluminao de Khler

Desenvolvida por August Khler em 1893, a iluminao de Khler o ajuste dos planos focais do microscpio, promovendo a coincidncia dos focos do diafragma de campo, do objeto, da imagem formada no tubo do microscpio e a imagem formada para o observador. O ajuste da iluminao permite que a luz seja aproveitada integralmente e que a imagem possua o melhor contraste possvel. Para realizar a iluminao de Khler, preciso inicialmente focalizar uma lmina (Figura 7A). Em seguida, fecha-se o diafragma de campo que formar um crculo ou um hexgono luminoso (Figura 7B). Com os parafusos do condensador, deve-se centralizar esta figura geomtrica no campo visual (Figuras 7C e 7D). As bordas deste hexgono devem ficar ntidas, com o auxlio do ajuste de foco do condensador (Figura 7D). Em seguida, abre-se o diafragma de campo at que a regio iluminada ocupe o campo visual, sem que ultrapasse estes limites (Figura 7E).

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Para finalizar o ajuste do microscpio, retira-se com cuidado a ocular para correta observao do diafragma do condensador. Este deve ocupar aberto cerca de 80% do campo, dando assim o contraste ideal para a amostra (Figura 7F). Figuras 7A a 7F - Etapas para obteno da iluminao de Khler

8. Tipos de Microscopia de luz 8.1. Microscopia de campo claro

o tipo de Microscopia bsica, em que no h interferncias no caminho ptico. Todo microscpio de luz possui esta forma de Microscopia. Na microscopia de campo claro, a luz parte da fonte luminosa, concentrada pelo condensador, interage com a amostra e coletada pela objetiva. A imagem ampliada pela objetiva formada na lente do tubo e mais uma vez ampliada pelas oculares, at chegar ao observador (Figura 8). Como o prprio nome sugere, na microscopia de campo claro o fundo da imagem branco. Para que a imagem seja observada neste tipo de Microscopia, necessrio que a amostra possua cor prpria ou que esta lhe tenha sido conferida

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artificialmente. A cor permite um maior contraste entre as estruturas que possibilita sua correta observao. Figura 8 Microscopia de campo claro

esquerda, caminho da luz em um microscpio de campo claro reto, mostrando a luz saindo do diafragma de campo, passando pelo condensador, onde concentrada na amostra, e sendo captada pela objetiva. Acima, fotomicrografia de clulas sanguneas de anfbio, coradas por Giemsa e observadas sob microscopia de campo claro.

8.2. Contraste de fase

Algumas amostras so observadas ao microscpio sem colorao, como, por exemplo, clulas em cultura. Para observao de amostras muito finas que no podem ser coradas, deve-se utilizar tcnicas microscpicas de alto contraste. A Microscopia de contraste de fase se baseia no atraso que raios difratados apresentam em relao a raios no difratados. Ao passar pela amostra, os raios difratados adquirem uma diferena de velocidade de de comprimento de onda em relao aos no difratados. Essa diferena pode ser eliminada se os raios que no foram difratados forem acelerados ou retardados. Para tal, utilizase um anel de fase no condensador e na objetiva, que une os raios difratados e os no difratados, aumentando assim as interaes positivas e negativas entre estes raios e, consequentemente, o contraste da imagem (Figura 9).

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Figura 9 Microscopia de contraste de fase

Imagem de campo claro de clulas em cultura no coradas (esquerda). Imagem em contraste de fase do mesmo campo (direita).

Para que uma amostra seja observada neste tipo de Microscopia, preciso que haja um anel de fase no condensador e objetivas especficas, identificadas com as letras Ph (Figura 10). Inicialmente, deve-se regular o microscpio, selecionar no condensador o anel de fase e a objetiva de fase. Para ajustar a fase, devemos retirar uma das oculares com cuidado e alinhar o anel de fase da objetiva ao anel de fase do condensador, alinhando a regio sombreada de um com a do outro. Em seguida, colocamos a ocular em seu local para a anlise do espcime. Figura 10 Objetiva e condensador para microscopia de contraste de fase

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8.3. Polarizao

A microscopia de polarizao permite que substncias com capacidade de desviar a direo da luz, chamadas de anisiotrpicas, sejam observadas seletivamente. Estas substncias podem estar depositadas normalmente nos tecidos ou serem ligadas a determinadas estruturas por mtodos tintoriais. Este tipo de microscopia muito utilizado para observao de sais, rochas, cristais, cabelo, ossos, entre outras amostras que possuam em seu interior substncias anisiotrpicas. O microscpio de polarizao possui um funcionamento semelhante ao de campo claro. So adicionados apenas um cristal polarizador, que ir selecionar apenas um plano da luz incidente, e um cristal analisador, que ir bloquear a passagem da luz incidente que no sofreu desvios e selecionar apenas a luz que foi desviada por uma substncia anisiotrpica. Para realizao desta microscopia, basta selecionar o polarizador e o analisador e variar sua angulao, at que a imagem seja formada com um fundo preto (Figura 11). Figura 11 Microscopia de polarizao

Fotomicrografia de material corado por Picrosrius sob observao microscopia de polarizao. Esta colorao especial prpria para identificar fibras colagnicas.

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8.4. Contraste diferencial de interferncia de Nomarski (DIC)

A Microscopia de contraste diferencial de interferncia (DIC) permite que amostras no coradas sejam observadas com alto contraste e sensao de profundidade. Espcimes ligeiramente mais grossos que no podem ser observados em contraste de fase podem ser observados em DIC. Em uma amostra, diferenas de composio e espessura entre regies geram ndices de refrao ligeiramente diferentes. Essa diferena faz com que a luz atravesse o espcime com velocidades distintas. Na dcada de 1950, o fsico francs Georges Nomarski utilizou este princpio para criar um tipo de microscopia de alto contraste. O contraste de Nomarski consiste na utilizao de um analisador, semelhante ao da microscopia de polarizao, que seleciona a luz em uma nica direo. Em seguida, a luz dividida em dois feixes ligeiramente afastados por um prisma (prisma de Wollaston). Essa separao faz com que uma regio da amostra seja iluminada por um feixe e outra adjacente seja iluminada por outro. Depois de interagir com a amostra, esses feixes so reunidos por um segundo prisma e, em seguida, passam por um analisador que seleciona os feixes que sofreram mudana de angulao (Figura 12). A combinao destes feixes de luz, que interagiram com diferentes regies da clula, criar interaes positivas e negativas que iro gerar uma imagem de alto contraste (Figura 13). Figura 12 Elementos pticos da microscopia de DIC

(A) Primeiro prisma de Wollaston situado antes do condensador. (B) Prisma de Wollaston da objetiva. (C) Segundo prisma de Wollaston encaixado sob a objetiva.

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Figura 13 Microscopia de DIC

Clula em cultura observada em DIC, evidenciando a sensao de relevo dada por este tipo de microscopia.

8.5. Microscopia de fluorescncia

Algumas substncias apresentam propriedade fluorescente, ou seja, quando excitadas, com uma determinada fonte de energia, emitem luz. Esse fenmeno foi descrito pela primeira vez pelo cientista ingls George G. Stokes, ao trabalhar com um mineral que apresentava essas propriedades. A fluorescncia ocorre quando eltrons de uma molcula so excitados e mudam de camada eletrnica, passando a ocupar uma camada mais energtica. Estes eltrons voltam a seu estado original emitindo luz. A luz emitida apresenta energia menor que a recebida durante a excitao. Isso se deve a uma ligeira perda de energia sob a forma de calor. preciso lembrar que o comprimento de uma onda eletromagntica inversamente proporcional sua energia, ou seja, quanto menor a energia, maior o comprimento de onda. Portanto, a luz emitida de uma molcula fluorescente possui um comprimento de onda maior que a fonte de energia que a excitou. Esse fenmeno pode ser representado de forma esquemtica pelo diagrama de Jablonski (Figura 14).

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Figura 14 Diagrama de Jablonski

Um eltron em seu estado normal de energia excitado e elevado a um estado S1 em uma camada mais energtica. Este eltron retorna camada original, perdendo parte da energia sob a forma de calor e parte emitindo luz, em um comprimento de onda maior. Arte grfica: Newton Marinho da Costa Jr.

O primeiro microscpio que utilizava o princpio da fluorescncia foi construdo por August Khler no incio do sculo XX. Contudo, sua aplicao era limitada. Somente com o desenvolvimento de anticorpos ligados a fluorforos (molcula fluorescente), cerca de cinquenta anos depois, foi possvel sua utilizao em grande escala nos laboratrios. Os microscpios de fluorescncia utilizam a luz como fonte de excitao. As substncias fluorescentes, ao serem iluminadas por esta fonte, emitem luz em um comprimento de onda maior, ou seja, de menor energia. As molculas fluorescentes utilizadas como sondas para microscopia, em geral, apresentam um espectro de excitao e de emisso conhecidos. Como a luz emitida possui comprimento de onda diferente do de excitao, possvel separ-las por filtros que limitam a passagem de luz em faixas determinadas. Dessa forma, possvel garantir que a imagem observada gerada apenas onde h molculas fluorescentes (Figura 15). Se, por exemplo, esta molcula estiver ligada a anticorpos, podemos ento dizer que a imagem gerada representa os locais onde aquele anticorpo se ligou.

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Quando observamos uma amostra em um microscpio de fluorescncia, estamos observando a luz emitida pela amostra. Neste caso, a luz proveniente da fonte luminosa no passa pela amostra, sofrendo interferncias que iro gerar a imagem, como na microscopia de campo claro. A luz uma fonte de energia que ir apenas excitar a molcula fluorescente. A imagem formada pela luz emitida pela prpria amostra. Os microscpios de fluorescncia atuais geralmente utilizam como fonte luminosa lmpadas de vapor de mercrio ou xennio, capazes de emitir luz branca de alto brilho. Uma faixa desta luz selecionada por um filtro de excitao, no comprimento de onda ideal de excitao da molcula fluorescente. Os fluorforos presentes na amostra so excitados e emitem luz em um comprimento de onda maior que o da excitao, que pode ser selecionado por um filtro de emisso e detectado pelo observador ou por uma cmera fotogrfica. Figura 15 Clula VERO em cultura, marcada com faloidina-FITC

Essa droga capaz de interagir com filamentos de actina, os quais ento podem ser visualizados microscopia de fluorescncia.

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Os principais tipos de filtro utilizados em microscpios de fluorescncia so: Filtros de passagem curta (Short-pass filters): so frequentemente utilizados como filtros de excitao, transmitem luz em uma faixa ligeiramente acima de um valor determinado em comprimentos de onda e refletem ou absorvem outros comprimentos de onda. Filtros de passagem longa (Long-pass filters): transmitem uma grande faixa de luz acima do valor determinado em comprimento de onda e reflete ou absorve valores abaixo. Filtros de faixa (Bandpass filters): transmitem uma regio compreendida entre duas faixas de comprimento de onda, refletindo ou absorvendo as demais. O caminho ptico dos microscpios de fluorescncia (Figura 16) diferente dos demais anteriormente apresentados neste captulo. A fonte de luz passa pela objetiva antes de chegar amostra. Portanto, a luz que chega ao espcime e a que emitida passa pelo mesmo caminho ptico. Para separ-las, alm dos filtros de emisso e excitao, utilizamos um espelho dicrico, que reflete um determinado comprimento de onda e transmite ou seja, deixa passar outros comprimentos de onda. Os filtros e espelhos utilizados ficam unidos em um cubo localizado acima da objetiva.

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Figura 16 Caminho ptico de um microscpio de fluorescncia

A luz parte de uma lmpada policromtica, passa por uma lente condensadora que concentra os raios e, em seguida, por um filtro de excitao que seleciona o comprimento de onda especfico para o fluorforo observado (feixe azul). Dentro do cubo de fluorescncia se encontram o filtro de excitao, um espelho dicrico e o filtro de emisso. A luz refletida pelo espelho dicrico passa pela objetiva, sendo concentrada na regio iluminada da amostra. O espcime marcado com um fluorforo emite luz (feixe verde), que transmitida pelo espelho dicrico e selecionada pelo filtro de emisso. A imagem final formada pela ocular e pode ser observada diretamente. Arte grfica: Newton Marinho da Costa Jr.

8.6. Microscopia confocal

A Microscopia confocal se baseia no princpio da confocalidade, descrito pela primeira vez por Marvin Minski, em 1955, no qual dois anteparos fsicos com um orifcio do tamanho da cabea de um alfinete (pinholes) so colocados junto fonte de iluminao e ao detector. Estes orifcios esto no mesmo plano focal que a amostra, ou seja, esto em foco. Os anteparos funcionam como uma barreira fsica que impede a passagem dos raios luminosos das regies que no esto em foco, possibilitando que a imagem formada seja apenas a do plano focal.

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Para que uma amostra seja observada em microscpios fotnicos convencionais, preciso que esta seja fisicamente cortada em fatias muito finas. Inicialmente, isso se deve ao fato de que a luz precisa atravessar a amostra. Alm disso, os planos iluminados iro gerar imagens em foco e fora de foco. Cortes espessos possuem muitos planos fora de foco, os quais iro criar uma imagem borrada que dificultar a observao da imagem em foco. No caso da microscopia confocal, como os planos fora de foco so eliminados pela ao do pinhole, cortes relativamente espessos podem ser facilmente analisados, pois somente o plano em foco ser observado. Isso permite que espcimes inteiros sejam observados sem a necessidade de cortar fisicamente a amostra. Se movimentarmos o micromtrico, aproximando e afastando a amostra da objetiva, iremos variar o plano que estar em foco (Figura 17). Com o auxlio de um computador, podemos unir as imagens de diferentes planos focais e formar assim uma montagem tridimensional desta amostra. Figura 17 Imagem de filamentos de actina em cultura de clulas observadas sob microscopia confocal

Cada imagem representa um plano ptico de 0,6 micrmetros de espessura.

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A maioria dos microscpios confocais utilizam lasers como fonte de iluminao. Estes geram um tipo de luz monocromtica de alta coerncia e intensidade, que compensa a perda de luz causada pela utilizao do pinhole. Por se tratar de uma luz puntiforme, a iluminao por laser no capaz de formar uma imagem completa do campo sob observao. Por conta disso, a imagem final montada por um programa de computador a partir de aquisio ponto a ponto. Por esse motivo, no possvel que o pesquisador observe a imagem confocal diretamente nas oculares do microscpio. A luz emitida pela amostra captada por detectores especiais chamados fotomultiplicadores. Estes captam ftons e geram sinais eltricos de intensidade proporcional quantidade de sinal captado. Existem dois tipos de fotomultiplicadores: 1) monocromticos, que detectam qualquer fton, sendo necessria a seleo do comprimento de onda especfico a ser observado, que feito pela utilizao de filtros; 2) policromticos, que possuem regies com afinidade especfica por um determinado comprimento de onda. O caminho ptico de um microscpio confocal pode ser esquematizado no desenho a seguir (Figura 18). O feixe luminoso parte do laser e interage com um ponto da amostra que emite fluorescncia. A fluorescncia emitida pelo plano que est em foco captada pelo detector enquanto os planos que no esto em foco so eliminados.

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Figura 18 Esquema mostrando o caminho ptico em um microscpio confocal

Notar que somente o plano da amostra que est em foco observado enquanto os demais so eliminados pelo pinhole. Arte grfica: Newton Marinho da Costa Jr.

9. Consideraes finais

Neste captulo, tivemos como objetivo central delinear alguns princpios de microscopia, enfatizando seus componentes essenciais e apresentando resumidamente os tipos de microscopia de luz mais empregados, cujo conhecimento mandatrio aos profissionais tcnicos que atuam em laboratrio. importante enfatizar que a microscopia de luz um conjunto de tcnicas de complexidade bem maior do que a aqui apresentada. Alm disso, esta profundamente dinmica, no sentido que o contnuo desenvolvimento de novas tecnologias, sejam pticas ou mecnicas, tem impacto direto na sua evoluo e, portanto, na sua aplicao.

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Dessa maneira, a todo o momento, surgem novos componentes para microscpios de luz (ex.: iluminao por LEDs, novas objetivas, fotomultiplicadores de nova gerao, entre outros), assim como so desenvolvidas novas modalidades de microscopia (ex.: TIRF, iluminao estruturada, spinning disk, entre outras). Cabe ao profissional que utiliza essa ferramenta estar sempre atualizado para que possa sempre obter o mximo de informao possvel de suas amostras.
Bibliografia consultada
BENCHIMOL, M. Mtodos de estudo da clula. FENORTE/UENF, 1996. BCHERL, W. Introduo s tcnicas microscpicas. 4 ed. Editora Polgono, So Paulo. 1972. DAVIDSON, M.W. and Abramowitz, M., Optical Microscopy, Encyclopedia of Imaging Science and Technology, Hornak, J. (ed.), 2, 1106-1141, 2002. KAPITZA, HG. Microscopy from the very beginning. Carl Zeiss, Oberkochen.1994 PAWLEY, JB. Handbook of biological confocal microscopy. 2 ed. Plenum press, New York. 1995.

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Captulo 4
Animais de laboratrio
Etelcia Moraes Molinaro Joel Majerowicz Sebastio Enes R. Couto Cleide Cristina Apolinrio Borges Wildeberg Cal Moreira Simone Ramos 1. Consideraes gerais

A pesquisa cientfica, o ensino e as atividades relacionadas ao desenvolvimento tecnolgico e produo e ao controle da qualidade de vacinas e medicamentos utilizam-se de animais de laboratrio. Seu uso com objetivos cientficos ainda absolutamente necessrio para alcanar avanos na compreenso da biologia descobrindo-se novos medicamentos para o tratamento ou a profilaxia de enfermidades e permitindo pesquisas bsicas, desenvolvimento tecnolgico, ensino, produo e testes de imunobiolgicos. Uma vez que ainda no h sistemas alternativos disponveis que permitam a substituio completa dos animais, necessrio o estabelecimento de uma cultura de cuidados, conscincia e responsabilidade dirigidos melhoria e confiabilidade das descobertas cientficas e ao bem-estar animal.

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Os biotrios1 so planejados de forma a atender s diretrizes de Biossegurana2 e garantir as condies adequadas de trabalho com animais, suas secrees e seus tecidos, alm de considerar a transmisso de zoonoses 3 e os riscos inerentes aos agentes potencialmente perigosos. A utilizao de animais de laboratrio permite vrias abordagens experimentais que no so possveis, ou mesmo permitidas por lei, em seres humanos. Alm disso, possvel mant-los em condies controladas (em biotrios) que permitam estudar uma doena, seu agente patognico, os sinais clnicos e sua prpria evoluo. H tambm algumas linhagens de animais que so geneticamente padronizadas e auxiliam a compreenso de fatores ambientais e genticos que incidem na evoluo de determinada enfermidade, sendo assim, possvel estud-las em raas e/ou linhagens criadas para esse fim. Animais de laboratrio ou modelos biolgicos so aqueles utilizados com o intuito de alcanar analogia dos resultados experimentais que seriam transferidos para os homens e outros animais. Por exemplo, em estudos pr-clnicos, uma das etapas mais importantes para a pesquisa na rea da sade. Estes animais so selecionados, criados em biotrios com adequaes quanto segurana biolgica, tem seu comportamento, origem e linhagem conhecidos, recebem cuidados especiais para a manuteno de seus ambientes (alojamentos, temperatura e umidade controlados) e ofertada nutrio adequada visando ao seu bem-estar.

Biotrios: casa da vida. Termo genrico que designa o local onde criado ou mantido qualquer animal de laboratrio ou modelo experimental. 2 Conjunto de aes voltadas para a preveno, minimizao ou eliminao de riscos inerentes s atividades de pesquisa, produo, ensino, desenvolvimento tecnolgico e prestao de servios, visando sade do homem e dos animais, a preservao do meio ambiente e a qualidade dos resultados (TEIXEIRA & VALLE, 1996). 3 Zoonoses so doenas transmitidas entre animais e o homem.

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tica e bem-estar: princpios

O controle da experimentao animal regido por legislaes restritivas internacionais que impulsionam a maior conscientizao dos cientistas envolvidos na manipulao e adoo de boas prticas. consenso que, alm da atualizao da formao tcnica, imperioso exigir conscientizao tica e imputao de responsabilidade legal na manipulao animal. Organizaes de fomento para pesquisas, protocolos internacionais de produo de vacinas e medicamentos, bem como para a publicao de resultados em perodicos cientficos, exigem que todos os trabalhos que se utilizem de animais sejam avaliados, monitorados e licenciados por Comisses de tica no Uso de Animais (CEUAs)4 visando ao seu bem-estar. A Associao Mundial de Veterinria (WVA), por exemplo, sugere requisitos de bem-estar animal que devero ser seguidos:
Ausncia de fome e sede (gua e comida adequadas espcie). No podem permanecer desconfortveis. O ambiente animal deve

possuir abrigo e local para descanso.


Preveno e diagnstico de enfermidades, bem como providenciar os

melhores meios para evitar dor, traumatismos e injrias.


Os animais devem possuir liberdade para manifestarem comportamen-

tos normais e estar em companhia de outros de sua espcie.


Assegurar as melhores condies para que no ocorra estresse, medo

e situaes aflitivas. Ressalta-se que os beneficirios de vrios experimentos, vacinas e medicamentos so os prprios animais, no campo da medicina veterinria.
Comisses de tica so rgos colegiados institudos obrigatoriamente em instituies que se utilizam de animais para fins cientficos.
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Em 1959, foi sustentada pelos cientistas W. M. S. Russel e R. L. Burch a ideia dos trs Rs (reduo, refinamento e substituio - o terceiro erre replacement, do ingls) sendo considerados como princpios bsicos no mundo cientfico contemporneo para verificar os objetivos, as necessidades e a importncia da utilizao de animais pelos cientistas. fundamental ter-se a conscincia de que o animal, como ser vivo, possui hbitos de vida prprios da sua espcie, apresenta memria, preserva o instinto de sobrevivncia e sensvel angustia e dor, razes que preconizam posturas ticas tanto na criao como no desenvolvimento dos estudos experimentais.
2. Conceitos bsicos Edificao e instalaes prediais

Os biotrios classificam-se basicamente em criao e experimentao. Os de criao se destinam reproduo e/ou manuteno das diversas espcies e linhagens de animais, com o objetivo de manter o padro gentico e sanitrio das colnias, atravs de tcnicas de manejo zootcnico 5 e procedimentos operacionais (POP). Os biotrios de experimentao so destinados realizao dos experimentos e testes com animais. O desenvolvimento de projetos de arquitetura e o planejamento operacional de biotrios so processos criativos que devem ser cuidadosamente avaliados de acordo com as espcies animais envolvidas. Os riscos associados aos experimentos e outras particularidades para estas instalaes tambm
Manejar: em sua forma literal, significa conduzir ou trabalhar com as mos. Na rea animal, um conjunto de tcnicas de reproduo, criao e manuteno que propicie bem-estar comportamental e fisiolgico e que garanta os padres gentico e sanitrio.
5

Animais de laboratrio | 159

so considerados. O projeto arquitetnico das instalaes prediais, as barreiras sanitrias e as barreiras de conteno so elaborados de modo a facilitar as atividades e atender as condies ambientais prprias s espcies, minimizando ou mesmo eliminando a ocorrncia de contaminaes (animais, pessoal e de ambientes). As instalaes so fisicamente separadas de outras construes e planejadas visando correta higienizao e desinfeco e para facilitar a manuteno predial e de seus equipamentos. Os fluxos de processos e pessoal devem ser delineados para que no ocorra o cruzamento entre entrada e sada desses elementos, evitando a contaminao. A arquitetura de um biotrio compreende uma estrutura bsica composta de salas de animais entre dois corredores. Na Figura 1, observa-se um esquema da estrutura bsica de um biotrio com as instalaes necessrias para a criao, manuteno e experimentao de roedores e coelhos. Estas instalaes tambm so adequadas para a manuteno de primatas no-humanos. Figura 1 Desenho esquemtico bsico de um biotrio

reas comuns (administrao e vestirios). rea de lavagem contendo depsitos, tanque de imerso, autoclaves de dupla porta, guichs de passagem. Antecmara de acesso, corredores limpo (de distribuio) e sujo (de recolhimento) e quarentena. Salas de animais, procedimento ou laboratrios.

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Algumas recomendaes:
As superfcies de pisos, paredes e tetos devem ser lisas, resistentes e

impermeveis, fceis de lavar e desinfetar. Acessrios internos, como luminrias, dutos de ar e tubulaes, so instalados de modo a evitar pontos de acmulo de poeira. Uma pia para higiene das mos deve estar disponvel prxima da sada das salas, provida de torneira com acionamento por pedal, com o cotovelo ou automtica. A exausto do sistema de ar condicionado diretamente para o exterior do prdio, sem recirculao dependendo do nvel de biossegurana exigido.
A quarentena possui dois objetivos: avaliar a sade e dar condies

aos animais de se recuperarem do transporte, aclimatando-se ao novo ambiente. Se possvel, a quarentena deve ser isolada de outras reas do biotrio. Em primatas, a quarentena necessariamente realizada em ambientes externos rea de criao e seus procedimentos so os mais restritos. Ainda para este animal, o local da quarentena possui reas contguas para apoio diagnstico e de cuidados de manejo.
As reas para estocagem de raes secas, equipamentos e materiais

utilizados pelos animais devero ser arejadas, a fim de minimizar a proliferao de microrganismos e evitar outras contaminaes. Um refrigerador ou uma cmara frigorfica deve estar disponvel para o armazenamento de hortifrutigranjeiros.
A rea de higienizao, desinfeco e esterilizao isolada e afastada

das salas de animais, para no causar distrbios a eles, uma vez que as autoclaves e os equipamentos de higienizao geram nveis elevados de rudos, umidade e calor. A ventilao deve ser suficiente para evitar o acmulo de odores e temperaturas elevadas, e os tanques so dimensionados para a higienizao e desinfeco dos diversos materiais de uso na manuteno animal. O ideal que haja separao entre ambientes limpo e sujo.

Animais de laboratrio | 161

As salas de animais so construdas de forma a permitir a separao por

espcie/linhagem. So isoladas dos outros ambientes e constantemente higienizadas. S permitido o acesso aos trabalhadores habilitados manipulao animal. Nos biotrios de experimentao, cada pesquisa desenvolvida em ambiente exclusivo e salas especiais devem ser preparadas para os estudos que envolvam o uso de radiaes, agentes infecciosos com alto potencial de risco e substncias txicas.
A paramentao dos trabalhadores, de uso exclusivo, obrigatria nas

reas tcnicas, de forma a no carrear possveis contaminantes. Conforme a classificao microbiolgica dos animais, a higienizao corporal dos trabalhadores obrigatria no acesso e na sada da rea controlada.
Barreiras sanitrias ou de conteno

As barreiras sanitrias ou de conteno compreendem as instalaes prediais, os equipamentos e materiais utilizados para esterilizao ou desinfeco e os procedimentos de boas prticas. Essas barreiras so determinadas em funo das espcies e da quantidade de animais, tipos de materiais, fluxos de processos, manejo animal etc. Sero mais complexas quanto maior forem a exigncia microbiolgica e/ou os riscos biolgicos associados. O biotrio deve possuir como condies mnimas:
Sistema de ventilao apropriado assegurando a filtrao do ar para

evitar a contaminao de reas contguas.


Possuir um programa de controle peridico de animais invasores, utili-

zando produtos qumicos no txicos para vertebrados.


Fazer uso de sistemas que impeam o refluxo de gua, gases e a

penetrao de insetos e outros animais.


Higienizao ambiental regularmente.

162 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Materiais, equipamentos, alimentos e todos os insumos vindos do

exterior podem estar contaminados e devem ser esterilizados ou desinfetados e estocados em local especfico. As barreiras sanitrias ou de conteno impedem que partculas indesejveis tenham acesso s reas de criao ou de experimentao e que agentes patognicos se dispersem no ambiente, garantindo o status sanitrio dos animais. Alguns equipamentos so essenciais para garantir o status sanitrio dos animais de criao ou de experimentao:
Autoclave o principal equipamento utilizado na esterilizao de

materiais e insumos, uma vez que a esterilizao por calor sob presso um dos mtodos mais seguros e confiveis. Os materiais autoclavveis so: gaiolas, tampas de gaiolas, frascos bebedouros, comedouros, ninhos, materiais de enriquecimento ambiental, bicos, forrao de gaiolas,6 uniformes, fichas e raes. Em biotrios de experimentao, recomendado que existam duas autoclaves: um para entrada de matrias e insumos e outro para descontaminao de resduos e materiais, evitando o contrafluxo.
Estufa de xido de etileno Equipamento utilizado para materiais

que no podem ser esterilizados por calor. O gs de xido de etileno atua oxidando as protenas dos seres vivos presentes nos materiais, promovendo sua inativao. Os materiais normalmente processados neste equipamento so os mesmos citados para a autoclave, com exceo de raes e material de forrao das gaiolas, pois concentram o gs que pode intoxicar os animais se ingerido ou inalado.
6

Para forrao de gaiolas, so utilizados a maravalha (raspas de madeira especial), sabugo de milho etc. tambm chamada de cama.

Animais de laboratrio | 163

mos. Os isoladores comportam vrias gaiolas de pequenos animais dependendo de sua capacidade. Existe uma variedade de modelos de isoladores, como os rgidos e os flexveis, providos de filtros de entrada e sada de ar, onde a renovao do ar mantida atravs de ventilao forada, com presso positiva ou negativa.7 A introduo de insumos e materiais feita pelo porto de passagem8 com auxlio do cilindro de esterilizao,9 onde os materiais foram previamente esterilizados. A utilizao de isoladores com presso negativa, em estudos com risco biolgico, confere ao pesquisador um eficiente mtodo de segurana, alm de propiciar a vantagem de ter numa mesma sala isoladores com inculos diferentes.
Microisolador So gaiolas para pequenos animais com tampa com

Isoladores Utilizado para criar e manter animais livres de microrganis-

filtro, que isolam o ambiente interno da gaiola. So indicadas para preservar a condio microbiolgica dos animais e tambm para evitar que aerossis do seu interior se dispersem pelo ambiente. H o inconveniente de uma menor troca de ar da gaiola com o ambiente, aumentando a temperatura, a umidade relativa e a concentrao de gases. Todas as atividades que necessitam da abertura deste tipo de gaiola sero realizadas em cabine de conteno biolgica.

Mdulo para microisoladores Existem dois tipos. Um possui portas

e o fluxo de ar filtrado circula por todo o ambiente interno do mdulo. No outro tipo, as gaiolas contm filtro e vlvulas para conexo de ar individual e no tm porta, pois a circulao do ar restrita ao seu interior. Esses equipamentos podem ser de presso positiva ou negativa.
Presso positiva ou negativa em biotrios est relacionada ao diferencial de presso entre duas reas ou ambientes diferentes. A movimentao de ar segue um fluxo contnuo e controlado da rea de maior presso para a de menor presso. Isto impede que partculas em suspenso circulem ou sejam carreadas de um ambiente para outro. 8 Porto de passagem: abertura do isolador que, por mtodos qumicos, pode ser esterilizada e permitir a entrada e sada de materiais, insumos e animais. 9 Cilindro de esterilizao: acessrio utilizado em isoladores para esterilizao de materiais e insumos.
7

164 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

So equipamentos de conteno primria10 que tm como uma das principais vantagens a conteno de aerossis e de alrgenos no interior da gaiola. Como vantagem adicional, h o controle dos parmetros relativos temperatura, umidade relativa e ventilao, propiciando um ambiente favorvel aos animais.
3. Biossegurana

Diferente de laboratrios, os biotrios possuem caractersticas particulares. Pelo fato de alojarem animais, h sempre riscos associados a seu manejo. Alm deste, outros riscos associados aos biotrios so os riscos qumicos, fsicos e ergonmicos.11 Os riscos qumicos esto relacionados principalmente ao uso rotineiro e de grandes quantidades de desinfetantes e sanitizantes na higienizao de materiais e ambientes, bem como de substncias txicas ou perigosas utilizadas na experimentao animal. J os riscos fsicos envolvem o modo como os animais se defendem perante os fatores de estresse ou medo. Arranhaduras e mordeduras so as causas mais representativas de acidentes. Os problemas de ergonomia esto associados ao levantamento de materiais e cargas de peso considervel e aos movimentos repetitivos na troca de gaiolas e de outras prticas no manejo animal. Os animais so reservatrios naturais de vrias zoonoses e podem, portanto, abrigar ou serem suscetveis a agentes infecciosos capazes de causar doenas tambm nos seres humanos (riscos biolgicos). Dependendo da sensibilidade individual dos trabalhadores, podem ocorrer srios distrbios de sade, pois os animais produzem constantemente, atravs de dejetos, urina,
Conteno primria: a proteo individual e do ambiente diante de um agente infeccioso. Essa conteno se efetiva pelo emprego de tcnicas de manejo animal e pelo uso de equipamentos de proteo individual e/ou coletivo. 11 a cincia que estuda as relaes da adequao do ambiente de trabalho ao homem. (COSTA e COSTA, 2003).
10

Animais de laboratrio | 165

secrees e descamao da pele, substncias causadoras de alergias (reao de hipersensibilidade).


Risco biolgico e nveis de proteo

Forma de escape O agente infeccioso pode ser expelido pelos animais por via natural ou artificial. Excrees do agente pela urina, saliva e fezes ou atravs de leses na pele so exemplos. H vrios mecanismos de escape artificial, como bipsia, coleta de sangue, tecidos e fluidos corpreos, necropsia e instrumental cirrgico contaminado. Transmisso A transmisso do agente do animal ou do laboratrio pode ocorrer por vrias rotas. A mais frequente envolve agulhas e seringas contaminadas e a formao de aerossis e sua fcil disseminao uma forma comum de transmisso. Exposio A inalao, o contato com membranas mucosas e a inoculao parenteral so as formas de exposio mais frequentes. Os mecanismos mais comuns de exposio, quando animais de laboratrio esto envolvidos, so:
Inoculao direta por agulhas, contaminao de cortes ou arranhes

preexistentes por instrumentos contaminados e agresso animal;


Inalao de aerossis durante o manejo animal e nos procedi-

mentos e manipulao na experimentao animal;


Contato das membranas mucosas dos olhos, boca ou narinas

por gotculas de materiais, mos e superfcies contaminadas;


Pipetar com a boca, embora esta ingesto seja pouco comum, uma

vez que as Boas Prticas Laboratoriais (BPL) desaprovam esta ao. As caractersticas do animal, o agente infeccioso envolvido, o treinamento e a experincia do pessoal, as atividades e os procedimentos requeridos na experimentao devem ser considerados na avaliao e seleo das regras de biossegurana.

166 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Os laboratrios que manipulam microrganismos patognicos ou que tenham a possibilidade de cont-los no material de trabalho so especiais. Nesses ambientes de trabalho, h risco de se contrair doenas infecciosas tanto pelo pessoal que nele trabalhe como para os que esto prximos. A minimizao ou mesmo a eliminao dos riscos se tornam possveis quando se faz uso das BPL e empregamse normas de biossegurana especficas ao nvel do risco.
Conteno So mtodos e tcnicas, procedimentos e prticas, equipa-

mentos de proteo individual e coletivo e condies de instalaes laboratoriais que devem ser empregados ou condio bsica preconizada na manipulao ou estocagem de agentes infecciosos no ambiente laboratorial. A finalidade da conteno eliminar ou reduzir a exposio do pessoal, do laboratorial e do ambiente externo ao agente de risco.
Conteno primria a proteo individual e do laboratrio diante de um

agente infeccioso. Essa conteno se efetiva pelo emprego de tcnicas laboratoriais e pelo uso de equipamentos de proteo individual e/ou coletivo.
Conteno secundria a proteo das reas externas ao laboratrio de

uma contaminao do agente em uso. Isso ocorre por meio de instalaes, sistemas de utilidades prediais e mtodos operacionais.
Recomendaes de biossegurana em biotrios

O nvel de biossegurana de um experimento determinado segundo o microrganismo de maior risco.Existem quatro nveis de biossegurana, crescentes em funo do grau de conteno e complexidade do nvel de proteo. A seleo do nvel apropriado de biossegurana para o trabalho com um determinado agente ou em experimentos com animais depende de inmeros fatores. Alguns mais importantes so: virulncia, patogenicidade,12 estabilidade biolgica, meio de propagao, natureza e funo do laboratrio, procedimentos e manipulaes envolvendo o
a capacidade do patgeno de causar enfermidades e suas manifestaes clnicas nos hospedeiros suscetveis.
12

Animais de laboratrio | 167

agente, endemicidade13 do agente e existncia de vacina ou medidas teraputicas efetivas (Tabela 1).
Tabela 1 Recomendaes de biossegurana para atividades com vertebrados
Nvel
1

Agentes de risco
No causa doena.

Prticas
Manejo e procedimentos padres preconizados para animais e vigilncia sanitria. As prticas do nvel 1 mais: acesso limitado; smbolo de risco biolgico; alerta de precauo; manual de biossegurana; descontaminao de todo material infeccioso e gaiolas de animais antes da lavagem. As prticas do nvel 2 mais: acesso controlado; descontaminao das roupas antes de lavar; descontaminao de gaiolas antes de remover a forrao da gaiola; desinfeco de calados. As prticas do nvel 3 mais: entrada com troca de roupas onde roupas pessoais so retiradas e paramentao apropriada usada; banho na sada; todo material descontaminado antes de removido do biotrio.

Equipamentos (Barreiras primrias)


Os normalmente preconizados para alojamento das espcies animais.

Instalaes (Barreiras secundrias)


Biotrio convencional; sem recirculao de ar; o direcionamento de ar recomendado.

Associado com doena humana. Contaminao por autoinoculao, ingesto e exposio de membranas mucosas.

Os equipamentos do nvel 1 mais: equipamentos de conteno apropriado por espcie; equipamentos de proteo individual (EPI); proteo facial e respiratria, se necessrio.

As instalaes do nvel 1 mais: autoclave; pia na sada da rea de animais.

Nativo ou extico com potencial de risco por aerossis; doenas que podem causar srios efeitos sade.

Os equipamentos do nvel 2 mais: equipamentos de manuteno e manuseio de animais; cabines classe I ou II para manipulao que possam criar aerossis (inoculao, necropsia etc.); EPI; proteo respiratria apropriada.

As instalaes do nvel 2 mais: separao fsica entre corredores de acesso; acesso por dupla porta com fechamento automtico; autoclave no biotrio; janelas lacradas; aberturas seladas.

Agentes perigosos / exticos que ponham em risco a vida por inexistncia de tratamento; transmisso por aerossis ou agente relacionado com riscos desconhecidos de transmisso.

Os equipamentos do nvel 3 mais: equipamentos de conteno mxima (classe III) ou equipamento de conteno parcial em combinao com proteo total do corpo, suprimento de ar sob presso, usado em todos os procedimentos e prticas.

As instalaes do nvel 3 mais: prdio separado ou em zona isolada; sistema de suprimento e exausto de ar, vcuo e descontaminao exclusivos; outros requerimentos especficos.

Carter de endmico de uma enfermidade. Presena de uma doena ou de um patgeno em uma populao ou rea geogrfica.
13

168 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Os requerimentos de construo, os procedimentos, as prticas, os equipamentos e as precaues que devem ser consideradas na elaborao de projetos e no desenvolvimento de atividades que envolvam animais vertebrados e em funo do nvel de biossegurana esto descritos a seguir.
Nvel de biossegurana 1
Prticas padres

A Acesso ao biotrio limitado ou restrito ao critrio do coordenador. B Fazer a higienizao das mos aps manusear culturas e/ou animais e aps remover as luvas e antes de sair do biotrio. C Nas reas de animais, no permitido comer, beber, fumar, estocar alimentos de uso humano, aplicar cosmticos e manusear lentes de contato. D Todos os procedimentos devem ser realizados cuidadosamente, visando a minimizar a formao de aerossis. E As superfcies de trabalho devem ser descontaminadas aps o uso ou imediatamente aps o derrame de material vivel. F As portas das salas de animais devem abrir para seu interior e serem de fechamento automtico. G Todo resduo proveniente da sala de animais deve ser apropriadamente descontaminado, preferencialmente por autoclave, antes de ser disponibilizado como lixo. Carcaas de animais so incineradas. H Deve haver um programa efetivo para controle de insetos e roedores.

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Prticas especiais

A O coordenador do biotrio o responsvel pelo acesso limitado s reas de animais e deve informar dos riscos potenciais a quem precisa entrar nessas reas. Em geral, pessoas em condies que possam elevar os riscos de aquisio de infeces no devem ter acesso s reas de animais. B O coordenador do biotrio deve estabelecer diretrizes e procedimentos pelos quais as pessoas tomaro conhecimento dos riscos em potencial e procedimentos especficos antes de terem a liberao para o acesso s salas de animais. C O material utilizado para forrao das gaiolas removido de forma a minimizar a criao de aerossis e deve ser descartado em concordncia com os requerimentos apropriados (legais ou institucionais). D As gaiolas podem ser lavadas manualmente ou em mquinas. A temperatura final de enxgue na lavagem mecnica deve ser de 82,7C (180F). E Deve-se usar roupas apropriadas (jalecos, aventais ou uniformes) na rea de animais. Recomenda-se que o uniforme de uso no biotrio no deva ser usado em outras reas. F Um manual de biossegurana preparado e adotado. As pessoas so informadas dos riscos especiais e requerido que elas leiam e sigam as instrues, prticas e/ou procedimentos.
Equipamentos de segurana (barreiras primrias)

No so requeridos equipamentos de conteno para animais no nvel 1 de biossegurana.

170 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Instalaes (barreiras secundrias)

A O biotrio deve ser projetado e construdo visando a facilitar a limpeza, desinfeco e manuteno. B Pias para higiene das mos devem estar disponveis em diversas reas do biotrio. C No caso de existncia de janelas que se abram, estas devem estar protegidas contra a penetrao de insetos. D A exausto de ar deve ser descarregada para o exterior do prdio, sem recircular por outros ambientes.
Nvel de biossegurana 2
Prticas padres

Todas as recomendaes do nvel de biossegurana 1.


Prticas especiais

Todas as recomendaes do nvel de biossegurana 1, acrescidas de: A Quando agente(s) patognico(s) estiver (em) sendo usado(s) nas salas de animais, deve-se assegurar que todas as providncias requeridas e necessidades especiais de entrada sejam efetivadas ou estejam disponveis, tais como vacinao e EPI. B Um aviso com smbolo universal de biossegurana deve ser afixado no acesso da rea de risco e na porta da sala de animais. O aviso de risco deve identificar o agente patognico em uso, nome e telefone dos supervisores ou outros responsveis e indicar os EPI requeridos para entrada na sala. C As pessoas devem receber imunizao apropriada quando uma vacina estiver disponvel.

Animais de laboratrio | 171

D Avaliaes sorolgicas peridicas das pessoas, considerando o agente de risco, uma medida que deve ser adotada quando tcnicas para tal estiverem disponveis. E Um manual de biossegurana deve ser elaborado e adotado. Todos devem ser informados de riscos especiais e so instrudos a ler e seguir as instrues de prticas e procedimentos. F Todos devem receber treinamento apropriado em riscos associados com o trabalho e aprender sobre as precaues para prevenir exposies aos riscos. Devem receber, anualmente, reforo de treinamento ou treino adicional quando houver mudanas de procedimentos tcnicos e operacionais. G Preocupao adicional deve ser observada com materiais e utenslios contaminados (agulhas, seringas, lminas, pipetas, tubos capilares). Agulhas e seringas ou outros utenslios perfurocortantes so restritos s reas de animais para uso somente quando no h alternativas, como inoculaes parenterais, coleta de sangue ou aspirao de fluidos de animais e de frascos. Tubos plsticos devem ser usados em substituio aos de vidro, quando possvel. H Agulhas descartveis nunca devem ser dobradas, cortadas, quebradas, reencapadas ou removidas de seringas descartveis ou outra forma de manipulao, com as mos, depois de descartadas. Preferencialmente, elas devem ser cuidadosamente colocadas em um recipiente resistente a perfuraes usado para materiais descartveis. Utenslios no descartveis so obrigatoriamente colocados em recipientes de paredes espessas para transporte rea de descontaminao. I Frasco de vidro quebrado no deve ser manuseado diretamente com as mos, e sim removido mecanicamente atravs de

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vassoura e p de lixo ou pinas. Recipiente para agulhas, peas de equipamentos e cacos de vidro devem ser descontaminados antes de descartados. J Culturas, tecidos animal e fluidos corpreos so colocados em recipiente que previna vazamento durante a coleta, o manuseio, o processamento, o estocagem, o transporte ou o envio. K Gaiolas so apropriadamente descontaminadas, preferencialmente por autoclave, antes da limpeza e lavagem. L Equipamentos e superfcies de trabalho devem ser descontaminados com desinfetante apropriado em uma rotina bsica aps o trmino do trabalho com materiais infecciosos e especialmente aps o derrame, gotejamento ou outra forma de contaminao com esse material. M Equipamentos contaminados devem ser descontaminados de acordo com as recomendaes antes de serem enviados ou disponibilizados para reparo ou manuteno ou transportados para fora das instalaes. N Derramamentos ou acidentes que resultem em exposio ao material infeccioso so imediatamente relatados ao coordenador do laboratrio. Acompanhamento mdico providenciado e os registros devem ser mantidos. O Animais que no estejam envolvidos no trabalho em andamento no so permitidos no biotrio.
Equipamentos de segurana (barreiras primrias)

A Cabine de Segurana Biolgica (CSB) e EPI (ex.: proteo respiratria, mscaras faciais) so usados sempre que procedimentos com alto potencial de formao de aerossis so conduzidos. Isso in-

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cluiu necropsia, coleta de tecidos ou fluidos de animais, inoculao intranasal e manipulaes com alta concentrao ou grande volume de material infeccioso. B Apropriada proteo facial e respiratria usada por todas as pessoas que entrem nas salas de primatas no-humanos. C Aventais, jalecos ou uniformes so usados nas reas de animais. Essas roupas de proteo so retiradas antes de sair dessas reas. D Especial cuidado deve ser tomado para evitar a contaminao da pele com materiais infecciosos. O uso de aventais com manga comprida e luvas obrigatrio quando manusear animais infectados e quando o contato de material infectado com a pele for inevitvel.
Instalaes (barreiras secundrias)

Todas as recomendaes do nvel de biossegurana 1, acrescidas de: A Se houver ralos, esses devem possuir tampas e serem sifonados de forma a conter sempre um volume de gua e/ou soluo desinfetante. B recomendado, porm no exigido, que a direo do fluxo de ar seja para o interior da sala de animais. C Autoclave, que pode ser usada para descontaminao de resduos e outros materiais do biotrio, deve estar alocada nessa instalao. D A exausto das CSBs ou de outros equipamentos de conteno descarregada diretamente para fora da edificao. E Deve haver um sistema de gerador de energia eltrica para atender as reas crticas da edificao.

174 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Nvel de Biossegurana 3
Prticas padres

Todas as recomendaes do nvel de biossegurana 1.


Prticas especiais

Todas as recomendaes do nvel de biossegurana 2, acrescidas de: A proibido o acesso de pessoas com maior propenso a riscos, incluindo-se crianas, mulheres grvidas e pessoas que so imunodeficientes ou esto imunosuprimidas. O coordenador tem a responsabilidade final para definir cada circunstncia e determinar quem pode entrar ou trabalhar no biotrio. B Todos os resduos oriundos das salas de animais so descontaminados, preferencialmente por autoclave, antes de disponibilizados como lixo ou enviados para reprocessamento. C Todas as carcaas de animais so incineradas. Animais mortos so transportados da sala de animais para o incinerador em recipientes hermticos e prova de vazamentos. D O trabalho sempre realizado por pelo menos duas pessoas. No permitido acessar sozinho as reas de animais.
Equipamentos de segurana (barreiras primrias)

Todas as recomendaes do nvel de biossegurana 2, acrescidas de: A EPI so usados para todas as atividades que envolvam manipulaes de material infeccioso ou animais infectados. B Uniformes de frente fechada ou de frente slida so usados pelas pessoas para entrar nas salas de animais. Vestimentas com botes na parte anterior so inadequadas ou imprprias. As

Animais de laboratrio | 175

vestimentas devem ser acondicionadas em recipientes antes de encaminhadas para descontaminao. C As luvas so removidas assepticamente e autoclavadas como outros resduos das salas de animais antes de descartados. D Apropriadas protees de olhos, face e respiratria so usadas por todos que entram nas salas de primatas no-humanos. E Deve-se fazer uso, quando indicado, de calados, sapatilhas ou outra proteo dos calados. A desinfeco desses obrigatria na sada da rea de experimentao. F Conteno fsica e equipamentos apropriados para cada espcie animal so usados para todos os procedimentos e manipulaes de material infeccioso e animais infectados. G O risco de infeco por aerossis, provenientes dos animais ou do material usado na forrao das gaiolas, pode ser reduzido ou mesmo eliminado se os animais so alojados em gaiolas com filtro (mini-isoladores), sendo a abertura das gaiolas em local de ventilao fechada (CSB).
Instalaes (barreiras secundrias)

Todas as recomendaes do nvel de biossegurana 2, acrescidas de: A O biotrio construdo obrigatoriamente separado de outras reas abertas e que no tenham restrio de trnsito de pessoas. B Uma antecmara com portas intertravadas um requerimento bsico antes da rea de animais. C Separao fsica das salas de animais dos corredores de acesso ou de outras reas de trabalho deve ser por dupla porta intertravada.

176 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

D As superfcies das paredes internas, dos pisos e dos tetos devem ser resistentes gua e ao calor moderado para facilitar a limpeza. E As tubulaes e os dutos so selados ou possveis de serem selados para facilitar a fumigao ou descontaminao. F As pias devem ter torneiras de acionamento por pedal, com o cotovelo ou automtica e devem ser alocadas prximas da porta de sada. G O processo usado para descontaminao de efluentes com risco biolgico deve ser validado fsica e biologicamente pelo uso constante de registro de temperatura atravs de sensor, em conjunto com um indicador microbiolgico com uma definida suscetibilidade ao calor. H Efluentes de banho podem ser descarregados no sistema sanitrio sem tratamento. I Se um sistema de vcuo usado, cada ponto de servio deve ter sifo com lquido desinfetante e filtros Hepa. J Visores ou janelas nas salas de animais no podem ser de abrir e so seladas. K Autoclave para descontaminao de resduos obrigatria no biotrio e deve ser de dupla porta, de forma a retirar os materiais e resduos diretamente da rea aps a descontaminao. L O sistema de ventilao e exausto de ar sem recirculao. O insuflamento e a exausto so balanceados de forma a ter um direcionamento de ar para o interior das salas de animais. M O sistema central de exausto em instalaes com trabalhos em CSB classe III tratado por passagem atravs de filtro Hepa antes de descarreg-lo no exterior do prdio. Os filtros Hepa so localizados o mais prximo possvel do ambiente, de modo a minimizar a extenso do risco potencial de contaminao do duto.

Animais de laboratrio | 177

N Deve haver um sistema de gerador de energia eltrica para atender a todo o sistema da edificao.
Nvel de Biossegurana 4
Prticas padres

Todas as recomendaes do nvel de biossegurana 3.


Prticas especiais

Todas as recomendaes do nvel de biossegurana 3, acrescidas de: A Somente pessoas envolvidas nos programas ou que do suporte tcnico so autorizadas a entrar nas instalaes ou em uma determinada sala de animais. B O acesso ao biotrio limitado por segurana e portas trancadas. O acesso controlado pelo supervisor do biotrio, pela chefia da biossegurana ou por outra pessoa responsvel pela segurana fsica do prdio. C Antes de permitir o acesso s reas de experimentao, as pessoas so advertidas dos riscos em potencial e instrudas sobre como devem se proteger. Elas devem concordar e se comprometer a seguir todos os procedimentos de entrada e sada. D Um protocolo para situaes de emergncia deve ser estabelecido. E Avaliao sorolgica peridica do pessoal, considerando o agente de risco, uma medida que deve ser adotada quando tcnicas para tal estiverem disponveis. F Entrada e sada de pessoal do biotrio deve ser feita somente atravs de troca de roupas e banho. Pessoal toma banho a cada vez que sai do biotrio.

178 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

G As roupas so removidas em rea prpria e depositadas em recipiente apropriado e especfico. A paramentao completa inclui roupas de baixo, cala, camisa ou jaleco, calados e luvas. Quando da sada, a paramentao retirada no interior da rea prpria antes de entrar no boxe de banho. Roupas usadas so autoclavadas antes de lavadas. H Suprimentos e materiais que so trazidos para o interior da instalao so introduzidos por autoclave de dupla porta, cmara de fumigao ou antecmara. I Deve ser estabelecido procedimento para relato de acidentes no biotrio e exposies a agentes patognicos. J necessrio existir, nas instalaes, uma rea de quarentena, isolamento e cuidados mdicos para pessoa com suspeita ou com conhecida enfermidade associada ao trabalho. K Materiais e animais no relatados no experimento no so permitidos nas instalaes.
Equipamentos de segurana (barreiras primrias)

Todas as recomendaes do nvel de biossegurana 3, acrescidas de: A Animais infectados com agentes classificados no risco 4 so alojados em gabinetes de mxima conteno em rea especial em que todas as pessoas so requeridas a usar roupa com presso positiva e sistema de suporte de oxignio. B Trabalhos com vrus que requerem nvel 4 de biossegurana e nos quais uma vacina de alta efetividade existente podem ser feitos com conteno parcial e sem a roupa de ventilao de presso positiva se as instalaes so descontaminadas regularmente, se no h outro experimento em andamento que exija o

Animais de laboratrio | 179

nvel 4 de biossegurana, tanto de barreiras primrias como das secundrias, e se todos os procedimentos padres e especiais so efetivamente postos em prtica.
Instalaes (barreiras secundrias)

Todas as recomendaes do nvel de biossegurana 3, acrescidas de: A O biotrio localizado em um prdio separado ou em zona claramente demarcada e isolada. B Paredes, pisos e tetos das instalaes so construdos de modo a no terem superfcies que acumulem sujidades e facilitem a limpeza dessas superfcies. O acabamento dessas superfcies deve resistente a lquidos e substncias qumicas, de modo a permitir a limpeza e descontaminao. C Acessrios internos, como luminrias, dutos de ar e tubulaes, so instalados de forma a minimizar superfcies horizontais que acumulem poeira. D Se h uma central de vcuo, essa no pode servir outras reas fora dessa instalao. O sistema de vcuo possui filtro Hepa instalado o mais prximo de cada ponto de uso ou vlvula de servio. Filtros so instalados de forma a permitir, no local, sua descontaminao e substituio. E Outros sistemas de lquidos ou gases so protegidos para evitar o refluxo. F Portas externas do biotrio so de fechamento automtico e estanque. G Todas as janelas so prova de impacto e seladas. H Autoclave de dupla porta disponibilizada para descontaminao de materiais que saem do biotrio. A porta da

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autoclave que se abre para o exterior das reas de animais controlada por sistema automtico, de forma que somente se abra aps o ciclo de esterilizao ter sido realizado. I Efluentes oriundos de pias, CSB e autoclave so descontaminados por calor antes de descarregados no sistema sanitrio. J O sistema de ar condicionado exclusivo e sem circulao de ar. O insuflamento e a exausto so balanceados para assegurar o direcionamento do fluxo de ar da rea de maior risco. O diferencial de presso entre reas adjacentes monitorado e deve possuir alarme que indique falha de funcionamento do sistema. K rea para troca de roupa deve ser providenciada para que as pessoas que entrem nessa rea usem uma roupa de presso positiva, ventilada e que possua suporte de respirao artificial. L A entrada nessa rea feita por antecmara com diferencial de presso, com portas com fechamento estanque. M Um chuveiro qumico instalado para descontaminao da superfcie da roupa antes da sada da rea. N A exausto de ar oriunda dessas reas filtrada por dois jogos de filtros Hepa instalados em srie. Duplicao das unidades de filtrao e exausto providenciada.
3.5. Modelo animal

A pesquisa cientfica necessria para que o ciclo do conhecimento se complete e se renove. Tem o objetivo de proteger o homem e os animais de danos causados por substncias e produtos indesejveis ou efeitos colaterais de medicamentos e, ainda, entender e pesquisar a cura de doenas. Diversas espcies de animais so utilizadas na pesquisa biolgica e mdica, entre estas,

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sapos, rs, peixes, aves, roedores, coelhos, ces, gatos, primatas no-humanos e animais de fazenda. A utilizao de animais com objetivos cientficos uma prtica comum, sendo absolutamente necessrio o estabelecimento de uma cultura de cuidados, conscincia e responsabilidades dirigida melhoria da descoberta cientfica e ao bem-estar. Esses conhecimentos so de fundamental importncia tanto para o estabelecimento de colnias de animais de laboratrio como para a sua utilizao na experimentao (Tabela 2). Modelo animal Animal utilizado em pesquisa biomdica. O conhecimento da Biologia (anatomia, fisiologia, gentica e aspectos etolgicos) e do manejo da espcie animal possibilita a padronizao e a harmonizao dos ensaios, aumentando a confiabilidade dos resultados, garantindo, simultaneamente, o bem-estar dos animais e a alta qualidade dos dados. Tabela 2 Classificao taxonmica de algumas espcies de animais de laboratrio
Ordem Camundongo Rato Hamster Cobaia Coelho Macaco Rhesus Macaco Cynomolgus Macaco Esquilo Macaco da noite Aotidae Famlia Gnero Espcie M. musculus R. novergicus M. auratus C. porcellus O. cuniculis Macaca mulatta

Mus Rodentia
Cricetidae Cavidae

Rattus Mesocricetus
Cavia

Lagomorfa Primate

Leporidae

Oryctolagus
Macaca Macaca Saimiri

Macaca fascicularis Saimiri sciureus Aotus trivirgatus

Aotus

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Manejo e caractersticas gerais dos animais de laboratrio

Uma criao de animais de laboratrio deve ser iniciada com animais comprovadamente puros, de pedigree e criteriosamente selecionados pelos valores genticos e sanitrios. Os mtodos de acasalamento empregados devem ser de acordo com o comportamento social dos animais e as condutas relacionadas com a reproduo e o cuidado com os filhos. Para se instituir o manejo adequado, importante considerar tambm as instalaes, o conforto fsico e proporcionar um estado adequado de nutrio aos animais. Este conjunto proporciona a preveno de fatores predisponentes s doenas e possibilita a adoo de mtodos de controle. As instalaes devem ser planejadas de maneira a permitir a realizao de procedimentos de higienizao, desinfeco e outros que sejam necessrios, bem como respeitar os aspectos etolgicos. A construo deve permitir o controle da iluminao e ventilao e a manuteno de temperatura adequada, ser de material resistente e de fcil higienizao. Etolgico Estudo do comportamento animal em seu habitat. Constitui conjunto de comportamentos resultantes da evoluo da espcie. As gaiolas devem ser slidas e seguras, apropriadas para a espcie alojada, livres de superfcies perfurantes ou cortantes, fceis de serem lavadas, construdas de modo a prevenir fugas ou a entrada de animais estranhos. Outro aspecto importante do manejo o conforto fsico para os animais, assim como para os profissionais de criao ou experimentao. Os animais alojados devem ser mantidos em ambiente seco, limpo, livre de rudo excessivo, com trocas de ar fresco e filtrado, com intensidade luminosa e ciclos de claro e escurido controlados, dentro da faixa de temperatura e umidade relativa adequada a cada espcie. No caso dos roedores, as trocas de cama (material absorvente) podem variar de uma a trs vezes por semana, depen-

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dendo da necessidade, o que evita o acmulo excessivo da amnia em decorrncia da decomposio bacteriana de fezes e urina. Este gs pode provocar irritao do trato respiratrio daqueles animais e mesmo dos trabalhadores. Os animais de laboratrio possuem caractersticas particulares e prprias de cada espcie. Por esse motivo, no devem ser alojadas espcies diferentes em uma mesma sala de criao ou experimentao. Da mesma forma, os profissionais, sempre que possvel, devero trabalhar exclusivamente em uma nica rea predeterminada. Proceder rotineiramente inspeo dos animais e de seus alojamentos, detectando precocemente alteraes que necessitem interveno, favorece o bem-estar e o estado sanitrio. As barreiras sanitrias e o acasalamento controlado tm sido as medidas utilizadas pelos bioteristas para obter as linhagens da espcie animal com padro sanitrio e gentico recomendado para pesquisa. O padro sanitrio dos animais se classifica em trs grupos distintos: animais gnotobiticos, que possuem microbiota associada definida e devem ser criados em ambiente com barreiras sanitrias absolutas; animais livres de germes patognicos especficos ( specific pathogen free SPF), que no apresentam microbiota capaz de determinar doena, ou seja, albergam somente microrganismos no patognicos; e animais denominados de convencionais, que possuem microbiota indefinida por serem mantidos em ambiente desprovido de barreiras sanitrias rigorosas. Quanto ao padro gentico, so classificados em dois grandes grupos: no-consanguneos e consanguneos. Os animais no-consanguneos, heterozigotos ou outbred so aqueles que apresentam constituio gentica variada, em estado de heterozigose, o que deve ser conhecido e mantido. Para o acasalamento monogmico de roedores e poucas espcies de primatas, mantm-se um macho para uma fmea, na gaiola, em carter permanente. Tem a vantagem da fcil identificao dos filhotes e a manuteno de registro fidedigno, elevada porcentagem de cios frteis ps-partos, de filhotes desmamados (no caso dos roedores), maior controle das enfermidades, boa

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seleo dos reprodutores e, no caso de roedores, amplamente utilizado em colnias de fundao de animais consanguneos onde se empregam acasalamento entre irmos. As desvantagens so o aumento de mo-de-obra e a necessidade de grande nmero de machos reprodutores, de espaos maiores e de mais pessoal. O acasalamento poligmico um mtodo que compreende um macho para um grupo de duas ou mais fmeas. Esse mtodo mais utilizado em colnias de animais de produo de roedores e na grande maioria das espcies primatas com esta caracterstica reprodutiva. A vantagem consiste em ter o maior nmero de animais produzidos em menos espao. Tem como desvantagem a dificuldade para registro dos animais e a identificao da fmea e do macho no frtil.
Caractersticas gerais dos roedores e coelhos Camundongo Foi introduzido como animal de laboratrio pelo fato

de ser pequeno, muito prolfero, ter curto perodo de gestao, fcil domesticao e manuteno. Por todas essas caractersticas, tornou-se o mamfero mais utilizado na experimentao biolgica. Quando as fmeas se agrupam em grande quantidade em ausncia de macho, se produz o perodo de anestro,14 entrando novamente em atividade trs a quatro dias depois de introduzir o macho. O bioterista se utiliza deste conhecimento para obter vrias gestaes no mesmo perodo. Outro fenmeno de interesse na reproduo deste roedor consiste na absoro do embrio, que ocorre com maior frequncia nas fmeas consanguneas, e est relacionado com a presena de feromnio.15 O camundongo adulto deve ser manipulado individualmente pela base da cauda, com polegar e indicador ou pina anatmica, mas o peso
Fase de repouso do ciclo estral (cio). So substncias qumicas captadas por animais de uma mesma espcie (intraespecfica), que permitem o reconhecimento mtuo e sexual dos indivduos.
14 15

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do animal deve ser apoiado na mo do profissional ou outra superfcie, to rpido quanto possvel. Para conteno de camundongos, coloca-se o animal sobre uma superfcie, segurando sua pele da regio entre as orelhas na parte dorsal da cabea, com os dedos polegar e indicador. O emprego de acasalamento rotacional (mtodo Poiley) em roedores e lagomorfos visa a manter estes animais heterozigotos, evitando-se o acasalamento de parentes prximos e assegurando que a gerao seguinte descenda de um maior nmero de pais, ao contrrio do que ocorreria se fossem acasalados ao acaso. Ao empregar esse sistema, a colnia se desenvolve em vrios grupos de igual nmero, de modo que a quantidade de fmeas e machos em todos os grupos sempre igual. O nmero de grupos de uma colnia est diretamente relacionado ao seu tamanho (nmero de reprodutores). Quanto menor a colnia, maior o nmero de grupos. Animais consanguneos, homozigotos ou inbred so obtidos pelo acasalamento entre irmos e/ou pais e filhos durante vinte ou mais geraes consecutivas. Utilizando esse tipo de acasalamento em colnias de roedores, consegue-se obter um ndice de homozigose de 99%, o que torna os animais o mais possvel idnticos. O aparecimento desses animais ocorreu no comeo do sculo XX, com os estudos do geneticista americano Clarence C. Little sobre herana na cor da pelagem de camundongos. Aps o surgimento da linhagem de camundongo denominada DBA, pesquisas em cncer geraram outras linhagens. Com o surgimento das inmeras linhagens, alguns pesquisadores reconheceram o potencial dos hbridos F1 (produto do acasalamento entre duas linhagens consanguneas), j que esses animais so geneticamente homogneos e heterozigotos para aqueles pares de genes em que as linhagens parentais diferem entre si. Nas linhagens consanguneas, para que a homozigose seja mantida nas geraes seguintes, os reprodutores devem ser acasalados indefinidamente, entre irmos ou pais e filhos, e essa a razo para que as colnias das

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linhagens consanguneas tenham maior chance de fixao de mutaes. Os animais mutantes resultantes desses acasalamentos foram selecionados e reacasalados com representantes da linhagem parental ou de outras linhagens, constituindo, assim, as linhagens congnitas. Os animais transgnicos so aqueles em que o genoma foi modificado pela introduo de sequncias de DNA de outro organismo. Nos animais knockout, a modificao gentica introduzida capaz de interromper ou anular um gene, que deixa de ser expresso. No anexo 1 so demonstradas a conteno de camundongo (Figs 1, 2 e 3) e a tcnica de eutansia por deslocamento cervical (Fig 4).
Rato Criado atualmente na maioria dos biotrios, semelhante aos

outros animais monogstricos, exceto pelo fato de no possuir vesicular biliar e de seu pncreas ser difuso. Ratos so dceis e fceis de manusear: uma compresso firme e suave ao redor da cavidade torcica restringe os seus movimentos sem trazer sensao de desconforto. A conteno tambm pode ser feita colocando o polegar e o indicador ao redor da nuca e, com a palma da mo sobre o dorso, use os dedos para ajudar a manter a posio quando o animal se movimenta. To logo a rata coberta, forma-se um tampo na vagina, que expelido nas 24 horas ps-cobertura. Este fato observado tambm em outros membros da famlia dos roedores. O tampo pode ser notado facilmente entre as fezes, na forma de um cilindro branco seroso e sua observao indica que houve cobertura do macho.
Hamster Em condies naturais, o hamster srio uma espcie

sazonal que entra em hibernao durante os perodos de dias curtos com baixa luminosidade, baixas temperaturas (inferiores a 5C) e escassa disponibilidade de recursos alimentares e de material para construo de ninho. No biotrio, o controle ambiental com temperatura constante da ordem de 21 a 22C e 12

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horas de claridade por dia evita a manifestao de sazonalidade, inclusive na esfera reprodutiva. Foi amplamente demonstrado o efeito das condies de alojamento sobre o crescimento, o peso e a composio corporal de hamsters. O alojamento em grupo acelera o crescimento e a deposio de gordura, induzindo obesidade, especialmente nas fmeas, porm sem ocorrncia de hiperfagia.16
Cobaia So animais sociais, tmidos, dceis e raramente mordem ou

arranham. Assustam-se facilmente, defecam e urinam nos comedouros e derramam sua alimentao pelo piso da gaiola. Gritam de prazer antes de situaes gratificantes (alimentao) e ficam muito juntos ou em cima uns dos outros durante o manejo da colnia pelo tcnico. Os animais adultos, frequentemente, mordem as orelhas dos jovens e os machos podem brigar violentamente, principalmente durante disputas por uma fmea em estro, at que se estabelea a hierarquia do grupo. Outra caracterstica marcante das cobaias a sua extrema suscetibilidade a estmulos estressantes, principalmente a alteraes ambientais. Simples modificaes na rao, no comedouro, na gua e no bebedouro podem levar os animais a recusar o alimento. Alm disso, estmulos como barulho intenso ou movimentos bruscos os assustam, fazendo com que passem a correr de um lado para o outro, provocando ferimentos. Ocasionalmente, durante a conteno para a troca de gaiolas, podemos observar a paralisao do animal por vrios minutos e at mesmo a morte. Isso implica dizer que o trabalho com esta espcie deve ser realizado com muito cuidado, principalmente no que se refere s fmeas grvidas ou com filhotes recm-nascidos, que podem ser pisoteados pelos outros animais do grupo. O mtodo mais seguro para conter uma cobaia colocar uma mo sob o trax e, com a outra, apoiar a parte posterior, para suportar o peso do animal, permitindo que ele fique sentado sobre a palma da mo. Deve-se evitar comprimir o trax pela sua fragilidade.
16

Alimentao em excesso.

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Figura 2 Ordem de alguns animais de laboratrio camundongos ratos

hamsters

cobaia

Rodentia (Roedores)

Coelhos

Lagomorpha (Lagomorfos)

Coelho De uma maneira geral, dcil, podendo morder ou arranhar

em razo da conteno incorreta. Suscetvel ao estresse, assusta-se facilmente. No se deve manter machos adultos em uma mesma gaiola para evitar brigas (disputa de territrio). As fmeas tambm no devem ser mantidas na mesma gaiola porque podem apresentar pseudogestao.17 Para o acasalamento, a coelha deve ser levada gaiola do macho para facilitar a cobertura, pois, caso contrrio, o macho fora do seu territrio passar a examinar o novo local, deixando de fazer a mesma. Uma vez introduzida a fmea na gaiola do macho, dever ocorrer a cobertura aps alguns minutos. conveniente que o tcnico assista e constate a cobertura, observando o comportamento do macho (que se deixa cair de costas emitindo rudos guturais) e/ou, por meio de um simples exame da vagina, observa-se a presena de lquido seminal. Aps a cobertura, a fmea deve retornar a sua gaiola de origem. Esses animais so mais sensveis ao calor do que ao frio. A temperatura recomendvel varia de 17C a 21C e a umidade relativa, de 40% a 60%. A forma mais segura de conter um coelho pegando-se com uma das mos a pele do pescoo e com outra as patas traseiras, segurando-o junto ao corpo. Para grandes trajetos, coloca-se o animal sobre o antebrao com a cabea dirigida para o corpo, segurando firmemente as patas traseiras. Nunca se deve levantar um coelho pelas patas ou pelas orelhas, pois h a propenso a leses de coluna vertebral e fraturas.
17

Gestao psicolgica.

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Tabela 3 Parmetros importantes de algumas espcies


Camundongo
Peso macho adulto Peso fmea adulta Peso ao nascer Maturidade sexual do macho Maturidade sexual da fmea Ciclo estral Gestao Desmame Tamanho da ninhada Cobertura ps-parto Vida reprodutiva do macho Vida reprodutiva da fmea Consumo dirio de rao Consumo de gua 25-30 g 25-30 g 1-1,5 g 40-50 dias 40-50 dias 4-5 dias 19-21 dias 19-21 dias 1-22 imediata 1 ano 1 ano 4-5 g

Rato
300-400 g 250-300 g 5-6 g 60-80 dias 60-80 dias 4-5 dias 21-22 dias 21-22 dias 8-10 imediata 1 ano 1 ano 15-20 g

Hamster
95-120 g 95-120 g 5g 60-70 dias 60-70 dias 4-5 dias 16-19 dias 21 dias 4-12 4 dias 1 ano 1 ano 7-9 g

Cobaia
400-500 g 300-400 g 70-100 g 70-80 dias 70-80 dias 16 dias 59-72 dias 15-21 dias 1-6 imediata 2-3 anos 2-3 anos 35 g

Coelho
4-5 kg 4-5 kg 70-80 g 5-6 meses 5-6 meses irregular 30-31 dias 42 dias 6-8 14-28 dias 2-3 anos 2-3anos 100-150 g

Ad libitum

Ad libitum

Ad libitum

Ad libitum

Ad libitum

Primatas no-humanos

A distribuio geogrfica silvestre de origem deste modelo est atualmente restrita aos continentes centro sul-americano, africano e asitico. O Brasil o pas com a maior diversidade desta ordem zoolgica, a mesma que o homem. Muitas espcies de primatas18 so utilizadas h muitos anos como modelos para as pesquisa biomdica e farmacutica e, por esta razo, vrias instituies desenvolvem colnias para sua criao. So reagentes biolgicos de importncia vital para testes e experimentos que requeiram respostas precisas, anlogas e confiveis, quando nenhum outro animal pode substitu-lo por sua preciso em resultados compatveis s respostas humanas.
Primatas no-humanos (Filo Chordata subfilo Vertebrata, superclasse Tetrapoda, classe Eutheria, ordem Primate). Macacos, smios: nome comum a todos os mamferos da ordem dos primatas, com exceo do homem.
18

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A espcie de primata dever ser escolhida criteriosamente conforme a proposta de sua utilizao, como, por exemplo, modelos reconhecidamente compatveis para enfermidades tropicais, que so macacos originrios do neotrpico do Brasil e de outros pases da Amrica do Sul e Amrica Central (neotropicais) como o macaco-de-cheiro (Saimiri sp.), mico comum (Callithrix sp.), sagui (Saguinus sp.) e macaco-prego (Cebus sp.). Os primatas asiticos (Velho Mundo19) so utilizados em vrias investigaes, entretanto, so animais com alto custo para sua manuteno e com maior dificuldade de obteno, destacando-se, entre eles, os do gnero Macaca.20 Os primatas no-humanos pertencem ordem mais elevada dos mamferos. A maioria gregria em seu ambiente natural, vivendo em grupos sociais sob a proteo de um macho alfa. um animal bulioso, inquieto, observador e repetidor de atitudes humanas. Por este motivo, os profissionais que trabalham em biotrios devero ter atitudes conscientes no trato dirio, para que no transmitam ensinamentos prejudiciais ao comportamento habitual da espcie. Ressalta-se como caracterstica e diferenciao entre espcies e sua hierarquia na classificao taxonmica a existncia ou no de cauda (mais prximas ao homem). Em algumas delas, utilizada como um quinto membro (quando preensil), um recurso em seus deslocamentos e para sua proteo contra predadores naturais.
Primatas do Velho Mundo (infraordem Catarrhini) so os macacos originrios do continente africano e asitico. Possuem a membrana internasal (septo nasal) estreita. Os primatas neotropicais (infraordem Platyrrhines), ao contrrio, possuem narinas bem separadas. Estes ltimos so de porte menor, sendo exclusivamente arborcolas (poucos descem ao solo em busca de gua ou alimento), distinguindo-se tambm das espcies do Velho Mundo pela dentio de 32 ou 36 dentes, por polegar no completamente oponvel e pelas ausncias de calos citicos e de bolsas jugais. 20 Algumas espcies deste gnero so modelos biolgicos para vrias pesquisas, entre elas os macacos Rhesus (Macaca mulatta) e Cynomolgus (Macaca fascicularis).
19

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No planejamento de instalaes para a criao ou experimentao, alm das medidas de biossegurana e bem-estar, deve-se levar em conta suas caractersticas fsicas e comportamentais (sociais, reprodutivas, entre outras). Cada espcie tem caractersticas prprias (algumas possuem hbitos diurnos e outra espcie noturna), grandes diferenciaes e comportamento peculiares. A complexidade de seus alojamentos visando ao seu bem-estar deve levar em conta sua biologia e a boa utilizao do espao pelo animal. Conforme demonstrado na Tabela 4, alguns vivem em grandes grupos familiares hierarquicamente constitudos sistema poligmico (um macho dominante ou alfa acasala com vrias fmeas). Outros vivem em famlias menores sistema monogmico (um casal e seus filhotes). Umas espcies alimentam-se preferencialmente de vegetais, outras so onvaras21 (deve-se observar, tambm, que as necessidades nutricionais variam conforme a poca do ano e a idade reprodutiva). Grande parte das criaes de primatas realizada em ambientes com grandes espaos para os animais gaiolas coletivas, pois se pressupem que maiores reas so favorveis a seu bem-estar, e melhor tolerncia destes com o trabalhador. Estas gaiolas so propcias para a convivncia de famlias com indivduos hierarquicamente organizados por eles mesmos, em sistema de poligamia, onde o macho adulto dominante22 convive com seu grupo de fmeas adultas e em idade reprodutiva e seus filhotes (que devem permanecer com seus pais at atingirem a puberdade).23 Vale ressaltar que estes ambientes devem possuir locais contguos especficos para permitir o descanso e a privacidade dos indivduos dos grupos e que se destina tambm como rea de conteno e captura de todos ou de indivduos isoladamente. A higienizao das gaiolas coletivas realizada com mquina de lavagem sob presso de forma a recolher os resduos lquidos e slidos do local, o que
So os que se alimentam tanto de produtos de origem animal como vegetal. Macho dominante ou alfa: nico lder e reprodutor do grupo social e de sua gaiola ou recinto. 23 Sempre que possvel, os filhotes devem permanecer com seus pais durante os primeiros anos de vida e que sejam naturalmente desmamados por sua me, para favorecer a aprendizagem social e reprodutiva. Este perodo muito importante, pois comprovou-se que os animais que passaram por esse aprendizado demonstram maior sucesso na criao futura de seus prprios filhotes.
21 22

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se constitui em risco sade dos trabalhadores pelo carreamento destes aerossis. Eles devero, portanto, estar corretamente paramentados com os equipamentos de segurana individual. As mesmas especificidades dos outros modelos anteriormente descritos, como controle de umidade, ventilao, luminosidade, tratamento de efluentes e barreiras que impeam a circulao de animais invasores e deletrios, devem ser atendidas. Destaca-se tambm que a criao deste modelo requer muitas vezes reas grandes e abertas em ambiente seminatural (locais com vegetao circundante, com o intuito de propiciar bem-estar visual e trmico), onde so construdos seus recintos, de forma a propiciar segurana ao meio externo e comunidade circundante e tambm adotar medidas para impedir que animais sinantrpicos24 circulem nestes ambientes. Como nos outros modelos, o manejo25 de primatas em criao e experimentao e o monitoramento de sua sade so de importncia primordial para evitar a possibilidade de enfermidades previsveis, bem como sua reproduo seja controlada de forma a no permitir acasalamentos consanguneos estreitos entre o grupo ou as famlias da colnia. De acordo com a biologia da espcie de primatas, as gaiolas podem ser coletivas ou individuais,26 com espao adequado, equipamentos e materiais necessrios a sua criao ou manuteno em biotrios. Seja qual for a forma e a necessidade do cativeiro, estabelece-se um programa de interao positiva
So aqueles que se adaptaram a viver junto ao homem e, em alguns casos, podem transmitir agravos a sua sade e de outros animais, como, por exemplo, roedores domsticos, aves, etc. 25 Manejar significa, em sua forma literal, conduzir com as mos. Na rea animal, um conjunto de tcnicas corretas, desenvolvidas com o intuito de reproduzir, criar, manter animais de forma segura e propiciar bem-estar fisiolgico, comportamental e produtivo a estes. 26 Nas gaiolas coletivas, algumas vezes o trabalhador, ao capturar um individuo especfico neste tipo de recintos de criao, necessita utilizar pus redes de malha em forma de coador para primatas de pequeno e mdio porte. Recomenda-se que este material seja confeccionado com malhas e bocal adequados para cada espcie, idade e/ou peso, para a segurana do animal e do trabalhador. Em gaiolas individuais, a atividade de captura realizada com maior facilidade, pois estas possuem uma de suas paredes com mobilidade que, quando acionada, conter o animal contra a parede fixa. A partir deste momento, com o animal fisicamente contido, realiza-se a administrao de imobilizante qumico para sua retirada deste local com maior segurana.
24

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fornecendo brinquedos, ninhos, poleiros e alimentos diversificados, enriquecendo estes ambientes e proporcionando o bem-estar de seus integrantes. 27 Em face da biossegurana, como j foi destacado, todos estes locais devero atender a requisitos bem definidos, pois so locais de possveis riscos biolgicos diretos ao trabalhador, o que imperioso para esta espcie animal, devido exatamente a sua semelhana com o homem, transformando-a em um maior risco de transmisso de zoonoses, algumas vezes fatais. A conteno de primatas em cativeiro configura-se como o momento mais delicado do manejo, estressante para os animais e de grande risco para o trabalhador, devendo ser executada pelos membros da equipe com maior experincia. Tabela 4 Caractersticas sociais e reprodutivas de alguns primatas no-humanos
Espcie animal Caracterstica reprodutiva Gestao Alimentao Vida livre 146 a 180 dias 155 a 165 dias 150 a 172 dias Onvoros Em cativeiro
Rao industrializada e suplementao de hortifrutigranjeiro Rao industrializada e suplementao de hortifrutigranjeiro Rao industrializada e suplementao de hortifrutigranjeiro Fornecimento de larvas Tenebrio molitor* Hortifrutigranjeiro Fornecimento de larvas Tenebrio molitor Rao industrializada e suplementao de Hortifrutigranjeiro Fornecimento de larvas Tenebrio molitor

Filhotes por Hbitos gestao 1 Diurno

Rhesus (Macaca mulatta) Cynomolgus (Macaca fascicularis)


Macaco esquilo (Saimiri sp)

Poligmico

Poligmico

Onvoros

Diurno

Poligmico

Onvoros

Diurno

Mico comum (Calithrix sp)

Monogmico

130 a 145 dias 120 a 130 dias

Onvoros Onvoros

1-3 1

Diurno Noturno

Macaco da noite Monogmico (Aotus sp)

*Em alguns biotrios de primatas, so criadas para suplementao nutricional larvas de Tenebrio molitor.

Tcnicas de enriquecimento ambiental: permitem a interao social e/ou o interesse individual proporcionando quebra na rotina do cativeiro, mantendo-os em permanentes atividades fsicas e ldicas com aqueles ambientes.
27

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Macroambiente28 e microambiente

O alojamento e a manuteno das condies ambientais apropriadas so essenciais para o bem-estar animal. Um ambiente adequado propicia que os animais cresam, reproduzam-se, mantenham um bom estado de sade, tenham conforto e bem-estar, no podendo ser, portanto, um fator que afete o resultado das pesquisas. Essas condies refletem nos resultados e na qualidade final das pesquisas.
Microambiente

O microambiente para o animal o ambiente fsico com o qual mantm contato direto, por exemplo, a gaiola. Proporciona as condies e o espao suficiente para as necessidades comportamentais, fisiolgicas, manuteno da temperatura corporal, movimentao e postura normal da espcie animal, alm de permitir acesso facilitado gua e alimentao slida. Construdo de forma que no machuque os animais e, em caso de biotrios de criao, deve tambm ser adequado s necessidades reprodutivas. As gaiolas so construdas com materiais no txicos, que atendam as necessidades dos animais, mas que tambm propiciem uma fcil higienizao, desinfeco e/ou esterilizao. Devem ser impermeveis com superfcies sem ngulos fechados, sem cantos vivos ou bordas que possam acumular sujidades e dejetos.
Dimenses de gaiolas e espao recomendados

A necessidade de espao para um animal complexa e no se pode considerar somente o seu peso corporal versus a superfcie de rea. As dimenses da gaiola devem levar em considerao as necessidades individuais, situaes particulares e condies fisiolgicas dos animais. Desde que a performance animal associada sade, reproduo, ao crescimento, ao bem-estar e
28

constitudo pelas condies do ambiente onde esto as gaiolas dos animais.

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atividade normal esteja atendida no espao disponvel, pode-se considerar um alojamento adequado (Tabela 5) Tabela 5 Dimenses mnimas e altura das gaiolas segundo a espcie animal e o peso corporal
ANIMAL Camundongo PESO (g) < 10 At 15 At 25 > 25* Rato < 100 At 200 At 300 At 400 At 500 > 500* REA DE PISO (cm2) 38,7 51,6 77,4 ALTURA (cm) 12,7 12,7 12,7 12,7 17,8 17,8 17,8 17,8 17,8 17,8 15,2 15,2 15,2 15,2 17,8 17,8 35,6 35,6 35,6 50,8 76,2 76,2 81,28 91,44

96,8
109,7 148,4 187,1 258 387

451,5
64,5 83,9 103,2

Hamster

< 60 At 80 At 100 > 100*

122,6
387

Cobaia Coelho

350 > 350 < 2.000 At 4.000 At 5.400

651,5
1,35 2,7

3,6
150 280 400 560 740

Primatas no-humanos < 1.000 1.000-3.000 3.000-10.000 10.000-15.000 15.000-25.000


* Animais maiores requerem mais espao Fontes: NRC (2003); Kelly e Hall (1995).

196 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Alimentao

As raes peletizadas so as mais utilizadas para alimentao de animais de laboratrio, que devem ser palatveis, balanceadas nutricionalmente e sem contaminantes qumicos e microbiolgicos. Algumas delas so autoclavveis e, por esta razo, tm seus nveis de nutrientes aumentados, pois durante o processo de esterilizao pelo calor h perdas de vitaminas, protenas e outros elementos nutricionais. Outro mtodo de esterilizao de raes para uso em biotrios a irradiao, que no provoca perdas nutricionais como na autoclavao. Animais gnotobiticos e SPF, por possurem uma microbiota diferenciada ou ausente, podem ter dificuldades na sntese de vitaminas. As vitaminas do complexo B e a vitamina K so suplementadas dieta para garantir os nveis mnimos necessrios nutrio do animal. Primatas no-humanos e cobaias no sintetizam a vitamina C, que precisa ser disponibilizada de forma artificial em sua dieta diria. Animais que no tenham acesso luz solar natural precisam receber tambm um suplemento de vitamina D3. gua potvel deve estar sempre disponvel e sua anlise quanto qualidade microbiolgica e aos contaminantes qumicos precisa ser efetuada periodicamente. O mtodo de seu tratamento definido em funo do experimento, pois a acidificao ou clorao podem causar alteraes fisiolgicas ou da microbiota do animal, interferindo em seu bem-estar e nas condies de sade. A filtrao e a esterilizao por autoclave so os mtodos mais empregados em biotrios e os frascos bebedouros devem ser substitudos, pelo menos, uma vez por semana, para minimizar a proliferao de microrganismos.
Forrao das gaiolas

A forrao das gaiolas tem por objetivo manter os animais secos e limpos e proporcionar um ambiente confortvel. O material mais comumente utilizado para a forrao das gaiolas a maravalha de madeira. A madeira utilizada para a produo de maravalha

Animais de laboratrio | 197

deve ser seca, isenta de contaminantes qumicos, e sua produo e seu armazenamento devem ser feitos de forma a minimizar o acesso de roedores, insetos e outros animais que possam contamin-la. As madeiras verdes possuem fortes aromas que podem afetar os animais e at intoxic-los. A esterilizao por autoclave reduz a concentrao desses aromas e previne esse problema, principalmente se a madeira j os possui em nveis baixos.
Temperatura

Embora a maioria dos animais de laboratrio tolere a mesma faixa de temperatura do homem, a temperatura de salas de manuteno em biotrios deve ser mantida para atender as condies ideais da espcie. Amplas variaes de temperatura so mais prejudiciais que uma temperatura constante prxima a um dos extremos da faixa de tolerncia. Os animais de laboratrio, em sua maioria homeotrmicos,29 tentam manter a temperatura corporal constante. A mudana na temperatura ambiental resultar em alteraes compensatrias que afetaro o padro metablico, a circulao, a atividade e o comportamento. Deve ser lembrado que a temperatura no interior das gaiolas, normalmente, superior em alguns graus do ambiente externo e varia em funo das dimenses da gaiola e do nmero de animais alojados.
Ventilao

Os animais esto constantemente perdendo calor, umidade, dixido de carbono, entre outros produtos metablicos, que iro se acumular no ambiente caso a sala no possua ventilao adequada. As trocas de ar tm por propsito suprir o ambiente de oxignio, remover o calor produzido pelos animais, lmpadas e equipamentos e diluir gases e partculas em suspenso. O ambiente, para a maioria dos animais, requer de 15 a vinte trocas de ar (volume do
Animais homeotrmicos ou de sangue quente. a caracterstica de alguns animais que lhes permite manter sua temperatura corporal relativamente constante causa de uma alta taxa metablica gerada pela intensa queima de energia nas clulas.
29

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ambiente por hora), visando a eliminar odores e gases e auxiliando a manter a temperatura e umidade. Se a troca de ar insuficiente, a densidade animal na sala deve ser reduzida e as gaiolas limpas com maior frequncia. Porm, essa deve ser uma soluo provisria.
Umidade relativa (UR)

A maioria dos animais de laboratrio compensa o excesso de calor atravs do aumento do ritmo respiratrio. Contudo, se o ar inspirado possui alto ndice de umidade, afetar a capacidade de o animal ajustar sua temperatura corporal. A umidade relativa de 55+/-5% recomendada para a grande maioria dos animais e a tolerncia est na faixa de 30 a 70% UR. A umidade relativa no interior das gaiolas em torno de 10% maior que no ambiente. Flutuaes e extremos na UR podem propiciar o aparecimento de doenas, principalmente respiratrias, bem como alteraes no consumo de rao e gua. A umidade relativa a maior responsvel pela rapidez de evaporao de gotculas e sua disperso, e estas gotculas em suspenso influenciam na sobrevivncia de microrganismos.
Luz

A regularidade do fotoperodo30 importante para a manuteno da normalidade comportamental dos animais (por exemplo, sincronizao do ciclo circadiano,31 ciclos reprodutivos, efetividade de drogas). Variaes no fotoperodo (claro/escuro), em funo da durao dos dias ou das estaes
Fotoperodo representa o comprimento de um dia e consiste na durao do perodo de luz de um determinado ambiente. 31 Ciclo circadiano ou ritmo circadiano. Designa o perodo de aproximadamente 24 horas sobre o qual se baseia todo o ciclo biolgico dos animais e de qualquer outro ser vivo, que so influenciados pela luminosidade (fotoperodo ou luz solar).
30

Animais de laboratrio | 199

do ano, influenciam o comportamento reprodutivo, o tempo de durao do parto e os hbitos comportamentais. Animais mantidos em ambiente com iluminao artificial requerem controle automtico do fotoperodo. E recomendado 12 horas de luz e 12 horas de escurido ou 10 horas de luz e 14 horas de escurido. A luminosidade deve possuir caracterstica mais prxima possvel da luz natural, propiciar boa visibilidade e ser uniforme. Ressalta-se que vrias espcies de animais de laboratrio, como os camundongos, ratos, hamsters e o macaco da noite tm hbitos noturnos.
Rudo

As instalaes devem ser planejadas visando a evitar a propagao de sons naturais, pois podem causar distrbios por estresse. Sons de alta intensidade ou sbitos so mais prejudiciais que os habituais e rotineiros. De alta significncia so os rudos ultrassnicos, que os humanos no percebem, porm so escutados por vrias espcies animais (camundongos e morcegos).
Controle da qualidade animal

Um laboratrio de controle de qualidade animal tem como objetivo definir padres e garantir a qualidade de animais mantidos e criados em biotrios. A sade e o bem estar dos animais, assim como a classificao de seus padres, so obtidos atravs de um programa de monitoramento de rotina e prticas sanitrias rigorosas. O controle sanitrio e gentico s ser eficaz caso o biotrio utilize tcnicas de criao e manuteno, mantendo os animais livres de patgenos (vrus, bactrias, fungos e parasitas) e geneticamente estveis. 32 Os mtodos utilizados para certificar a qualidade sanitria de uma colnia podem incluir o monitoramento sanitrio de rotina e a checagem ocasional ou o levantamento microbiolgico.
32

Padro gentico que caracteriza a linhagem.

200 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Monitoramento sanitrio Realizao de testes de anlises laboratoriais: bacteriolgicas, parasitolgicas, virolgicas, micolgicas e anatomopatolgicas. Estas anlises devem ser realizadas pelo menos trimestralmente, tendo como principal objetivo evidenciar a presena de agentes patognicos em determinada colnia. Checagem ocasional Pode ser realizada apenas quando identificarmos algum achado clnico. So feitos testes especficos para determinado patgeno de acordo com as suspeitas clnicas. Levantamento microbiolgico Testes para a obteno de informaes referentes prevalncia da infeco entre os animais. Os resultados refletem o estado sanitrio da colnia em determinado perodo, ou seja, apenas no momento em que foram realizados. O monitoramento sanitrio animal deve ser elaborado atravs de um programa de diagnstico que tem como principais objetivos:
Monitorar as condies de sade dos animais que tenham sido inseri-

dos nas instalaes.


Monitorar possveis surtos epidmicos nas colnias. Determinar parmetros fisiolgicos e epidemiolgicos de espcies ani-

mais e linhagens especficas.


Diferenciar novas mutaes. Identificar possveis zoonoses.

Para a implantao deste programa de controle da qualidade, o primeiro passo selecionar os patgenos (tabela 7 e 8) que sero pesquisados, levando em considerao fatores como limitaes das instalaes, prevalncia das doenas, potencial patognico e confiabilidade dos mtodos de diagnsticos aplicados.

Animais de laboratrio | 201

O ideal a pesquisa de todos os agentes primrios, porm, algumas instituies realizam o monitoramento apenas de alguns agentes considerados relevantes de acordo com suas instalaes e outras pesquisam, alm dos agentes primrios, os agentes oportunistas. Considerveis prejuzos nas pesquisas podem ser causados por microrganismos oportunistas, sendo estes manifestados apenas em determinadas condies, como estresse animal, uso de linhagens suscetveis, coinfeces, entre outras. Agentes primrios So parasitas, bactrias, vrus ou fungos que tm um potencial significativo para causar doenas. Estes patgenos podem acarretar grandes interferncias em pesquisas. Exemplos de agentes primrios: vrus da hepatite de camundongos, vrus Sendai, coronavrus, vrus Kilham, vrus da coriomeningite linfoctica, Salmonella sp. e Citrobacter freundii. Agentes oportunistas So normalmente bactrias e fungos comuns em animais de laboratrio ou em seres humanos. Possuem baixa probabilidade de causar doenas clnicas, porm elevado potencial de latncia. Exemplos de agentes oportunistas incluem Klebsiella pneumoniae , Pasteurella pneumotropica , Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae. Outra etapa importante para a implantao do controle o clculo da amostragem que ser submetida avaliao no laboratrio. O tamanho desta amostragem poder ser calculada utilizando a seguinte frmula: n= log 0,05/log N
n = nmero de amostras, N = % de animais no infectados na prole e log 0,05 = 95% nvel de confiabilidade dos testes.

202 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Em mdia, as doenas de animais criados em biotrios possuem uma morbidade mnima em torno de 30 a 35%. O uso desta frmula impe uma srie de pressupostos:
A populao estudada deve possuir no mnimo cem animais em suas

colnias.
A escolha dos animais que sero submetidos ao monitoramento dever

ser aleatria, sem predileo por sexo ou outros fatores, para que no influencie o resultado final dentro do grupo.
A percentagem de animais infectados (morbidade) por determinado

microrganismo deve ser conhecida. A maioria das doenas virais em uma populao fechada trar morbidade de pelo menos 30 a 35%. Por exemplo, se determinado vrus tem 80% de prevalncia de infeco em colnias de camundongos, precisaremos de apenas trs animais para realizar o diagnstico da ocorrncia do vrus na colnia (Tabela 6). Tabela 6 Tamanho mnimo da amostra para deteco de uma infeco em determinada colnia com no mnimo cem animais
Incidncia da infeco populao (%) 90 80 70 60 50 40 30 20 10
* Limite de confiana de 99% (a=0,01).

Amostra (quantitativo)* 2 3 4 5 7 9 13 21 44

Animais de laboratrio | 203

Para minimizar erros diagnsticos, o ideal seria utilizar uma amostragem em torno de dez a doze animais de cada sala de criao de colnias, tanto de fundao como de criao, com intervalos trimestrais ou semestrais, dependendo da espcie animal ou do agente etiolgico. Existe a possibilidade de utilizao dos chamados animais sentinelas: animais imunocompetentes que devem ser introduzidos na colnia e mantidos para o monitoramento por no mnimo quatro semanas.
Controle virolgico

Um programa de boas prticas laboratoriais, integrado a um sistema de garantia de qualidade, deve complementar o uso de metodologias adequadas para o monitoramento virolgico de colnias. Estas metodologias podem ser classificadas em:
Metodologias diretas Quando se realiza a pesquisa a partir do

material clnico colhido de produtos antignicos ou de partculas virais propriamente ditas. Ex.: microscopia eletrnica, imunohistoqumica, imunoensaioenzimtico para pesquisa de antgenos virais e imunofluorescncia direta.
Metodologias indiretas So aquelas onde pesquisamos anticorpos

contra determinados vrus. Entre os mtodos de escolha esto os testes sorolgicos. Existem diversas metodologias para realizao desta pesquisa, dentre elas: testes imunoensaioenzimticos (Elisa enzima linked immunosorbent assay), testes de imunofluorescncia indireta (IFI indirect immunofluorescence), testes de inibio da hemaglutinao (IH), immunoblot33 (Western Blot) e, reao da cadeia da polimerase (PCR Polymerase Chain Reaction). Um resultado positivo automaticamente requer um curso de ao para confirmar a presena do agente atravs de testes confirmatrios, com o aumen33 O termo imuno refere-se natureza da reao de deteco (anticorpo-antgeno) e o termo blot, ao sistema utilizado para imobilizar o antgeno ( blot, do ingls: impresso, borro).

204 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

to da amostragem ou repetio dos testes. importante salientar que o agente etiolgico pode ter sido introduzido na colnia muito antes dos sinais clnicos ou da morte de algum animal. Diante deste fato, podemos concluir que a aplicabilidade da avaliao diagnstica contnua de extrema importncia. Tabela 7 Principais vrus que afetam animais de laboratrio
Agente etiolgico Vrus Sendai Famlia Paramyxoviridae Espcie afetada Sinais clnicos Transmisso A sua transmisso ocorre por aerossis34 e por contato direto. Perodo de incubao 7 a 14 dias Observaes Parainfluenza I

Hamster, camundongos e Acomete o trato respiratrio. ratos Disseminao rpida. Dispineia e estertores, perda de peso, reduo no tamanho da prole, gestaes prolongadas, alta mortalidade em recm-nascidos e em filhotes at o desmame.
Camundongos

Vrus da Hepatite de Camundongos (MHV) Famlia Coronaviridae gnero Coronavrus

Na maioria dos casos Via oral-fecal. assintomtica. Urina com colorao amarronzada, manchas na regio perianal, ictercia,35 espasmos, incoordenao e morte.

Possui grande capacidade de disseminao. Podem surgir sintomas dependendo da cepa viral e do estado do animal (linhagem, imunossupresso, estresse, idade etc.). Duas formas principais de doena, dependendo do tropismo da cepa viral. Padro respiratrio: geralmente assintomtico. Padro entrico: dissemina-se alm do intestino para outros rgos abdominais (fgado e ndulos linfticos abdominais). Diarreia e alta mortalidade em animais jovens. Algumas cepas podem disseminar para o crebro.

Aerossis: constitudos por partculas com tamanho menor ou igual a 5 m. A proteo respiratria para as doenas de transmisso area por aerossol obtida atravs da seleo e do uso dos EPI adequados. Estertores (estalos ou crepitaes) so pequenos sons de estalidos, borbulhantes ou do tipo chocalho, que se ouvem numa parte do pulmo. Eles ocorrem quando o ar se move atravs das vias respiratrias repletas de lquido. 35 Ictercia: colorao amarelada nas membranas mucosas e nos olhos, causada por excesso de bilirrubina no sangue.
34

Animais de laboratrio | 205

Agente etiolgico Vrus da Sialodacrioadenite (SDAV) Famlia Coronaviridae gnero Coronavrus

Espcie afetada Ratos

Sinais clnicos

Transmisso

Perodo de incubao -

Observaes Alta morbidade e baixa mortalidade.

O vrus afeta as Contato glndulas salivares e direto e lacrimais, linfonodos aerossis. cervicais, timo e mucosa do trato respiratrio. Os sinais clnicos, quando presentes, so: fotofobia, leses oculares, edemas no globo ocular, lacrimejamento alterado e, em alguns casos, edema na regio cervical. Em animais lactentes,36 pode ocorrer conjuntivite com fotofobia e exsudato ocular. Os sintomas mais graves so: edema cervical, espirros, descarga nasal, descarga ocular e lcera de crnea. Os sinais clnicos variam de acordo com a cepa viral, linhagem e idade dos animais. Quando a infeco adquirida ainda no tero ou poucos dias aps o nascimento, os animais sofrem um retardo no seu crescimento, desnutrio, irritabilidade, ascite e morte. Apesar da forma mais comum ser assintomtica, em hamster observamos glomerulonefrite progressiva e reduo de seu tamanho. Em humanos, a doena se manifesta com febre, mialgia, nuseas, vmito, fotofobia e tosse; ocasionalmente rash cutneo, linfoadenopatia, otite, delrio e amnsia.

Vrus da Coriomeningite Linfoctica (LCMV) Famlia Arenaviridae gnero arenavrus.

Camundongos, hamster, coelhos, cobaias, primatas nohumanos.

Possui importncia significativa por se tratar de uma zoonose.

Lactentes: Mamferos jovens, sem desmame. Refere-se aos animais sob proteo que so alimentados pela me biolgica, me adotiva ou por mamadeira.
36

206 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Agente etiolgico Vrus da Desidrogenase Lctica Famlia Togaviridae

Espcie afetada Camundongos

Sinais clnicos A atividade da enzima desidrogenase lctica (LDH) no plasma aumenta 24 horas aps o contato com o vrus, com picos de at dez vezes mais aps 7296 horas, permanecendo elevados por toda a vida do animal.

Transmisso Embora os camundongos eliminem o vrus pela urina, saliva, fezes e leite, os ttulos virais decaem aps a primeira semana da infeco, diminuindo consideravelmente o risco de transmisso.

Perodo de incubao -

Observaes O diagnstico pode ser realizado atravs da anlise bioqumica dos animais, podendo encontrar elevao em todas as enzimas plasmticas alm do aumento considervel da LDH. A infeco normalmente adquirida em 3 a 6 semanas de idade. O vrus tem sido demonstrado nas fezes por at 53 dias aps infeco, apresentando uma taxa de mortalidade baixa.

Vrus da Encefalomielite Murina (Vrus Theiler) Famlia Picornaviridae gnero Enterovrus.

Camundongos e ratos

Os sinais clnicos Fecal - oral. so inaparentes e presumidamente causados por cepas menos virulentas. Os camundongos afetados apresentam paralisia flcida dos membros. A leso tpica da doena a poliomelite no supurativa com necrose e neuronofagia. As cepas mais virulentas causam movimentos em crculos, vagarosos, hiperexcitabilidade, convulses, tremores, paralisia flcida nos membros e alta mortalidade.37 Aproximadamente A transmisso dez dias aps a ocorre atravs infeco, leses de fissuras na caractersticas se pele. desenvolvem na pele, levando a liberao viral para o ambiente. Estes tambm podem ser eliminados nas excrees da orofaringe, do trato genital e do intestino. As leses na doena aguda incluem necrose do bao, linfonodos, timo e fgado.

Ectromelia vrus Famlia Poxviridae Gnero Orthopoxvirus.

Camundongos

37

Supurativa: formao ou acmulo de secreo purulenta. Neuronofagia: neurnios sendo fagocitados por macrfagos do tecido nervoso. Paralisia flcida: perda do tnus muscular.

Animais de laboratrio | 207

Agente etiolgico

Espcie afetada Primatas no humanos.

Sinais clnicos Na sua grande maioria, os animais so assintomticos. Em alguns casos, podem causar leses nas mucosas, semelhantes a lceras aftosas presentes no dorso da lngua, lbios ou face, parecidas com as causadas pelo vrus herpes simplex.No homem, conjuntivite ligeira e descarga nasal. Tambm podem ser observadas doenas neurolgicas nos casos mais graves.

Transmisso Contato direto. Para o homem, ocorre atravs de mordidas, arranhes, aerossis ou manuseio inadequado de tecidos contaminados.

Perodo de incubao Normalmente, a doena em primatas dura, em mdia, de sete a 14 dias. O vrus permanece latente e pode reativar de forma espontnea ou quando os animais so submetidos a condies de estresse.

Observaes O vrus enzotico em Macaco Rhesus (Macaca mulatta), Macaco Cynomolgus (Macaca fascicularis), e outros primatas no humanos. O vrus pode ser isolado de saliva, sangue, urina, fezes e rim. Nos seres humanos, esta doena tem sido caracterizada por uma variedade de sintomas que geralmente ocorrem dentro de um ms de exposio. Os sintomas incluem: leses vesiculares localizadas na pele ou nas proximidades do local da inoculao, sintomas neurolgicos, paralisia ascendente e, em ltima instncia, encefalite. A morte normalmente ocorre de trs a 21 dias aps o aparecimento dos sinais clnicos.

Herpesvirus simiae

208 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Controle bacteriolgico e micoplasma

O conhecimento da microbiota do modelo animal utilizado em pesquisa importante para definir seu estado sanitrio. Tabela 8 Principais bactrias e micoplasma que afetam animais de laboratrio
Agente etiolgico
Bacillus piliformis Responsvel pela doena de Tyzzer.

Espcie afetada
Afetam uma variedade de animais, incluindo camundongos, ratos, hamsters, coelhos e primatas no-humanos (Rhesus).

Caractersticas

Transmisso

A transmisso ocorre aps So bacilos gram negativos, intracelulares. Clulas mononucleares ingesto de esporos pelas infiltradas e neutrfilos so observados fezes (transmisso fecal-oral). em reas afetadas, mesmo podendo no ser observado o bacilo nas leses. Leses da doena so caracterizadas por necrose heptica, hepatite, colite e miocardite. As leses entricas so mais graves em coelhos e hamsters.

Bacilo associado aos clios respiratrios (CAR Bacillus) Causam doena respiratria crnica.

Ratos, camundongos, So bacilos gram negativos. A Atravs de fmites e contato coelhos, hamsters e cobaias. mortalidade na maioria dos casos est direto. associada coinfeco com Mycoplasma e Vrus Sendai. As leses causadas por esta bactria se localizam no trato respiratrio superior. A bactria pode ser visualizada entre os clios do epitlio respiratrio. Devido dificuldade em isolar as bactrias em meios comuns, o ideal para o diagnstico a pesquisa de anticorpos atravs de tcnicas de sorologia ou a pesquisa do bacilo pela reao em cadeia da polimerase (PCR). Ratos, camundongos, hamsters e cobaias. So cocos gram positivos. Em Contato direto com urina e roedores, pode causar o surgimento fezes contaminadas. de abscessos nos tecidos, atingindo tmpano e ouvido mdio. Quando sua forma epizotica, os ratos podem desenvolver embolia pulmonar. Em camundongos, a doena pode evoluir para articulaes, fgado e rim. O diagnstico se d atravs da observao direta das bactrias em cultivo dos abscessos com meios apropriados (ex.: gar sangue, tripticase soy com 5% de sangue de carneiro etc.). A pesquisa de anticorpos atravs de sorologia indicada devido ao baixo custo e fcil manuseio. Outra forma atravs de tcnicas moleculares.

Corynebacterium kutscheri

Animais de laboratrio | 209

Agente etiolgico
Staphylococcus aureus

Espcie afetada

Caractersticas
Como se trata de uma zoonose, a contaminao pode ter sido levada pelo homem aos animais. As formas clnicas so as dermatites ulcerativas, abscessos e pododermatites (dermatite que afeta apenas as patas dos animais). O diagnstico depende do isolamento e da identificao bacteriana em material das leses, utilizando meios de cultivo seletivos de forma que outros microrganismos no interfiram nos resultados.

Transmisso

Mycoplasma pulmonis

Ratos, camundongos, A transmisso ocorre por Principal agente responsvel pelas aerossis e por via hamsters, coelhos e cobaias. doenas respiratrias crnicas dos ratos. A infeco assintomtica a transplacentria. mais comum. Os sinais clnicos podem ser: otite mdia e interna, que leva o animal a movimentar-se em crculos, rinite com espirros e descarga nasal mucosanguinolenta e pneumonia com dispneia e debilidade progressiva. Pode infectar o trato genital das fmeas, causando baixa fertilidade e reduo de peso da prole. O diagnstico pode ser feito pelo isolamento atravs de material do trato respiratrio, sorologia ou tcnicas de reao em cadeia da polimerase. Somente a seleo de animais livres de micoplasma, identificados por monitoramento contnuo, pode permitir a obteno de estoques negativos.

Controle parasitolgico

Os animais de laboratrio criados e mantidos nas colnias em condies convencionais so comumente afetados por uma grande variedade de ectoparasitas e endoparasitas (tabela 9). De um modo geral, estes parasitas atuam comprometendo a sade e interferindo em trabalhos realizados com os animais. aconselhvel promover medidas preventivas antiparasitrias e mantlas com as diferentes espcies criadas em biotrios. H a necessidade de fazer exames peridicos, verificando o aspecto e a sanidade, alm de se manter os animais sob condies sanitrias controladas. A presena de parasitas na colnia influencia na fisiologia dos animais e na suscetibilidade a outros agentes infecciosos.

210 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

O parasitismo geralmente assintomtico, mas, dependendo da intensidade, produz uma ampla variedade de sinais clnicos. Os ectoparasitas (tabela 10) podem causar prurido, dermatite, perda ou rarefao da pelagem nas regies afetadas, pelos arrepiados, descamao epidrmica e ulceraes de pequena ou grande extenso, reduo nos ndices de reproduo e consequentemente perdas econmicas, alm da interferncia nos resultados de pesquisa. Os sinais clnicos causados pelos endoparasitas incluem diminuio da taxa de crescimento, irritao anal, prolapso retal, intussuscepo intestinal, enterite catarral, granuloma heptico, queda no ganho de peso, acmulos de gases, distenso abdominal, fezes amolecidas ou aquosas, constipao intestinal, pelos arrepiados, colite, perdas econmicas ligadas diminuio da taxa de produtividade das colnias e interferir nos resultados. O tratamento das ectoparasitoses em animais de laboratrio baseia-se na aplicao de substncias qumicas solveis sob a forma de banhos de imerso, diretamente sobre a pelagem do animal, misturadas cama pela administrao subcutnea e na gua dos bebedouros. O tratamento de helmintos pode ser realizado com o uso de vrias drogas anti-helmnticas, isoladas ou combinadas. Os anti-helmnticos so administrados por via oral, adicionados rao ou gua.
Exames endoparasitolgicos

O exame endoparasitolgico constitui um valioso recurso para o diagnstico das doenas parasitrias. Os parasitas intestinais so habitualmente identificados por sua morfologia ao microscpio. Este exame consiste na pesquisa de cistos, trofozotos e oocistos de protozorios, ovos, adultos e larvas de helmintos. Cuidados com as amostras de fezes:
As amostras fecais devem ser recentes. Preferencialmente coletadas diretamente da ampola retal do animal.

Animais de laboratrio | 211

Em situaes especiais, fezes frescas podem ser coletadas do fun-

do da gaiola.
Amostras devem ser coletadas em frasco limpo e seco. Examinar as amostras de fezes macroscopicamente e microscopicamente. Processar as amostras o mais rpido possvel. As amostras que demorarem a serem analisadas devem ser colocadas

em conservantes qumicos.
Identificar as amostras com espcie animal, idade, sexo e hora da

coleta. Para animais que no podem ser retirados da colnia, recorre-se a tcnicas onde a amostra no requer eutansia. A tcnica da fita celofane para pesquisa de ovos de Syphacia spp. uma delas.
Tcnica da fita celofane adesiva: Realizar a conteno do animal e, com fita adesiva celofane, fazer uma

impresso na regio perianal.


Colocar a fita com face adesiva voltada para a lmina de microscopia

devidamente identificada.
Observar a lmina ao microscpio usando a objetiva de menor

aumento (10x). Os animais de pequeno porte enviados ao laboratrio so submetidos ao exame direto da mucosa intestinal. Esta tcnica possibilita um diagnstico amplo, pois se obtm amostra de todas as pores do intestino.
Exame direto da mucosa intestinal: Aps eutansia, fazer uma inciso pr-retro-umbilical na linha mediana

do abdome.

212 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Retirar intestinos, delgado e grosso, e colocar em placas de Petri

identificadas.
Adicionar soluo salina (NaCl a 0,85%). Abrir os intestinos longitudinalmente. Realizar o exame macroscpio, atravs de observao da placa de Petri

sob um fundo preto, a fim de facilitar a visualizao dos helmintos.


Poro do material que est na placa colocada entre lmina e lamnula

e observada ao microscpio ptico. Para a pesquisa de oocistos de Eimeria stiedae em coelhos utilizado o mtodo de exame direto da bile.
Exame direto da bile: Aps a eutansia, realizar a inciso pr-retro-umbilical no abdome do

coelho.
Retirar a vescula biliar, colocar em placa de Petri e abrir para expor o

seu contedo.
Adicionar soluo salina a 0,85%. Preparar lmina de microscopia com este contedo. Observar em microscpio ptico.

Amostras de fezes de roedores, coelhos, ovinos e primatas no-humanos podem tambm ser testadas pelo exame direto, em fezes frescas pela diluio de pequena poro da matria fecal em soluo fisiolgica e identificao do material ao microscpio. No mtodo de Willis (flutuao), misturada pequena quantidade de fezes soluo saturada de cloreto de sdio ou acar. Para complementar o diagnstico parasitolgico em primatas no-humanos, utilizada a tcnica de sedimentao espontnea de Dennis-Stone & Swanson modificada, onde a amostra fecal diluda em soluo de detergente neutro.

Animais de laboratrio | 213

H muitos outros mtodos coproparasitolgicos que podem ser utilizados, permitindo detectar parasitas nas fezes dos animais de laboratrio. Tabela 9 Principais endoparasitas de animais de laboratrio
Espcies
Aspiculuris tetraptera

Hospedeiro
Camundongos, ratos e hamsters

Habitat
Nematdeo encontrado no ceco e clon

Caractersticas
Os vermes adultos apresentam asa cuticular cervical. As fmeas medem de 3,0 a 4,0 mm de comprimento e os machos entre 2,0 a 4,0 mm de comprimento. Seus ovos so elipsoides com presena de uma massa de blastmeros visveis. O ciclo de 23 dias, os ovos so observados nas fezes e necessitam de seis dias para embrionao. o parasita que promove a oxiurase em camundongos, normalmente no patognicos. A infeco de animais de laboratrio ocorre aps a ingesto de ovos embrionados. Os ovos alongados apresentam como caracterstica achatamento em um dos lados, em forma de D, medindo entre 72 a 82 por 25 a 36 micrmetros. A fmea mede 3,4 a 5,8 mm de comprimento e deposita os ovos no clon ou na regio perianal. O macho menor e mede 1,1 a 1,5 mm de comprimento e possui trs dilataes, chamadas mameles, na face ventral tero posterior do corpo. Os vermes adultos apresentam dilatao cuticular ceflica. Apresentam um ciclo direto com um perodo de oito a 15 dias. As fmeas medem entre 2,8 a 4,0 mm e os machos entre 1,2 a 1,3 mm de comprimento. Os ovos so similares aos de Syphacia obvelata. Podem ser encontrados em grandes quantidades. Os machos medem de 4,0 a 5,0 mm em seu comprimento e as fmeas de 9,0 a 11,0 mm. Possuem corpo semitransparente o que facilita a visualizao do bulbo esofgico. O ovo apresenta parede fina, com achatamento lateral em um dos seus lados, medindo entre 95 e 103 por 43 micrmetros. Seu ciclo de vida direto com 55 a 65 dias e a infeco por ingesto do ovo embrionado. As fmeas adultas medem 18,4 a 20,9 mm de comprimento e os machos, 16,3 a 17,6 mm. As fmeas adultas medem entre 30 a 40 cm de comprimento e os machos, 15 ou 30 cm. Os ovos frteis medem entre 60 a 45 micrmetros e os ovos infrteis, mais alongados, entre 80 a 90 micrmetros de comprimento. Os vermes adultos medem entre 3 a 5 cm de comprimento. Os ovos variam de tamanho entre 50 e 55 micrmetro de comprimento por 22 ou 23 micrmetro de largura. Essa espcie tambm muito encontrada no homem. O verme adulto tem comprimento que varia entre 2 e 4 cm e possui esclex pequeno e globoso com presena de vrios acleos dispostos em torno do rostro. Os ovos tm formato oval ou arredondado e medem de 40 a 50 micrmetros de dimetro. Causa doenas ao homem, podendo ser infectado pela manipulao dos animais.

Syphacia obvelata

Camundongos, ratos e hamsters

Ceco e clon

Syphacia muris

Ratos

Ceco e clon

Passarulus ambiguus

Coelhos

Oxiurdeo do ceco e clon

Paraspidodera uncinata Ascaris lumbricoides

Cobaias Primatas

Parasita do ceco e clon Intestino delgado

Trichuris trichiura

Primatas

Ceco

Hyminolepis nana

Camundongos, ratos, hamsters e primatas

Intestino

214 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Espcies
Hyminolepis diminuta

Hospedeiro
Camundongos, ratos e hamsters

Habitat
Intestino delgado

Caractersticas
Conhecido como a tnia do rato. O verme adulto mede entre 10 e 20 cm de comprimento e possui um esclex pequeno, com quatro ventosas, desprovido de acleos. Os ovos so esfricos, com casca dupla, e medem de 70 a 80 micrmetros de dimetro. Protozorio ciliado encontrado comumente em animais convencionais. Aparentemente no patognicos. A forma trofozota mede entre 55 a 115 micrmetros de comprimento por 45 a 73 micrmetros de largura e a forma cstica, entre 40 a 50 micrmetros de largura. A coccidiose causada por protozorios patognicos que costumam ter localizao bem especfica no organismo do hospedeiro. Causam doenas graves em diversas espcies animais. O gnero Eimeria caracteriza-se por apresentar no interior dos oocistos quatro esporocistos, cada um deles com dois esporozotas.

Balantidium caviae

Cobaias

Ceco e clon

Eimeria stiedae

Duodeno, fgado e vias biliares

Coelhos

E.irresidua, E.neoleporis, E.intestinalis, E.magda (So as mais patognicas) Eimeria perforans Eimeria media

Eimeria flavescens,

Intestino delgado

Intestino grosso e delgado Camundongo Cobaia Ratos Primatas Intestino grosso

Eimeria falciformis Eimeria caviae


Eimeria nieschulzi e E. separata

Intestino Intestino
Encontrado nas fezes, os trofozotos medem entre 30 e 150 m de comprimento por 25 a 120 m de largura. Os cistos so ovoides ou esfricos e medem entre 40 e 60 m de dimetro. Ciliado, no patognico. Sua forma trofozota mede entre 10 a 36 m por 9 a 24 m. Caracteriza-se pela forma afunilada. A nica forma encontrada a trofozota. Protozorio com uma forma intermediria de pseudocisto e trofozota. O trofozota mede entre 16 a 26 m de comprimento por 10 a 14 m de largura. O perodo de desenvolvimento de trs a dez dias. Protozorio anteriormente conhecido como Hexamita muris. Apresenta aspecto piriforme, simetria bilateral, mede de 7 a 9 m de comprimento por 2 a 3 m de largura. um protozorio flagelado causador da giardase. O trofozota mede entre 7 a 13 m comprimento por 5 a 10 m de largura. O ciclo leva em torno de 5 a 15 dias. G. muris se reproduz por participao binria ou mltipla.

Balantidium coli

Cyathodinium cunhae

Cobaias

Ceco e clon

Tritricomonas muris

Camundongos, ratos, cobaias e hamsters

Clon e ceco

Spironucleus muris

Giardia muris

Ratos, hamsters, camundongos e vrios roedores selvagens ao redor do mundo Camundongos, ratos e hamsters

Intestino delgado e ceco Poro anterior do intestino delgado

Animais de laboratrio | 215

Espcies
Giardia caviae Giardia intestinalis

Hospedeiro
Cobaias Primatas no-humanos

Habitat

Caractersticas
No patognica. A forma trofozota mede entre 8 a 15 m por 6 a 10 m de largura. Apresenta a forma cstica e trofozota. A forma trofozota mede 12 a 15 m de comprimento por 6 a 8 m de largura. Os cistos medem 8 a 12 m e 7 a 10 m de comprimento e contm quatro ncleos. Espcie no patognica. A forma trofozota mede de 8 a 30 m de comprimento e os cistos de 9 a 20 m de dimetro. Podem conter oito ncleos. A forma trofozota mede de 10 a 20 m de comprimento e o cisto de 11 a 17 m de dimetro. No patognica, o trofozota mede de 12 a 30 m de comprimento e os cistos de 7 a 21 m de dimetro.

Poro anterior do intestino delgado

Entamoeba muris Entamoeba caviae Entamoeba cuniculi

Camundongos, ratos e hamsters Cobaias Coelhos

Cecon e clon Ceco Ceco e Clon

Exames ectoparasitolgicos

O exame de ectoparasitas consiste na identificao dos artrpodes ectoparasitas de interesse veterinrio, encontrados na pele dos animais de laboratrio convencionais. A contaminao dos animais convencionais por ectoparasitas problema de importncia sanitria e de difcil controle. Algumas espcies podem atuar como vetores biolgicos de outros agentes infecciosos. Devido as suas caractersticas anatmicas e alimentares, os caros que mais frequentemente acometem os animais de laboratrio ficam confinados ao hospedeiro e aderem firmemente pelagem. Os mtodos a serem empregados consistem em exame de inspeo, com observao macroscpica do animal no intuito de detectar alguma evidncia relacionada com ectoparasitas. Procedimentos: Para o diagnstico dos ectoparasitas em animais de laboratrio, vrias tcnicas podem ser utilizadas:
Os cadveres dos animais so colocados em decbito ventrais e

expostos iluminao de uma lmpada incandescente, mantendo uma distncia de aproximadamente 30 cm, para induzir a migrao dos ectoparasitas para o dorso do animal. Aps vinte minutos, com o auxlio de microscpio estereoscpio, toda pelagem

216 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

vistoriada. Os ectoparasitas encontrados so removidos do corpo hospedeiro e imersos entre lmina e lamnula com gota de lquido de Hoyer (clarificador) para serem identificados ao microscpio ptico.
Tambm se pode colocar o cadver, logo aps sua morte, no

refrigerador durante trinta minutos e posteriormente temperatura ambiente por dez minutos ou mais. Os caros abandonam o corpo do hospedeiro assim que a temperatura comea a cair, deixam as camadas mais profundas do pelo e migram para as pontas. Observar o cadver em microscpio estereoscpio.
Em um papel preto, colocar a carcaa do animal. Este papel

ento margeado com fita celofane com o lado colante voltado para cima, evitando, desta maneira, que os parasitas fujam ao tentar deixar o corpo do hospedeiro. O papel preto facilita a observao dos artrpodes pequenos.
Outro mtodo utilizado o da fita adesiva de celofane, colo-

cando a mesma no pelo do animal e retirando-a logo depois. Colocar em lmina de microscopia devidamente identificada e levar ao microscpio ptico.
No caso de raspado de pele, este deve ser profundo e a regio

escolhida prxima de uma leso. Os pelos so removidos com lmina de bisturi, untada com glicerina ou leo lubrificante. O material do raspado colocado imerso em leo entre lmina e lamnula e observado em microscpio ptico.
Para a pesquisa de caro do canal auditivo externo, remove-se

com swab o cerume e se examina ao microscpio.


Identificar os espcimes com chaves para classificao e livros de

referncia.

Animais de laboratrio | 217

Tabela 10 Principais ectoparasitas de animais de laboratrio


Espcies
Chirodiscoides caviae

Hospedeiro
Cobaia

Habitat
Pelo

Caractersticas
caro que, em infestaes macias, pode ser encontrado por todo o corpo e pode provocar sinais clnicos como alopecia e prurido. Fmeas e machos apresentam o corpo alongado e medem de 300 a 500 m de comprimento. Forma ovalada e tamanho 350 m de largura por 500 m de comprimento. Coelhos infectados com Cheyletiella apresentam descamaes aderidas ao pelos. caro encontrado em colnias convencionais.

Cheyletiella parasitivorax Demodex aurati Psorergates simples

Coelho

Pelo e corpo

Hamster
Camundongo

Folculos e sistema pilossebceo

Folculos e glndulas Os caros e seus detritos acumulam-se nas invaginaes foliculares e aparecem pequenos ndulos brancos sobre sebceas a pele das regies da cabea e do pescoo. Mede de 90 a 150 m. De ocorrncia rara. Pelagem um caro cujas fmeas medem aproximadamente entre 400 a 500 m e os machos, de 285 a 320 m de comprimento. O primeiro par de patas curto e modificado para a aderncia aos pelos. Os ovos so ovais, com 200 m de comprimento, e ficam aderidos aos pelos. M. musculinus localiza-se preferencialmente na regio da cabea, d pescoo e da nuca. A transmisso se d por transferncia direta. o ectoparasita mais comum em camundongo de laboratrio. A fmea apresenta o corpo oval-alongado, medindo cerca de 300 m de comprimento por 130 m de largura e o macho tem o corpo menor e menos ovalado. O terceiro par de patas do macho e o terceiro e quarto pares de patas da fmea esto modificados para aderncia aos pelos. Todos os estgios ocorrem na pelagem e o ciclo completo de vida de aproximadamente 14 dias. um caro que provoca um acmulo de secreo serosa e de crostas marrons no pavilho auricular. A fmea arredondada, mede entre 400 a 750 m e os machos entre 370 a 550 m. Seu ciclo de vida de 21 dias. o caro de mais difcil ocorrncia, responsvel pela sarna auricular em ratos (gnero Rattus). A transmisso por contato direto. Infesta os ratos do gnero Rattus. Apresenta dois ganchos tarsais, presentes no segundo par de patas. Apresenta colorao castanha, comprimento entre 1,2 a 2,5 mm e abdome ovalado. Ciclo de trinta dias. um vetor para a transmisso da Francisella tularensis ao homem. Sua forma delgada, com cabea estreita, e mede aproximadamente 1,0 a 1,5 mm de comprimento. Em infestaes macias, pode causar prurido, feridas e alopecia. Piolho de ocorrncia rara. Apresenta colorao clara, cabea mais larga e abdome ovalado, medindo entre 1,0 e 1,2 mm.

Myobia musculi

Camundongo

Myocoptes musculinus

Camundongo

Pelo

Psoroptes cuniculi

Coelho

Conduto auditivo externo

Notoedres muris

Rato

Radfordia ensifera Haemodipsus ventricosis

Rato Coelho

Orelha, focinho, cauda, genitlia externa e membros posteriores Pelagem Corpo

Gliricola porcelli

Cobaia

Corpo

Gyropus ovalis

Cobaia

Corpo

218 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Espcies
Polyplax serrata Polyplax spinulosa

Hospedeiro
Camundongo Rato

Habitat
Pescoo e dorso

Caractersticas
Piolho sugador com ciclo de vida de 13 dias. Tamanho varia de 600 a 1.500 m. Transmite o agente da eperitrozoonose murina. Piolho cujos ovos maturam aps seis dias. Possui ciclo de vida de 13 dias e pode servir como vetor para hemobartelose murina e Brucella brucei. A transmisso dos piolhos por contato direto.

Corpo

Necropsia

A necropsia tem por definio a abertura e inspeo criteriosa de todos os rgos e tecidos de um animal morto com o objetivo de determinar a causa de sua morte. Por esta tcnica possvel descrever alteraes macroscpicas em diferentes circunstncias, como processos patolgicos desencadeados por agentes infecciosos, parasitrios, qumicos, fsicos e fisiolgicos, assim como processos neoplsicos e anomalias congnitas. Por esse motivo, amostras oriundas de uma necropsia podem fornecer material para diversos exames complementares, como histopatolgico, parasitolgico, bacteriolgico e at mesmo para biologia molecular. A necropsia deve ser realizada em sala prpria, devidamente iluminada e ventilada, preferencialmente em uma cabine de segurana biolgica. Antes de iniciar o procedimento, necessrio observar o histrico do animal, isto , dados como espcie, linhagem, peso, idade, procedncia, sintomatologia ou estado clnico. Essas informaes so de suma importncia, j que auxiliam o diagnstico conclusivo (causa mortis). O animal colocado em decbito dorsal e a necropsia iniciada com um exame minucioso da superfcie corporal, avaliando-se o estado geral do cadver e levando-se em conta seu estado nutricional, a presena de sinais externos e as alteraes cadavricas. No exame externo, so inspecionados: pele, pelos, unhas, mama, bolsa escrotal, cavidades naturais e mucosas da boca, pavilho auricular, narinas, olhos, nus e genitais. A abertura do cadver realizada por uma inciso longitudinal sobre a linha alba, partindo da regio junto mandbula at a regio anal. A pele ento rebatida, expondo dessa

Animais de laboratrio | 219

forma as musculaturas torcica e abdominal. A cavidade torcica aberta e os rgos so expostos. primordial que sejam observados posio, tamanho, colorao e presena de estruturas estranhas ou anormais. Esta percepo deve existir durante toda a necropsia. Na cavidade abdominal, os rgos so deslocados e seccionados. Com o cadver do animal em decbito ventral, inspecionado o sistema nervoso central. Todas as alteraes encontradas devem ser registradas. Os rgos e tecidos que apresentem alguma alterao, assim como ndulos e massas encontrados, so coletados. Pequenos fragmentos (0,5 cm 2) da leso, juntamente a regio aparentemente saudvel, so suficientes para a anlise histopatolgica. A fixao desse material deve ser imediatamente aps a coleta e acondicionada em frasco devidamente identificado. H vrias solues fixadoras, sendo a formalina tamponada 10% a mais comumente usada, na proporo de dez partes de soluo para cada parte de tecido a ser fixado.
Controle gentico

Atualmente, milhares de linhagens isognicas de camundongos, com multiplicidade de finalidade, esto disponveis em biotrios do mundo todo. O laboratrio de controle gentico animal tem como principal funo aplicar metodologias que permitam verificar e assegurar a integridade gentica das colnias. A integridade gentica consiste em manter a continuidade da espcie ou das linhagens e, no caso de camundongos e ratos isognicos, garantir a pureza da linhagem e a homogeneidade destes animais. O monitoramento gentico auxilia na manuteno das linhagens isognicas, as quais possuem caractersticas essenciais para a reprodutibilidade de dados experimentais dos pesquisadores. Na maioria dos casos, a contaminao gentica acidental, tendo como fonte principal de falha o erro humano, podendo ocorrer devido a cruzamentos inadvertidos ou troca de identificao das linhagens.

220 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

O monitoramento gentico pode ser realizado por vrias metodologias, como a identificao dos genes de pigmentao (visualizao da colorao da pelagem na prole), polimorfismo bioqumico (identificao das isoenzimas), anlise osteomtrica (analisa o desenvolvimento da mandbula), anlise de histocompatibilidade (testado pelo transplante de pele), observao de comportamento (modificao do comportamento), avaliao da prole (nmero de filhotes nascidos), ocorrncia de patologias (comuns a linhagem) e identificao de mutaes espontneas ou induzidas e possveis contaminaes genticas (marcadores moleculares).
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Animais de laboratrio | 221

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Captulo 5
Fundamentos em qumica experimental
Mnica Mendes Caminha Murito Virginia de Lourdes Mendes Finete 1. Qumica: uma cincia essencialmente experimental

A Qumica a cincia que estuda as substncias presentes na natureza, do que elas so feitas, como se transformam e as diversas aplicaes destas substncias em nosso dia-a-dia. Embora o estudo da Qumica seja constitudo de mltiplos conceitos tericos, associados ao conhecimento de uma simbologia prpria, a essncia desta cincia experimental.

Qumica: do egpcio keme, que significa terra Ramos da qumica: Qumica inorgnica Qumica orgnica Fsico-qumica Qumica analtica

224 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

2. Introduo ao laboratrio de Qumica

O laboratrio o local mais importante para o desenvolvimento da Qumica e ambiente de atuao dos profissionais da sade e de outras reas afins. no laboratrio que se estabelecem relaes entre o que observado no campo macroscpico, com os conceitos, teorias e modelos formulados em nvel microscpico.
Niels Bohr, cientista dinamarqus, criou seu modelo atmico em 1913, propondo que os eltrons esto dispostos no tomo em rbitas circulares, ao redor do ncleo, como os planetas em torno do sol. A cor no teste de chama a energia que os eltrons do elemento emitem em forma de luz, ao retornarem ao seu estado fundamental.

A realizao de qualquer atividade no laboratrio requer o uso da vestimenta adequada: cala comprida, jaleco fechado de manga comprida, sapato fechado em couro e culos de proteo, os quais oferecem uma barreira de proteo mnima contra eventuais respingos ou derramamentos de substncias qumicas. Tambm imprescindvel reconhecer os diversos materiais, equipamentos, substncias, fontes de consulta bibliogrfica, smbolos de segurana e apresentar uma postura adequada.
3. Solues 3.1. Propriedades das solues

As substncias qumicas presentes na natureza e utilizadas em nosso cotidiano encontram-se, geralmente, em forma de solues. As solues podem ser lquidas, slidas ou gasosas.

Fundamentos em qumica experimental | 225

SOLUO Soro fisiolgico Ao Ar atmosfrico

SOLUTO Cloreto de sdio Carbono Oxignio, gs carbnico e outros gases

SOLVENTE gua Ferro Nitrognio

Solues: so misturas homogneas constitudas por um ou mais solutos dissolvidos em um solvente.

Solubilidade: a capacidade de uma substncia (soluto) ser dissolvida por um determinado solvente, a uma dada temperatura.

Fatores que influenciam a solubilidade

TEMPERATURA PRESSO FORAS INTERMOLECULARES

As foras intermoleculares dependem das ligaes qumicas presentes: substncias formadas por ligaes covalentes podem ser POLARES ou APOLARES. A gua (b), por ser uma substncia polar, um bom solvente para o lcool (a), que tambm polar; porm, a gua um solvente ruim para a gasolina (c), que apolar, formando assim uma mistura heterognea.

226 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

3.2. Concentrao das solues

Concentrao a quantidade de soluto contida em um volume ou em uma massa de solvente.


A soluo saturada quando contm a mxima quantidade possvel de soluto dissolvido e insaturada antes de atingir esse ponto. Tambm possvel obter uma soluo supersaturada aquecendo uma soluo saturada, que tenha parte do soluto no dissolvido, at que todo ele se dissolva. Deve-se manter a soluo em repouso e deixar que ela atinja a temperatura ambiente lentamente.

Soluo saturada de CuSO4

sedimento de CuSO4 no-dissolvido

3.2.1. Concentrao em quantidade de matria

A quantidade de matria uma unidade fundamental do Sistema Internacional de Unidades (SI) que expressa a quantidade em mol de uma substncia. Concentrao em quantidade de matria a quantidade em mol do soluto por litro de soluo: Concentrao em quantidade de matria = mol do soluto = mol L-1 L de soluo Um exemplo da expresso da concentrao em quantidade de matria a quantidade de sal, NaCl, na gua do mar: cada 1 L contm 27 g de sal. possvel converter a massa de sal em quantidade de matria: A massa molar do NaCl a soma das massas do Na e do Cl: 23 + 35,5 = 58,5 g/mol. Ento se 1 mol de NaCl pesa 58,5 g, quantos mol correspondem a 27 g? Basta fazer a seguinte regra de trs:
58,5 g NaCl 1 mol 27 g NaCl x x = 0,46 mol

Fundamentos em qumica experimental | 227

Assim, a concentrao em quantidade de matria do sal NaCl na gua do mar a 0,46 mol L-1.
3.2.2. Concentrao em massa por volume C
(m/v)

A concentrao em massa por volume expressa a massa do soluto em gramas, por litro de soluo.
C(m/v) = massa de soluto (g) = g L-1 L

A soluo fisiolgica constitui-se de 9,0 gramas de cloreto de sdio, NaCl em um litro de gua. A concentrao desta soluo igual a 9,0 g L -1. Em geral, essa concentrao expressa nos rtulos em termos percentuais. Para isso, deve-se calcular a massa de NaCl contida em 100 ml de soluo:
1 L = 1.000 mL 9,0 g NaCl 1.000 mL de soluo x 100 mL de soluo 0,9 g / 100 mL= 0,9 % (m/v)

3.2.3. Concentrao em massa por massa C(m/m) e volume por volume C(v/v)

Esse tipo de concentrao comumente expresso em forma de composio percentual: Composio percentual (%): a porcentagem em massa ou volume de um soluto por massa ou volume de soluo.
% (m/m) = massa de soluto (g) . 100 massa de soluo (g) % (v/v) = volume de soluto (L) . 100 volume de soluo (L)

228 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

possvel observar essa expresso da concentrao em rtulos de muitos produtos utilizados no cotidiano. O vinagre, por exemplo, uma soluo de cido actico em gua a 3,0 %. Isso significa que uma garrafa de 750 g de vinagre contm 22,5 g de cido actico:
cido actico no vinagre % (m/m) = 22,5 g . 100 = 3,0 % 750 g 3.3. Preparo de solues

Preparar solues uma das tarefas principais dentro de um laboratrio. Uma soluo mal preparada ocasiona erros em formulaes e anlises. Para o preparo de uma soluo, devem ser seguidos os seguintes passos:
Primeiro passo Qualidade da gua

A maioria das solues utilizadas em laboratrio so lquidas e tm a gua como solvente. importante que a gua apresente um nvel de qualidade satisfatrio e atenda s especificaes preconizadas pelas farmacopeias. 1 Especificaes USP para guas purificadas
ANLISES/ DETERMINAES pH (25C) Condutividade (25C) Cloretos Amnio Ferro
1

ESPECIFICAO 5,0 - 7,0 </= 1,3 uS/cm </= 1,0 ppm2 </= 0,3 ppm Passa teste

Farmacopeias: cdigos onde se estabelecem, dentre outras coisas, os requisitos mnimos de qualidade para frmacos, insumos, drogas vegetais, medicamentos e produtos na rea da sade. A Farmacopeia Brasileira o cdigo oficial farmacutico do pas. 2 ppm e ppb: partes por milho e partes por bilho indicam a concentrao em mg/L ou mg/L, respectivamente.

Fundamentos em qumica experimental | 229

Clcio TOC (carbono orgnico total) Nitratos Nitritos Formol Cloro total Cloro livre Fonte: USP 30, NF 25, 2007.

passa Teste < 500 ppb </= 0,2 ppm </= 0,2 ppm ausente < 5,0 ppm < 5,0 ppm

Segundo passo Qualidade dos reagentes

Existem diferentes graus de pureza para um reagente qumico, de acordo com o fim a que se destina. Quanto maior for o grau de pureza, maior ser o custo do reagente. Grau de pureza (p) o quociente entre a massa de substncia pura e a massa total da amostra. Classificao dos reagentes de acordo com o grau de pureza
Grau de pureza Tcnico ou comercial Para anlise (PA) Classificao do reagente Destinados a fins industriais, no requerem grau de pureza elevado. Substncias de grau de pureza analtico, destinadas a anlises fsico-qumicas, com baixos teores de contaminantes. Materiais de referncia certificados utilizados na avaliao da conformidade dos insumos farmacuticos e dos medicamentos, como referncia de controle de qualidade.

Substncias Qumicas de Referncia (SQR)

230 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Grau de pureza Ultrapuro

Classificao do reagente Substncias de alto grau de pureza, destinadas a processos analticos altamente sensveis, como anlises cromatogrficas, espectroscpicas, etc.

As monografias de matrias-primas (insumos), constantes nas farmacopeias, contm os ensaios de pureza e dosagens requeridos para os reagentes qumicos.
Terceiro passo Qualidade da vidraria

As vidrarias corretas devem ser selecionadas: para o preparo de solues padro ou de concentrao em quantidade de matria, devem ser escolhidas vidrarias de preciso, como a pipeta e o balo volumtricos. J para solues expressas em composio percentual no h a necessidade de vidrarias to precisas. Podem ser utilizadas, ento, provetas, cilindros graduados e pipetas graduadas.

Fundamentos em qumica experimental | 231

Quarto passo Qualidade na tcnica de preparo da soluo

1. Para solues de soluto slido, deve-se pesar o soluto em balana analtica, verificando antes de tudo se a mesma encontra-se calibrada e nivelada. O recipiente para pesagem pode ser um bcher, erlenmeyer, vidro de relgio ou naveta, e deve estar limpo e seco. J para solutos lquidos, deve-se utilizar a pipeta. 2. Antes de abrir o frasco do reagente, ler o rtulo e verificar a presena de smbolos de risco, obedecendo s normas de biossegurana. Deve-se utilizar uma esptula para retirar a poro a ser pesada ou, no caso de substncias lquidas, transferir pequena poro para outro recipiente e s ento pipetar o lquido. Nunca devemos introduzir outro tipo de objeto no frasco de reagente, evitando contaminaes. Tambm importante no manipular diretamente com os dedos o recipiente de pesagem a fim de evitar que a gordura dos dedos influencie na leitura. 3. Aps a pesagem, o soluto dever ser transferido quantitativamente, ou seja, totalmente, para a vidraria escolhida: um balo volumtrico ou cilindro graduado. adequado utilizar um funil e um basto de vidro para auxiliar nessa transferncia. 4. Em seguida, deve-se avolumar a soluo, adicionando um volume de solvente at o trao de aferio da vidraria. muito importante elevar ao nvel dos olhos, observando a posio do menisco, evitando assim o erro de paralaxe. Obs: A sigla q.s.p. aparece com frequncia em solues e formulaes de produtos e significa quantidade suficiente para, ou seja, para completar o volume final.

MENISCO

232 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

A homogeneizao da soluo deve ser feita apoiando o fundo da vidraria com a palma de uma das mos e segurando firmemente a tampa com a outra.
3.3.1. Diluio de solues

Diluio uma tcnica em que se acrescenta solvente soluo. A quantidade de soluto permanece constante.

A equao geral para diluio a partir de uma soluo concentrada (soluo estoque) : C1 .V1 = C2 .V2

Fundamentos em qumica experimental | 233

3.3.2. Titulao

A titulao uma tcnica utilizada em anlises volumtricas (ver item 4.1.5.1.3.), para a verificao da concentrao das solues preparadas em laboratrio.

Para realizar uma titulao, empregase a bureta, que uma vidraria de preciso, e utiliza-se uma soluo padro, de concentrao conhecida (titulante). A substncia para o preparo da soluo padro deve ser quimicamente estvel, ter alto grau de pureza e ser adequada para reagir com a soluo que se deseja analisar (titulado).
Fator de correo: Multiplicando a concentrao pelo fator de converso, f, obteremos a concentrao real da soluo. Caso o fator de correo seja maior que 1 10%, deve-se fazer uma diluio e, atravs de nova titulao, determinar a concentrao. f = Concentrao obtida Concentrao desejada

3.3.3. Armazenagem de solues

As solues alcalinas, Nome:_________________________________ como a de hidrxido de sdio Concentrao:_____________ Fator:___________ (NaOH), no devem ser Data de validade: ______/_____/_____ Instrues Especficas de Armazenagem guardadas em frascos de viTcnico Responsvel dro, pois os hidrxidos atacam o mesmo e dissolvem a slica com formao de silicatos solveis. O cido

234 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

fluordrico, HF, tambm reage com o vidro formando SiF4. Estas solues devem ser conservadas em frascos de polietileno. Solues que sofrem decomposio pela exposio luz, como a de nitrato de prata, AgNO 3, devem ser estocadas em frasco mbar. As demais solues podem ser armazenadas em frascos de vidro, bem fechados e rotulados.
4. Qumica analtica

A Qumica Analtica o ramo da qumica que estuda a identificao e quantificao das substncias que compem uma amostra. Atravs das determinaes analticas possvel saber do que a amostra feita e quanto de cada substncia est presente. O controle de qualidade das diversas matrias-primas e dos produtos industrializados que utilizamos, os resduos gerados nesses processos produtivos, as reaes qumicas que acontecem na natureza e as pesquisas envolvendo a transformao de substncias em novos produtos so reas onde a qumica analtica est presente. importante destacar que as metodologias em Qumica analtica encontram-se disponveis nas farmacopeias. A seguir, temos a descrio das etapas de uma determinao analtica: 1. Planejamento e organizao da anlise 2. Estudo das propriedades da substncia de interesse (analito) 3. Amostragem 4. Preparo da amostra para anlise no laboratrio (amostra laboratorial) 5. Seleo do mtodo de anlise clssico ou instrumental? 6.Tratamento de dados / validao

Fundamentos em qumica experimental | 235

4.1. Etapas de uma determinao analtica


4.1.1. Planejamento e organizao da anlise

O planejamento a etapa mais importante de qualquer atividade laboratorial. Atravs dele possvel evitar a falta de insumos e materiais que comprometeriam o resultado de uma anlise. possvel, tambm, organizar melhor a execuo do trabalho, evitando situaes de risco para os operadores e danos aos equipamentos, materiais e instalaes sempre importante considerar que:
Cada material tem o seu lugar especfico. A bancada de trabalho deve estar livre de qualquer material que no

faa parte da tarefa.


A roupa de trabalho deve ser compatvel com o tipo de atividade que

est sendo executada.


preciso estar atento aos rudos a sua volta. Ao terminar a atividade, deve ser feita a limpeza das bancadas.
PLANEJAMENTO

Equipamentos

Vidraria

Solues/Reagentes

EPI/EPC

Instalaes

Pessoal

4.1.2. Estudo das propriedades da substncia de interesse (analito)

Ao analisar uma amostra, importante reconhecer suas propriedades fsico-qumicas. Uma propriedade fsico-qumica uma propriedade mensurvel que descreve qualquer caracterstica qualitativa ou quantitativa do analito.

236 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Dependendo da complexidade e do tipo de amostra, podem ser preconizadas medidas de uma ou mais propriedades do analito para anlise.
Propriedades qualitativas Identidade qumica Cor Sabor Odor Textura Propriedades quantitativas pH Viscosidade Densidade Condutividade Ponto de fuso e ebulio Absoro e emisso de radiao

4.1.3. Amostragem

A amostragem de uma determinada substncia para anlise no laboratrio deve ser efetuada de maneira a retirar uma poro homognea do todo, chamada amostra representativa. Para proceder uma amostragem correta, necessrio seguir trs passos fundamentais:
Identificao do todo Retirada da amostra representativa

Obteno da amostra laboratorial

Para a obteno de uma amostra representativa a partir de um material heterogneo, necessrio dividir esse material, visualmente, em partes. Retirando-se pores de cada parte, aleatoriamente, temos a coleta de uma amostra aleatria. A combinao da amostra aleatria constri a amostra representativa.

Fundamentos em qumica experimental | 237

Transporte da amostra O transporte da amostra representativa deve ser feito em recipientes apropriados, devidamente fechados e temperatura adequada de forma a preservar a integridade da amostra durante o seu fluxo. Deve haver Procedimentos Operacionais Padro (POP) relativos amostragem e que especifiquem as pessoas designadas a coletar amostras.
Fluxo da amostra no laboratrio

4.1.4. Preparo da amostra para anlise no laboratrio (amostra laboratorial)

Algumas amostras necessitam de preparo antes de sua anlise. Isso depender da complexidade da matriz a ser analisada. As tcnicas para obteno da amostra laboratorial incluem:
Triturao e dissoluo Decomposio

238 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Extrao (ver item 5.1.) Separao de misturas

Triturao e dissoluo Quando uma amostra slida, necessrio tritur-la e mistur-la para que a mesma se reduza a um p fino e homogneo. Para a triturao de amostras, usam-se gral (ou almofariz) e pistilo, feitos em porcelana ou gata. Aps a triturao, o slido geralmente passa por um processo de dissoluo. O solvente utilizado depender da natureza qumica do slido a ser dissolvido: para slidos inicos, a gua e os alcois so os solventes mais utilizados. Para outros slidos inorgnicos, geralmente so empregados cidos (Tabela 1). Tabela 1: cidos utilizados para dissoluo de amostras
CIDO COMPOSIO (% em massa e densidade) 37% 1,19g mL-1 CARACTERSTICAS

HCl

No oxidante. Dissoluo de metais, carbonatos, xidos, fosfatos e sulfetos. A composio constante em ebulio a 109C 20% de HCl. Forma cloretos volteis com As, Sb, Ge e Pb. Semelhante ao HCl na propriedade de solvente. A composio constante em ebulio a 124C de 48% de HBr. Bom solvente em sua temperatura de ebulio a 338C. Ataca metais. Desidrata e oxida compostos orgnicos.

HBr

48-65% 1,49g mL-1 95-98% 1,84g mL-1

H2SO4

Fundamentos em qumica experimental | 239

H3PO4

85%% 1,70g mL-1

Dissoluo a quente de xidos refratrios, insolveis em outros cidos. Torna-se anidro acima de 150 C. Desidrata a cido pirofosfrico, H2PO3-O-PO3H2, acima de 200 C e desidrata ainda a cido metafosfrico, [HPO3]n, acima de 300C. Dissoluo de silicatos, pela formao de SiF4 voltil. O excesso de produto removido pela adio de HClO4 ou H2SO4, com aquecimento. Forma fluoretos volteis com As, B, Ge, Se, Ta, Nb, Ti e Te. Forma precipitados com Ca. A composio constante em ebulio a 112C de 38% de HF. Oxidante poderoso e explosivo, a quente e concentrado. Dissoluo de matria orgnica que j tenha sido parcialmente oxidada por HNO3 a quente e levada prximo da secura, algumas vezes. A composio constante em ebulio a 203C de 72% de HClO4. Oxidante. Dissoluo de metais alcalinos, xidos bsicos e carbonatos, formando sais, como o nitrato de amnio. Reage explosivamente com cianetos, carbetos e psmetlicos.

HF

50% 1,16g mL-1

HClO4

60-72% 1,54-1,67g mL-1

HNO3

68% 1,51g mL-1

Fonte: Adaptado de Harris, 2001.

Tambm so comumente utilizadas misturas de cidos para a dissoluo de amostras. Uma das mais utilizadas a chamada gua Rgia, uma mistura de cido ntrico e cido clordrico concentrados (proporo 1 para 3). um lquido altamente corrosivo, de colorao amarela, e um dos poucos solventes que tem a capacidade de dissolver o ouro e a platina, da vem o

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nome dessa mistura de cidos: devido propriedade de dissolver os metais nobres, rgios. A mistura instvel e perde seu poder de solvente rapidamente. Assim, seu uso deve ser imediato aps o preparo. importante considerar os riscos de acidentes ao se manipular cidos concentrados, os quais tm alto poder corrosivo. O uso de luvas adequadas, culos de proteo e capela de segurana essencial para o trabalho com cidos. Decomposio A decomposio aplica-se a amostras de matria orgnica e efetuada, geralmente, na presena de solventes lquidos, como os cidos ntrico e sulfrico, ou gua oxigenada, utilizando-se a ao das microondas ou digesto, como no caso da determinao de nitrognio por Kjeldahl (ver item 4.1.5.1.4.). Separao de misturas As misturas so formadas pela unio de duas ou mais substncias, as quais no sofrem transformao, ou seja, ao serem separadas permanecem quimicamente inalteradas. Ao contrrio da substncia pura, que possui temperaturas ou pontos de fuso e ebulio constantes e bem definidos, no possvel determinar experimentalmente estas propriedades fsicas em uma mistura, com exceo das misturas azeotrpicas, que apresentam ponto de ebulio constante, e das misturas eutticas, onde o ponto de fuso constante. As misturas so classificadas como homogneas, as quais apresentam um s aspecto ou fase, e heterogneas, onde possvel identificar duas ou mais fases.

Fundamentos em qumica experimental | 241

Para a separao de misturas heterogneas, tm-se principalmente os seguintes mtodos: Filtrao: Processo que utiliza um filtro para efetuar a separao. Podemos proceder a filtrao simples, adaptando o filtro de papel dobrado e ajustado conforme a figura (a) ao funil ou a filtrao a vcuo (b), utilizada para misturas viscosas.

(a) Filtrao simples

(b) Filtrao a vcuo

Centrifugao: Processo que utiliza uma centrfuga que, por rotao em alta velocidade, separa misturas slido-lquido, onde o componente slido se deposita no fundo do recipiente. Muito utilizada para o preparo de amostras de sangue separa o soro (parte lquida) do plasma (parte slida).

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Decantao: Utiliza um funil prprio, o funil de decantao, para a separao de misturas onde um dos componentes possui maior densidade, depositando-se no fundo do recipiente.

Para separao de misturas homogneas, os mtodos mais utilizados so: cristalizao, destilao simples ou fracionada. Estes mtodos sero estudados em Qumica orgnica (item 5.1.).
4.1.5. Seleo do mtodo de anlise: clssico ou instrumental?

Os mtodos em Qumica analtica so divididos em clssicos e instrumentais. A seleo do mtodo de anlise no depende somente da natureza qumica da amostra. preciso levar em conta fatores como custo, equipamentos existentes no laboratrio, quantidade de amostra disponvel, demanda de anlises e pessoal tcnico envolvido. Nmero de replicatas da amostra: Depende da quantidade de amostra disponvel e da tcnica analtica empregada. importante trabalhar com replicatas, de forma a obter um resultado final confivel, pela mdia das determinaes.
4.1.5.1. Mtodos clssicos: gravimetria e volumetria

4.1.5.1.1. Gravimetria O princpio da anlise gravimtrica ou gravimetria a determinao da concentrao de um ou mais analitos, de composio qumica definida, em uma amostra, atravs da pesagem. Antes de ser pesada, a substncia a ser

Fundamentos em qumica experimental | 243

analisada deve ser separada da amostra e, para isso, podem ser aplicadas reaes de precipitao ou combusto. Gravimetria por precipitao Nesta anlise, adicionado um reagente amostra, capaz de formar com o analito de interesse um composto insolvel que se deposita (precipita) no fundo do recipiente. Esse reagente deve ser seletivo, ou seja, especfico para o elemento ou substncia que se deseja separar.
Etapas da anlise gravimtrica por precipitao

244 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Exemplos de alguns metais determinados por gravimetria


Metal Reagente precipitante HCl/HNO3 NH4Cl/NH3 H2C2O4 NH4Cl/NH3 Precipitado formado* AgCl Al (OH)3 CaC2O4 Fe (OH)3 Temperatura de aquecimento (C) 400 1.200 1.000 850 Precipitado final para pesagem AgCl Al2O3 CaO Fe2O3 Interferentes mais comuns Hg Cr, Fe, Ni Metais(exceo alcalinos) e Mg Metais tetravalentes e Al, Ti, Cr Pd

Ag Al Ca Fe

Ni

DMG (dimetil- Ni (DMG)2 glioxima) / NH3

120

Ni (DMG)2

O precipitado formado deve ter as seguintes caractersticas:


Composio qumica definida (no sofrer contaminaes). No ser voltil, higroscpico ou solvel. Ter aspecto e quantidade adequados para pesagem na balana

analtica.
Ser formado lentamente, com controle de parmetros da reao de

precipitao como: velocidade, temperatura e pH, de forma a obter um slido com boas condies para filtrao simples ou a vcuo.
Passar por um processo de envelhecimento ou digesto, que con-

siste em uma srie de modificaes estruturais, visando ao seu aperfeioamento.


Ser aquecido a altas temperaturas (geralmente em mufla) para obten-

o do produto final estvel a ser pesado.

Fundamentos em qumica experimental | 245

Um exemplo da aplicao da gravimetria por precipitao a determinao de clcio em guas minerais. O clcio precipitado como oxalato, CaC2O4, pela adio de cido oxlico: Ca2+ + H2C2O4 CaC2O4 + 2 H+ Um cadinho deve ser tarado, at peso constante. O procedimento consiste em levar o cadinho mufla, temperatura de 1.000 C, por uma hora. Retira-se o cadinho, com o auxlio de luvas e uma pina, e resfria-se em dessecador. Pesa-se. Esse procedimento dever ser repetido at que a massa no apresente variao maior que 1%. O precipitado de CaC2O4, insolvel, coletado em papel de filtro, seco, transferido para o cadinho previamente tarado, e aquecido ao rubro temperatura de 1.000 C, sendo convertido em xido de clcio, CaO, pela ao do oxignio do ar: CaC2O4 + 2 H+ + O2 CaO + 2 CO2 + H2O Aps a calcinao, resfria-se o precipitado, em dessecador, e pesa-se, at peso constante. Sempre se deve trabalhar com pelo menos uma duplicata da amostra. Simulando a anlise de uma amostra de 200 mL de gua, e considerando que a massa do cadinho tarado, at peso constante, de 25,0000 g, o clculo da concentrao de clcio na amostra seria: Clculo da massa de CaO:
(massa do cadinho + massa do precipitado) massa do cadinho = massa de CaO 25,1100 - 25,0000 = 0,1100 g

246 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Clculo da massa de Ca2+ na amostra aps aquecimento ao rubro (calcinao):


1 mol CaO 1 mol Ca2+ 56,08 g/mol CaO 40,08 g/mol Ca2+ 0,1100 g CaO m Ca2+ m Ca2+ = 0,0786 g Massa de clcio em 200 mL de amostra de gua

Para expresso do resultado em termos percentuais, basta calcular a massa de Ca2+ para 100 mL de gua: m Ca2+ /100 mL = 0,03931 g 0,03931%

4.1.5.1.2. Determinao do teor de cinzas

As cinzas constituem a frao mineral de amostras e contm, em geral, clcio, magnsio, ferro, fsforo, chumbo, sdio e outros componentes. O perfil das cinzas comumente considerado como parmetro geral de qualidade e frequentemente utilizado como critrio na especificao de amostras diversas. Para determinar o teor de cinzas, utilizam-se cadinhos previamente incinerados e tarados, como descrito no exemplo da determinao de clcio. Pesa-se 3 g da amostra, sempre trabalhando no mnimo em duplicata. Leva-se mufla, temperatura de 600C, at a eliminao completa do carvo. As cinzas devero ficar brancas ou ligeiramente acinzentadas, caso contrrio, esfriar, adicionar 0,5 mL de gua, secar e incinerar novamente. Deixa-se esfriar em estufa por vinte minutos, transferindo-se para um dessecador por mais vinte minutos. Finalmente, os cadinhos contendo as cinzas devem ser pesados, at a obteno de peso constante. O clculo do teor de cinzas feito pela equao:

Fundamentos em qumica experimental | 247

Teor de cinzas (%) = mC .100 mA Onde: mC= massa das cinzas (g) mA = massa da amostra (g) Cinzas carbonatadas e sulfatadas Algumas amostras contendo sais de metais alcalinos, que retm propores variveis de dixido de carbono nas condies da incinerao, devero ser tratadas, inicialmente, com soluo de carbonato de amnio (cinzas carbonatadas) ou cido sulfrico diludo (cinzas sulfatadas) e, aps secagem do excesso do reagente, incineradas e pesadas. A determinao de cinzas insolveis em cido, geralmente utilizando cido clordrico diludo a 10% (m/m), oferece uma avaliao do teor de slica existente na amostra.

Cuidados com o uso da balana analtica nas anlises gravimtricas O corao da gravimetria a utilizao da balana analtica para a pesagem de amostras. Qualquer erro nesse procedimento acarretar em um resultado incorreto. As balanas analticas modernas trabalham com o emprego de circuitos eletrnicos que permitem medies precisas e, mesmo que seu aperfeioamento j no exija o uso de uma sala especial, preciso levar em considerao as interaes do equipamento com o ambiente. A primeira coisa a se observar a localizao da balana analtica: ela deve estar sobre uma bancada fixa, prova de impactos ou vibraes, e em sala fechada onde no existam intensas correntes de ar.

248 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

O nivelamento da balana deve ser checado pela observao da bolha de nvel: caso no esteja centralizada, faz-lo pela regulagem dos ps ajustveis. As janelas de vidro da balana devem permanecer fechadas durante a leitura da massa para evitar variaes devido entrada de correntes de ar. Nunca se devem pesar amostras fora da temperatura ambiente: amostras aquecidas devem ser resfriadas no interior do dessecador e, no caso de amostras resfriadas, deve-se esperar at que a mesma atinja o equilbrio trmico com o ambiente, evitando assim erros pela conveco de ar. Ao manipular o recipiente usado para a pesagem, tomar o cuidado de no toc-lo diretamente com as mos, sempre usando uma toalha de papel ou uma gaze. A gordura e as impresses digitais influenciam na leitura da massa. A calibrao da balana deve estar dentro do prazo de validade estabelecido pelo fabricante. As balanas eletrnicas modernas possuem a opo de autocalibrao, pela presena de pesos internos padres de calibrao. Caso a balana necessite de calibrao, pelo uso de padres de peso externos, essencial que isso seja feito no prprio local onde a balana est instalada, evitando variaes de condies ambientais, principalmente da acelerao gravitacional. Antes de anotar o resultado da leitura da massa, deve-se aguardar a estabilizao do valor que aparece no mostrador digital. Flutuaes constantes e tendenciosas do valor podem demonstrar a ocorrncia de algum problema na pesagem. Finalmente, valioso proceder a limpeza da balana aps o seu uso, mantendo-a livre de substncias contaminantes que possam danific-la, usando um pincel limpo e macio e, se necessrio, aplicando um pano limpo embebido em acetona, sem no entanto fazer movimentos bruscos que possam deslocar o prato da balana.

Fundamentos em qumica experimental | 249

4.1.5.1.3. Volumetria O princpio da anlise volumtrica ou volumetria a determinao da concentrao de um ou mais analitos em uma amostra, atravs da medio do volume, utilizando a tcnica de titulao. Existem diferentes classificaes para a titulao, de acordo com o tipo de reao qumica envolvida:
Titulao cido-base (a mais utilizada em laboratrio) Titulao de oxirreduo (ou redox) Titulao complexomtrica Titulao de precipitao

Titulao cido-base: o exemplo do preparo e titulao da soluo padro de HCl 0,1 mol L-1 O cido clordrico, HCl, P.A. no uma substncia padro. Sua concentrao funo da massa especfica, igual a 1,19 g mL -1, e sofre variaes com o tempo. A soluo de HCl na concentrao de 0,1 mol L -1 muito utilizada no laboratrio para reaes qumicas diversas e preparo de outras solues. O preparo da soluo 0,1 mol L-1 se d pela diluio do HCl concentrado. Para preparar, por exemplo, 1 L, deve ser feita a seguinte sequncia de clculos: Dados: Concentrao do HCl: 37% (m/m); Massa especfica: 1,19 g mL-1; Massa molar: 36,5 g/mol 1 Clculo da massa de HCl em 0,1 mol: 0,1 mol HCl = massa HCl / Massa molar HCl massa HCl = 0,1 . 36,5 = 3,65 g

250 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

2 Correo da massa pela concentrao do HCl: 37 g HCl 100 g soluo 3,65 g HCl m m = 9,86 g

3 Converso da massa em volume: 1,19 g HCl 1 mL 9,86 g HCl v v = 8,29 mL

Deve-se transferir 8,29 mL de HCl concentrado para balo volumtrico com capacidade de 1.000 mL, contendo 500 mL de gua (completar o volume at o trao de aferio). Homogeneizar. Nunca derramar a gua sobre o cido, sempre o cido sobre a gua! Para a titulao da soluo preparada, utiliza-se brax, Na 2B4O7 . 10 H2O, como padro primrio. Transferir de 0,4 a 0,5 g de brax, pesados exatamente, para erlenmeyer (trabalhar em triplicata), dissolvendo o padro em 50 mL de gua destilada. Adicionar algumas gotas do indicador metilorange. A bureta deve ser rinsada pelo menos duas vezes com a soluo de HCl a ser titulada, antes de ser preenchida totalmente e zerada. A soluo de HCl adicionada ao padro contido no erlenmeyer, at que ocorra a viragem de cor do indicador (do amarelo ao laranja). O volume gasto deve ser anotado, com preciso de 0,02 mL, e os valores devero ser concordantes, caso contrrio, repetir a titulao com mais alquotas. Na2B4O7 . 10 H2O + 2 HCl 2 NaCl + 4 H3BO3 + 5 H2O

Fundamentos em qumica experimental | 251

O erro de titulao deve ser calculado pela realizao do ensaio em branco, calculando-se o volume real de titulante gasto: V real de titulante = V gasto de titulante V ensaio em branco Clculo Final: Concentrao = massa do brax V de HCl (mL). 0,1907 Obs.: A partir da concentrao obtida, calcular o fator de correo (conforme item 3.3.2.).

4.1.5.1.4. Determinao de nitrognio total pelo mtodo de Kjeldahl O mtodo desenvolvido por Kjeldahl, em 1883, vem sendo, desde ento, adotado por laboratrios em todo o mundo como referncia para a determinao de nitrognio em amostras diversas. Embora tenham sido desenvolvidos aparatos instrumentais, incorporando avanos para a execuo da tcnica originalmente praticada com vidrarias adequadas para destilao, seu princpio foi mantido ao longo de mais de um sculo.

Aparato original

252 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

O princpio do mtodo de Kjeldahl consiste em trs etapas: digesto da amostra, destilao e titulao. 1. Digesto: O nitrognio presente em uma amostra encontra-se combinado a outros elementos, como carbono e hidrognio. A digesto a converso de todo o nitrognio orgnico presente na amostra em ons amnio, NH4+. Isso possvel tratando a amostra em cido sulfrico concentrado, a altas temperaturas. O processo de digesto da amostra acelerado pela adio de pequena quantidade de um catalisador, que contm geralmente selnio, cobre ou titnio em sua composio:
N, C, H H2SO4
(catalisador)

NH4+ + CO2 + H2O

Para proceder a digesto da amostra, deve-se pesar uma quantidade, com preciso, entre 0,1 e 0,5 g, transferindo-a quantitativamente para o balo de Kjeldahl. Adiciona-se 5 ml de H2SO4 e pequena quantidade do catalisador. Os bales so colocados no digestor e a temperatura ajustada a 50C aps uma hora, aumentar lentamente at aproximadamente 300 C. A digesto deve ser feita sempre em duplicata e com a realizao do ensaio em branco. Todo o procedimento deve ser executado no interior da capela e com o uso dos EPI`s adequados. A digesto termina quando o lquido contendo a amostra ficar lmpido. 2. Destilao: Aps a obteno dos ons NH4+ realizada a destilao. Adiciona-se uma base forte, 10 mL de NaOH a 50% (m/v), para a converso desses ons em gs amnia: NH4+ + OH- NH3 + H2O

Fundamentos em qumica experimental | 253

O gs NH3 liberado e destilado coletado em frasco contendo 10 mL de soluo de cido brico, H3BO3, a 2% (m/v) e algumas gotas de indicador misto. Sempre se deve usar o EPI adequado para o procedimento, que ser realizado de acordo com o aparato disponvel no laboratrio. 3. Titulao: O destilado recolhido em cido brico deve ser titulado, utilizando soluo padro de cido clordrico 0,1 mol L-1 como soluo titulante, at a viragem do indicador. Clculos: % Nitrognio Total = V. C . f . 0,014 . 100 m Onde: V = volume de soluo padro de HCl 0,1 mol L-1 gasto na titulao (mL) C = concentrao em quantidade de matria do HCl (0,1 mol L-1) f = fator de correo da soluo padro de HCl 0,1 mol L-1 m = massa da amostra (g) possvel ainda estimar o valor percentual de protena na amostra, multiplicando o valor do nitrognio total obtido por um fator de converso, igual a 6,25: % Protena= % Nitrognio total . 6,25

Vantagens e limitaes dos mtodos clssicos: Os mtodos clssicos oferecem uma relativa preciso para anlise de substncias em amostras, da ordem de mg mL-1, ao mesmo tempo que necessitam de aparato simples para sua execuo. Isso traz uma diminuio no custo da anlise, j que vidrarias, fornos e balanas so materiais/equipamen-

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tos bsicos em um laboratrio de Qumica. Porm, so necessrios maiores volumes de amostra, o que nem sempre est disponvel. Outra desvantagem o maior tempo de durao das anlises. A presena de substncias interferentes na amostra outro ponto crtico. A eliminao destes interferentes implica na introduo de mais etapas na anlise, o que aumenta ainda mais o tempo. Outro problema a produo de resduos txicos em algumas reaes, bem como o manejo e descarte desses resduos, o que demanda a substituio da tcnica por uma outra mais segura. Erros na manipulao de vidrarias, preparo de solues e pesagem tm grande impacto no resultado final da anlise. importante seguir os cuidados recomendados ao optar por esses mtodos. Cuidados com a vidraria Em Qumica analtica, qualquer perda da amostra em anlise crtica. Vimos os cuidados com a pesagem, quase sempre a etapa inicial de um processo de anlise, e a que requer maior preciso. Os cuidados com a limpeza do material utilizado, especialmente a vidraria, tambm so imprescindveis para evitar perdas de amostra, por contaminao com outras substncias. A limpeza da vidraria deve ser feita inicialmente com gua corrente, para retirada dos contaminantes mais solveis. Aps, deve-se mergulhar a vidraria em uma soluo de detergente neutro, especfico para materiais de laboratrio, na concentrao e no tempo recomendados pelo fabricante. Com o auxlio de uma escova adequada para cada tipo de vidraria, proceder a limpeza mecnica, enxaguando em

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gua corrente at a remoo completa do detergente. O enxgue final sempre feito com gua destilada ou deionizada. Vidrarias de maior preciso no podem ser levadas estufa para secagem, pois a temperatura afeta a calibrao das mesmas. J as demais podem ser secas em estufa, a temperaturas de aproximadamente 60 a 90C. Sempre se deve guardar as vidrarias limpas e secas. Calibrao de vidrarias de preciso Para maior exatido dos resultados em Qumica analtica, a calibrao de vidrarias volumtricas deve ser feita, a fim de corrigir o volume que realmente est sendo medido. Utiliza-se a pesagem de volumes de gua, de acordo com o volume de aferio do material. Para tanto, importante anotar a temperatura, fazendo a correo do valor da massa especfica, convertendo massa em volume. Isso necessrio, pois geralmente as vidrarias so calibradas temperatura de 20C, bem abaixo de nossa temperatura ambiente. Esse valor, corrigido, dever ser considerado no clculo final para a obteno de resultados de anlise. Um exemplo seria o procedimento de calibrao de uma pipeta volumtrica de 10 mL:
preciso colocar o recipiente para pesagem, de preferncia um pesa-

filtro, na balana analtica, e tar-lo (com a tampa).


A pipeta a ser calibrada deve ser preenchida com gua destilada, at

um pouco acima do trao de aferio. Seca-se a ponta da pipeta, para remover qualquer excesso de gua, e zera-se, respeitando a posio do menisco e evitando o erro de paralaxe.
Retira-se ento a tampa do pesa-filtro, transferindo-se o volume de 10

mL de gua para o interior do mesmo, tampando-o em seguida, evitando assim qualquer perda de gua por evaporao.

256 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Anota-se ento a massa de gua obtida e utiliza-se a equao seguinte para converso dessa massa em volume (Tabela 2):
Volume real = m. v

Onde: m = massa de gua v = volume de 1 g de gua tabelado

Tabela 2: Massa especfica da gua em diferentes temperaturas


Temperatura (C) Massa especfica da gua (g mL-1) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 0,9997026 0,9996084 0,9995004 0,9993801 0,9992474 0,9991026 0,9989460 0,9987779 0,9985986 0,9984082 0,9982071 0,9979955 Volume de 1g de gua (mL) 1,0014 1,0015 1,0016 1,0017 1,0018 1,0020 1,0021 1,0023 1,0025 1,0027 1,0029 1,0031

Fundamentos em qumica experimental | 257

22 23 24 25 26 27 28 29 30
Fonte: Harris, 2001.

0,9977735 0,9975415 0,9972995 0,9970479 0,9967867 0,9965162 0,9962365 0,9959478 0,9956502

1,00333 1,0035 1,0038 1,0040 1,0043 1,0046 1,0048 1,0051 1,0054

4.1.5.2. Mtodos instrumentais

A anlise instrumental o estudo dos mtodos que utilizam equipamentos para analisar os componentes de uma amostra. Embora o mtodo instrumental aumente o custo de uma anlise pelo uso de equipamentos sofisticados, que demandam aparatos eletrnicos mais complexos, sua utilizao vem sendo cada vez mais difundida nos laboratrios, j que estes conferem vantagens diante dos mtodos clssicos, como maior preciso s anlises bem como a possibilidade de determinar concentraes cada vez menores de analitos, simultaneamente e em menor tempo. A seguir sero apresentados os mtodos instrumentais mais utilizados nas anlises qumicas realizadas tanto no campo da pesquisa e desenvolvimento, como no controle de qualidade de produtos diversos.

258 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

4.1.5.2.1. Potenciometria

A potenciometria utiliza eletrodos (de referncia e indicador) para medio de potenciais eltricos de espcies qumicas em uma amostra, relacionando-os com a sua concentrao. Os potenciais so gerados a partir de reaes de oxirreduo ou processos de migrao seletiva de ons. Em laboratrio, a maior aplicao desta tcnica na medio do pH de amostras. Medio do pH O pH expresso como a relao logartmica da concentrao de ons H em uma amostra.
+

pH = - log [H+]

Escala de pH
0 cido 7 Neutro Bsico 14

Utiliza-se para a medio do pH o equipamento chamado potencimetro, ligado a um eletrodo on seletivo de vidro (especfico para ons H+). Ele combinado a um eletrodo de referncia, de prata/ cloreto de prata. A parte do eletrodo sensvel aos ons H+ a fina membrana de vidro, em formato de bulbo, na parte inferior do eletrodo (por esse motivo, deve-se manter essa parte do eletrodo sempre hidratada). Na prtica, a variao de potencial do eletrodo corresponde concentrao de ons H+ na amostra. Antes de efetuar a leitura, o equipamen-

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to deve ser calibrado pelo uso de solues-tampo, de pH conhecido (geralmente nos valores 7,0 e 4,0, consecutivamente). O eletrodo deve ser lavado com gua destilada a cada troca de soluo e secado delicadamente, com papel de boa qualidade.

4.1.5.2.2. Fundamentos de espectrofotometria

A espectrofotometria um mtodo instrumental que utiliza a luz para medir as concentraes de substncias qumicas. Para entendermos como isso acontece, preciso, em primeiro lugar, compreender o que a luz e como ela se comporta. A luz uma onda eletromagntica, constituda por partculas de energia, chamadas ftons, que se propaga no vcuo a uma velocidade igual a 3.108 m s-1. A energia da luz proporcional ao seu comprimento de onda (l) e frequncia (u) dessas ondas. O fsico Max Planck, um dos fundadores da teoria quntica, determinou essa constante de proporcionalidade, chamada constante de Planck (h):
E=hu

(a) (b)

l=c v

Propagao da luz.: (a) l maior, menor frequncia e energia.; (b) l menor, maior frequncia e energia.

As intensidades de luz, em funo dos diferentes comprimentos de onda ou frequncias, do origem ao que chamamos de espectro da luz, ou

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espectro eletromagntico.

Observe que a luz que conseguimos enxergar apenas uma pequena faixa de comprimentos de onda do espectro eletromagntico. Porm, h outras formas de energia que, embora no possamos ver, esto presentes em nosso dia a dia, como os raios ultravioleta do sol, o calor dos corpos fornecido pelo infravermelho, as microondas que utilizamos para aquecer alimentos, e os raios X, que tm poder de penetrao em nossos corpos suficiente para fornecer imagens internas. No laboratrio, a radiao ultravioleta uma das mais aplicadas, j que sua grande energia faz com que ela atue como bactericida, sendo utilizada na esterilizao de materiais. Mas, afinal, o que ocorre ao incidirmos luz em uma substncia? A energia dessa luz absorvida pelas molculas que formam a substncia, aumentando a energia das mesmas. O efeito dessa absoro depender do tipo de radiao incidente:
RADIAO Microondas Infravermelho Ultravioleta/Visvel Raios X EFEITO NAS MOLCULAS Rotao Vibrao Promoo dos eltrons a nveis mais energticos Rompimento de ligaes/Ionizao

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Lei de Beer-Lambert Ao incidirmos luz sobre uma amostra, parte dessa energia absorvida e a outra transmitida. possvel medir essa absoro de luz por determinados analitos presentes na amostra e relacion-la concentrao destes, atravs de uma lei fundamental em qumica analtica: a Lei de Beer-Lambert: A=ebc Onde: A = absorvncia (adimensional) e = absortividade molar (L mol-1 cm-1) b = caminho ptico (cm) c = concentrao do analito na amostra (mol L-1) Para entendermos como essa lei acontece na prtica, precisamos conhecer o caminho percorrido pela luz, desde a fonte da radiao at a passagem pela amostra e deteco:

A fonte de luz depender da radiao que se deseja incidir e da tcnica instrumental: Visvel lmpada halgena de quartzo (como a dos faris de automveis) ou de tungstnio.

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Ultravioleta lmpada de arco deutrio. Infravermelha laser. Absoro atmica lmpada de catodo oco e lmpada de descarga sem eletrodos. A luz atinge o monocromador (prisma, filtro ou rede de disperso), que tem a propriedade de selecionar apenas um valor de comprimento de onda. A radiao torna-se monocromtica (uma s cor). A radiao monocromtica (P0) incide sobre a amostra e absorvida por determinados constituintes desta (absorvncia). Ela passa atravs da amostra, percorrendo o caminho ptico, b. A radiao no absorvida (P) transmitida (transmitncia) e medida pelo detector, que tem a capacidade de converter a energia recebida em sinal eltrico. Esse sinal transformado em um valor de absorvncia, que pode ser lido na tela do equipamento. Relao entre absorvncia e transmitncia A transmitncia a quantidade de luz no absorvida pela amostra dada pela equao: T = P / P0 O percentual de transmitncia (%T ) = 100 T A absorvncia dada por: A = log10 P0 / P Relacionando transmitncia e absorvncia, temos ento:

A = log10 1 / T A = log10 100 / %T A = 2 - l o g10 %T

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A relao linear entre a concentrao e a absorvncia simples e direta. Assim correto expressar a Lei de Beer-Lambert usando a absorvncia, A, como uma medida da absoro da amostra, em vez do %T. importante destacar que a Lei de Beer-Lambert aplica-se a solues diludas. A relao linear entre a concentrao e a absorvncia afetada quando a amostra est muito concentrada, pois as molculas de soluto esto muito prximas e sua absortividade molar, capacidade de absorver a radiao, afetada por essa interao. Espectrofotometria UV/Visvel Utiliza radiao na faixa do UV/Visvel para determinao de analitos em uma amostra. Deve-se comparar a amostra a uma referncia negativa, ou ensaio em branco, que contm todos os reagentes menos a substncia de interesse, e a padres da substncia que se quer analisar, em concentraes conhecidas. Esses padres devem ser preparados utilizando reagentes de alta pureza. A curva de calibrao, ou curva padro, consiste num grfico onde os valores de diferentes concentraes de padro so colocados, de acordo com os valores de absorvncia lidos para cada um deles. Um exemplo da aplicao desta tcnica a determinao da concentrao de protena em amostras pelo mtodo de biureto: ocorre a formao de um complexo colorido (violeta) pela reao das protenas com o reagente de biureto ons cobre (II) em meio bsico. A absorvncia de amostras e padres (concentraes em mg/mL) medida a um l = 555 nm.

264 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Erros em anlises espectrofotomtricas UV/Visvel: como evit-los? As anlises espectrofotomtricas exigem cuidados que vo desde o preparo das solues a serem utilizadas at a leitura de absorvncia pelo detector. As principais fontes de erros instrumentais em espectrofotometria esto relacionadas seleo do comprimento de onda pelo monocromador, concentrao da soluo da amostra e posicionamento do compartimento de amostra. Todos esses fatores causam a disperso da luz, acarretando erros na deteco e, consequentemente, na leitura dos valores de absorvncia. No preparo das solues do ensaio em branco, padres e amostras deve-se evitar a presena de partculas estranhas em suspenso, filtrando as solues caso seja necessrio. Essas partculas desviam o feixe de luz, prejudicando as leituras de absorvncia. Uma das principais fontes de erros est na seleo do comprimento de onda de trabalho. preciso saber o comprimento de onda de absoro mxima para determinada substncia presente na amostra, de forma a conseguir a mxima sensibilidade nessa anlise, evitando possveis interferncias. O monocromador deve ter a capacidade de selecionar o valor de comprimento de onda que se quer trabalhar, sem deixar que ele disperse. Porm, a largura da fenda para a sada da radiao selecionada deve ser a maior possvel, possibilitando a chegada de luz ao detector. Quando o detector recebe pouca luz, isto resulta em uma menor relao sinal-rudo, reduzindo a preciso da medida da absorvncia. Em geral, os equipamentos dispem de dois monocromadores em srie, que funcionam como filtros de comprimentos de onda, impedindo a passagem de radiaes no desejadas para a amostra. A eficincia seletiva do monocromador tambm pode ser checada, atravs de padres de calibrao com valores de absorvncia conhecidos, para determinados comprimentos de onda. Esses padres so em geral fornecidos pelo prprio fabricante do instrumental.

Fundamentos em qumica experimental | 265

Uma outra fonte de erros est na faixa de leitura da absorvncia. Valores de absorvncia no devem ser prximos de zero, tampouco acima de 1,0. A faixa ideal de trabalho, a qual garante a relao linear entre absorvncia e concentrao, de acordo com a Lei de Beer-Lambert, de 0,1 a 1,0. Abaixo desta faixa, a absorvncia da amostra se aproxima do ensaio em branco. Acima, a quantidade de luz que chega ao detector muito pequena, j que h um maior nmero de molculas da amostra absorvendo a radiao. Em ambas as situaes, de amostras muito diludas ou muito concentradas, h um aumento na incerteza do valor medido, gerando perda de preciso na anlise. Tambm se destaca como fonte de erros o posicionamento correto do compartimento da amostra e a colocao e manipulao da cubeta. Deve-se tomar o cuidado de no tocar a superfcie da cubeta por onde passa o feixe de luz, manipulando-a com o auxlio de papel de boa qualidade, que no deixe resduos. Isso evita marcas de impresses digitais, as quais desviam a luz. Pelo mesmo motivo, tambm se deve observar o possvel escorrimento de material pelas paredes externas da cubeta, limpando-as. Ao retirar e recolocar a cubeta, deve-se evitar movimentos bruscos, que possam vir a mover o suporte de alguma forma. Tambm crtico o fechamento do equipamento: caso o compartimento da amostra no esteja bem fechado, pode ocorrer a entrada de luz de fora do equipamento, introduzindo disperso da luz. O perfeito fechamento deve tambm ser feito a fim de evitar a entrada de poeira. Espectrofotometria de absoro atmica de chama A espectrofotometria de absoro atmica de chama o mtodo de anlise mais utilizado para determinao de metais em amostras. O princpio a absoro de radiao pelo analito, na forma atmica gasosa, obtida pela introduo da amostra, na forma de aerossol (nebulizao), em uma chama de ar/acetileno ou acetileno-xido nitroso (temperaturas de 2.200 C e 3.000C,

266 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

respectivamente). A absoro atmica uma medida da populao de tomos do elemento presente na chama e, portanto, da concentrao do mesmo na amostra, segundo a Lei de Beer-Lambert.

Espectrofotometria de infravermelho Este tipo de espectrofotometria (tambm chamado espectroscopia de infravermelho) muito utilizado para a identificao de amostras, especialmente de grupos funcionais orgnicos. A tcnica consiste na incidncia de radiao infravermelha, que provoca vibraes nas molculas do analito de interesse. Cada ligao qumica vibra em uma frequncia especfica (nveis vibracionais), dependendo dos tipos de tomos ligados e geometria da molcula, gerando um espectro caracterstico da substncia. Na figura ao lado, podemos observar as regies espectrais caractersticas de alguns grupos funcionais.

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4.1.5.2.3. Fotoluminescncia

A fotoluminescncia a radiao eletromagntica emitida quando espcies qumicas que foram previamente excitadas por ftons retornam para nveis de menor energia (em geral, o estado fundamental), processo que envolve eltrons de valncia (desativao radiativa). No caso das molculas, a fotoluminescncia formalmente dividida em fluorescncia e fosforescncia e as tcnicas analticas que se baseiam respectivamente na medida destes parmetros so a fluorimetria e a fosforimetria. A intensidade de radiao emitida medida e relacionada concentrao do analito de interesse na amostra, segundo a Lei de Beer-Lambert. Experimentalmente, a fosforescncia pode ser isolada da fluorescncia com o uso de dispositivos seletivos: rejeita-se a luminescncia de curto tempo de vida (fluorescncia) permitindo a deteco da luminescncia de longa durao (fosforescncia). Fatores que afetam a luminescncia Para que ocorra a luminescncia, uma molcula precisa ter estrutura apropriada e estar em um meio que favorea a desativao radiativa. Embora seja difcil prever teoricamente se uma molcula exibir luminescncia sem o prvio conhecimento da diferena de energia relativa entre os estados excitado e fundamental, possvel, de um modo geral, observar alguns requisitos:
Molculas relativamente rgidas e ricas em eltrons p so potencial-

mente luminescentes.
A fluorescncia um fenmeno luminescente mais comum que a

fosforescncia, sendo observvel temperatura ambiente e diretamente em solues lquidas, caracterizando um procedimento experimental mais simples.
A fosforescncia, que um processo com tempo de vida mais longo,

necessita de condies especiais para ser observada. Estruturas moleculares rgidas naturalmente ou com o uso de algum artifcio experimental so

268 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

fundamentais. Assim, o uso de meios slidos ou organizados (micelas, por exemplo) e a ausncia do contato com o oxignio tm sido de grande utilidade para permitir a observao da fosforescncia.
A presena de grupos substituintes na molcula tambm fator impor-

tante, pois afeta a intensidade e o tipo de luminescncia. A presena de grupos hidroxi (-OH), cianeto (-CN) e sulfnico (-SO3H), por exemplo, tm tendncia a amplificar a fluorescncia. J grupos cetnicos (-C=O) carboxlicos (-COOH) e halognios (-Cl, -F) favorecem a fosforescncia.
Outros fatores, tais como temperatura, pH do meio, solvente e

presena de outras espcies, tambm tm profundo efeito nas caractersticas luminescentes, e uma substncia, afetando no somente as velocidades dos processos luminescentes e dos processos no radiativos, mas tambm a natureza e a energia relativa do estado excitado de menor energia. A luminescncia pode ser induzida em molculas naturalmente no luminescentes atravs de reaes de derivao, que modificam a estrutura das molculas e consequentemente suas propriedades fsicoqumicas, obtendo-se, assim, um derivado luminescente. Essas derivaes podem ser feitas com agentes oxidantes e redutores, derivao com agentes fluorognicos ou fosfognicos e aps reaes cido-base. Existe tambm a possibilidade da formao de quelatos com ons de terras raras e derivao da molcula por meio de reaes fotoqumicas (radiao UV). A figura ao lado mostra (a) a fluorescncia do antibitico eritromicina, observada em funo da concentrao

Fundamentos em qumica experimental | 269

do meio cido, e (b) o espectro de excitao/emisso do mesmo antibitico aps derivao fotoqumica com irradiao UV e aquecimento. 4.1.5.2.4. Cromatografia O nome cromatografia vem do grego chroma = cor, e grafein = grafia. uma tcnica de separao baseada nas propriedades adsortivas ou de partio dos componentes de uma amostra em um sistema cromatogrfico. Os diferentes componentes so carreados por uma fase mvel atravs de uma fase estacionria, envolvendo interaes (adsoro superficial, solubilidade relativa, carga eltrica, hidrofobicidade) entre um ou mais solutos e as duas fases. Os componentes so detectados, gerando um cromatograma, e quantificados. Termos importantes em cromatografia: Fase mvel: o fluido que se move atravs da coluna cromatogrfica (solvente, no qual a amostra est dissolvida). O solvente e a amostra fluem juntos atravs da fase estacionria. Fase estacionria: o material adsorvente, slido ou lquido, que no se move (material pelo qual os componentes da amostra a serem separados apresentam diferentes graus de interao) e est empacotado em uma coluna. Soluto: a substncia em soluo que se deseja separar.

270 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Tipos de cromatografia Cromatografia gasosa: a fase mvel geralmente um gs inerte (hlio, por exemplo). A fase estacionria um adsorvente ou lquido distribudo na superfcie de um suporte poroso inerte (esquema A). Cromatografia lquida: a fase mvel um lquido de baixa viscosidade que flui atravs de um leito de fase estacionria. Se este leito for um adsorvente slido atravs do qual, a uma alta presso, se faz passar a fase mvel e a amostra, temos a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE); se a fase estacionria for um slido inico, temos a cromatografia de troca inica (CTI); se a fase estacionria for um slido poroso fazendo-se a separao em funo do tamanho molecular, temos a cromatografia de excluso por tamanho (CET) um caso particular deste tipo de cromatografia a usada, por exemplo, no estudo de polmeros, em que a fase estacionria um gel, chamando-se por isso cromatografia de permeao de gel ou GPC (esquema B). Cromatografia em camada fina: a fase mvel um lquido de baixa viscosidade que elui atravs da fase estacionria, por capilaridade mais vulgarmente de baixo para cima. A fase estacionria um slido (slica ou alumina) depositado em camada fina e uniforme sobre um suporte slido inerte.

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4.1.5.2.5. Anlise de umidade residual pelo mtodo de Karl Fischer titulao coulomtrica

A titulao pelo mtodo de Karl Fischer a tcnica mais utilizada para a determinao da umidade residual e aplica-se anlise de frmacos, alimentos, fluidos biolgicos, derivados do petrleo, matrias-primas, amostras ambientais e outros produtos diversos. Algumas vantagens do mtodo coulomtrico so a preciso, com a possibilidade de determinao de quantidades de gua da ordem de 1 mg mL-1, a necessidade de um pequeno volume de amostra e a reduo no tempo de anlise. O princpio desse mtodo baseia-se na reao entre a gua da amostra e o iodo produzido na clula de titulao, na presena da soluo de Karl Fischer, que contm dixido de enxofre, (SO2), lcool (ROH) e uma base (B) em sua composio: B I2 + B SO2 + B + H2O 2 BH+I- + BSO3 BSO3 + ROH BH+ RSO3O equipamento utilizado possui uma clula de titulao com dois eletrodos: um gerador de iodo, I2, que consumido rapidamente pela reao com a gua presente na amostra, e um eletrodo de referncia de platina, que funciona como detector do ponto final de titulao, de acordo com o esquema a seguir.

272 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

A gerao de iodo ocorre pela oxidao do I- presente na soluo de Karl Fischer a I2 (catodo). A clula principal contm a soluo de Karl Fischer (anodo), onde ser injetado um volume conhecido da amostra. A corrente eltrica entre os dois eletrodos mantida constante pelo equipamento, at que, quando toda a gua da amostra reage com o I 2 produzido, h um excesso do mesmo no interior da clula de reao, ocasionando uma queda brusca no potencial eltrico, detectado pelo eletrodo de platina.
4.1.6. Tratamento de dados

Estatstica bsica Medidas de tendncia central: Mdia aritmtica a mais comum das medidas de tendncia central. calculada somando-se as n observaes originais da amostra e dividindo-se por n.

Amplitude (R) o valor que representa o afastamento entre o maior e o menor valor de um conjunto de observaes. Medidas de disperso: Varincia (s 2) A varincia de um conjunto de dados , por definio, a mdia dos quadrados das diferenas dos valores em relao sua mdia, isto :

Fundamentos em qumica experimental | 273

Desvio padro (s) O desvio padro indica a disperso dos dados dentro da amostra, isto , o quanto os dados em geral diferem da mdia. Quanto menor o desvio padro, mais parecidos so os valores da srie estatstica.

Propagao de incertezas Em qumica analtica, estudam-se mtodos envolvendo medio de volume, massa e absorvncia. Os resultados finais destas medies so obtidos atravs de clculos e possuem associadas as incertezas originais consideradas para a realizao destes. Um exemplo seria a leitura de volume em uma proveta, durante uma anlise volumtrica: O volume lido est entre 20,6 e 20,7 mL. Assim, devemos estimar o algarismo aps o 6. Poderia ser: 20,61 ou 20,62 ou ainda 20,63. Portanto, escrevemos a primeira medida como: 20,62 0,01.

Pelo mesmo raciocnio, o volume final lido seria 22, 64 mL 0,01. Qual o volume gasto na titulao? 22,64 20,62 = 2, 02 mL Mas qual a incerteza associada a esse resultado final? a soma das incertezas: 2,02 mL 0,02

274 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

4.1.6.1. Validao

A validao de mtodos analticos deve ser feita para demonstrar que estes so adequados para a finalidade a que se destinam: determinao qualitativa ou quantitativa de analitos em uma amostra. Para metodologias descritas em farmacopeias ou outros documentos oficiais, a metodologia ser considerada validada. Em caso contrrio, a validao dever ser realizada atravs do estudo de parmetros, segundo a tabela 3 a seguir, e de acordo com a categoria do mtodo analtico (Anvisa, 2003). Tabela 3 Recomendao de parmetros necessrios para validao dos mtodos analticos e classificao dos mtodos, segundo sua finalidade (USP 30, 2007)
Parmetro de validao
Exatido Preciso Especificidade Limite de deteco Linearidade Faixa

Categoria I
Sim Sim Sim No Sim Sim

Categoria II
Quantitativo Qualitativo Sim Sim Sim No Sim Sim Sim * No Sim Sim No No *

Categoria III
* Sim * * * * *

Categoria IV
No No Sim No No No No

Limite de quantificao No

*Pode ser exigido dependendo da natureza do ensaio especfico.

Categoria I Quantificao de macrocomponentes em substncias ativas ou ingredientes ativos em produtos farmacuticos acabados. Categoria II Determinao de impurezas em substncias ativas ou componentes de degradao em produtos farmacuticos acabados. Categoria III Determinao de caractersticas fisico-qumicas em substncias ativas ou em produtos acabados (ex.: dissoluo, tamanho de partculas, liberao da droga). Categoria IV Testes de identificao.

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Parmetros para validao de mtodos analticos

Para o estudo dos parmetros de validao, importante sempre utilizar substncias de referncia oficializadas pela Farmacopeia Brasileira ou, na ausncia destas, por outras autorizadas pela legislao vigente. No caso da inexistncia dessas substncias, o uso de padres de trabalho aceito, desde que a identidade e o teor sejam devidamente comprovados. Descrio dos parmetros de validao segundo a Resoluo Anvisa RE 899 (2003), Inmetro, DOQ-CGCRE-008 (2003) e USP 30 (2007): I Exatido a proximidade dos resultados obtidos pelo mtodo em estudo em relao ao valor verdadeiro. Vrias metodologias para a determinao da exatido esto disponveis na literatura. No caso de impurezas, podem ser utilizados dois procedimentos:
Ensaio de recuperao: ensaio onde o analito de interesse

adicionado matriz da amostra.


Avaliao da exatido sem a matriz: preparam-se pelo menos

duas amostras do analito, com preciso quantitativa, e os resultados da % de recuperao so calculados. II Preciso Avaliao da proximidade dos resultados obtidos em uma srie de medidas de uma amostragem mltipla de uma mesma amostra. Esta considerada em trs nveis: repetitividade (preciso intracorrida); preciso intermediria (preciso intercorridas) e reprodutibilidade (preciso interlaboratrios). Repetitividade: concordncia entre os resultados dentro de um curto perodo de tempo com o mesmo analista e a mesma instrumentao. A repetitividade do mtodo verificada por pelo menos nove determinaes, dentro do intervalo linear do mtodo, que ser descrito mais adiante.

276 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Preciso intermediria: concordncia entre os resultados do mesmo

laboratrio, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ ou equipamentos diferentes. Para a determinao da preciso intermediria, recomenda-se um mnimo de dois dias diferentes com analistas diferentes.
Reprodutibilidade: concordncia entre os resultados obtidos em labo-

ratrios diferentes, geralmente feitos atravs de estudos colaborativos, aplicados padronizao de metodologias analticas. A preciso de um mtodo analtico pode ser expressa como o desvio padro ou desvio padro relativo (DPR) ou coeficiente de variao, CV%, de uma srie de medidas, que calculado pela frmula:
DPR = DP CMD . 100

Onde: DPR = desvio padro relativo DP = desvio padro CMD = concentrao mdia determinada O valor mximo aceitvel para o DPR de 5%. III Especificidade Capacidade que o mtodo possui de medir exatamente um composto em presena de outros componentes, tais como impurezas, produtos de degradao e componentes da matriz. Testa-se a especificidade de mtodos qualitativos comparando a aplicao do mtodo em amostras contendo o analito de interesse com amostras que no o contm, porm possuem substncias de estrutura qumica semelhante. O mtodo precisa demonstrar a seletividade para o analito, mesmo em presena destas substncias.

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Para anlises quantitativas, pode-se comparar os resultados obtidos para amostras contaminadas com impurezas adicionadas em quantidades determinadas com amostras isentas de contaminantes. O resultado final no deve ser afetado pela presena das substncias adicionadas. IV Limites de deteco e quantificao Parmetro de ensaios quantitativos para baixos nveis de compostos em matrizes de amostras. O limite de deteco a menor concentrao do analito que pode ser determinada com preciso e rigor aceitveis. Na prtica, corresponde normalmente ao padro de calibrao de menor concentrao (excluindo o branco). V Linearidade A linearidade do procedimento analtico a sua capacidade de produzir resultados que sejam diretamente proporcionais concentrao do analito na amostra, em uma faixa de concentrao. Deve ser construda a curva padro experimental e devem ser calculados: o coeficiente de correlao, r, que precisa ser no mnimo igual a 0,99; a interseo com o eixo Y; o coeficiente angular; a soma residual dos mnimos quadrados da regresso linear; e o desvio padro relativo. Recomenda-se que a linearidade seja determinada pela anlise de pelo menos cinco concentraes diferentes, com teor de analito contido entre 80% e 120% da concentrao terica do teste. VI Faixa Intervalo a faixa entre os limites de quantificao superior e inferior de um mtodo analtico. Normalmente, derivado do estudo de linearidade e depende da aplicao pretendida do mtodo. O protocolo de validao um documento completo, que contm todos os parmetros avaliados para a validao de determinado mtodo.

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Modelo de Protocolo de Validao


Consideraes gerais: Objetivo Laboratrio/Setor responsvel Especificaes do mtodo Classificao do mtodo em validao Parmetros de validao aplicveis ao mtodo Siglas Referncias bibliogrficas Material/Vidraria/Equipamentos (marca, modelo, data da calibrao) Reagentes (marca, fornecedor, data de validade) Descrio dos parmetros de validao aplicveis ao mtodo Testes/Resultados da validao Estimativa da incerteza dos resultados obtidos atravs do mtodo Concluso Folha de aprovao Assinaturas dos responsveis pela validao

A metodologia analtica dever ser revalidada caso sejam efetuadas mudanas na sntese da substncia ativa, na composio do produto acabado ou no procedimento analtico.
Fundamentos 5. Fundamentos em qumica orgnica

A qumica orgnica o ramo da qumica que estuda as substncias que contm tomos de carbono em sua composio. O tomo de carbono, por ser tetravalente, se une a outros tomos formando quatro ligaes covalentes. Assim, o carbono tem a capacidade de formar longas cadeias, chamadas cadeias carbnicas.

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As substncias orgnicas so classificadas de acordo com o seu grupo funcional caracterstico. Funes orgnicas mais importantes
Funo orgnica Hidrocarboneto Grupo funciona C xH y Exemplo CH4 Metano CH3-COOH cido etanoico(cido actico) CH3-CHO etanal CH3-CONH2 etanamida CH3-CH2NH2 etanamina CH3-CH2OH Etanol (lcool etlico) CH3-CO-CH3 propanona (acetona) HCOO-C6H5 metanoato de fenila CH3CH2-O-CH2CH3 Etoxietano(ter etlico)

cido carboxlico R-COOH Aldedo Amida Amina lcool Cetona ster ter Fenol R-CHO R-CONH2 R-NH2 R-OH R1-CO-R2 R1-COOR2 R1-O-R2

o-hidroximetil benzeno(o-cresol ou creolina)

A qumica orgnica experimental envolve reaes de sntese e purificao, caracterizao de grupos funcionais, separao, purificao e estudo das propriedades das substncias orgnicas.

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5.1. Tcnicas de separao e purificao


5.1.1. Extrao

A extrao um mtodo onde se utiliza um solvente, que dissolve o analito de interesse em uma amostra seletivamente, separando-o da mesma. A extrao pode ser em fase lquida ou slida, as quais apresentam as seguintes caractersticas principais, descritas no quadro abaixo:
Extrao lquida Solventes orgnicos (ex.: acetona, hexano, acetato de butila, dixido de carbono) Microondas ou aparato prprio para extrao Aquecimento Remoo do solvente aumenta o custo da anlise Extrao slida Fase slida (ex.: slica-C18, resinas de troca inica) Coluna cromatogrfica ou seringa No necessita aquecimento Reduz o uso de solventes orgnicos

5.1.2. Destilao simples

um processo de separao de misturas homogneas slido-lquido ou lquido-lquido (desde que a diferena das temperaturas de ebulio entre os componentes seja alta), onde ocorre a vaporizao e condensao do componente mais voltil. A tcnica da destilao simples utilizada para obteno de solventes puros e muito empregada na produo de bebidas destiladas.

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5.1.3. Destilao fracionada

uma tcnica utilizada para separar misturas homogneas lquidas, pela vaporizao e condensao dos componentes da mistura, baseando-se na diferena de ponto de ebulio entre esses componentes. As aplicaes da destilao fracionada so principalmente relacionadas separao dos componentes (fraes) do petrleo.

5.1.4. Cristalizao

A cristalizao um mtodo de separao e purificao de solues lquidas, ou slido-lquidas, onde so obtidos cristais puros de um dos componentes, o soluto, sendo o mtodo mais adequado para a purificao de substncias slidas. As etapas principais do processo so:
Nucleao A partir do preparo de uma soluo supersaturada, as

molculas do soluto se unem, formando alguns ncleos microscpicos. Ao atingirem a estabilidade e determinado tamanho, estes ncleos se organizam em uma estrutura cristalina. Essa organizao depender de fatores como a temperatura e a concentrao da soluo supersaturada.
Crescimento dos cristais A partir dos ncleos ocorre o crescimento

dos cristais, a uma velocidade relacionada supersaturao da soluo. Os cristais tm formas e tamanhos diferentes, dependendo das condies em que se efetua sua obteno, o que se torna um grande desafio quando se trata de processos industriais de cristalizao.

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5.1.5. Determinao do ponto de fuso

O ponto de fuso a temperatura constante na qual uma substncia muda do estado fsico slido para o lquido. A determinao desta propriedade fundamental para a caracterizao de substncias puras. A tcnica pelo mtodo do tubo de Thiele consiste em colocar pequena quantidade da substncia slida, previamente pulverizada, no interior de um tubo Fonte: Constantino, 2009 capilar, fechado em uma das extremidades. A introduo da substncia deve ser feita empurrando a extremidade aberta contra o slido, com o auxlio de uma esptula. Para a compactao da substncia no fundo do capilar, deve-se solt-lo no interior de um tubo de vidro. O capilar deve ser preso a um termmetro, o mais prximo possvel do bulbo. O ponto de fuso a temperatura na qual aparece a primeira gota de lquido e desaparece o restante da parte slida da substncia em anlise.

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Resumo do captulo

A qumica uma cincia essencialmente experimental, que se divide em quatro ramos principais: qumica inorgnica, orgnica, analtica e fsico-qumica. O laboratrio o local mais importante para o desenvolvimento desta cincia. Para a realizao de atividades laboratoriais, imprescindvel reconhecer os diversos materiais, equipamentos, substncias, fontes de consulta bibliogrfica, smbolos e normas de segurana, e apresentar uma postura adequada. O preparo de solues uma das tarefas principais dentro de um laboratrio e engloba: qualidade da gua, dos reagentes, da vidraria e da tcnica de preparo, bem como o conhecimento das unidades de concentrao (quantidade de matria, massa por volume, massa por massa e volume por volume), clculos de diluio e procedimentos de armazenagem. O ramo da qumica que estuda a identificao e quantificao das substncias que compem uma amostra a qumica analtica. As principais etapas de uma determinao analtica so: planejamento e organizao da anlise; estudo das propriedades do analito; amostragem; preparo da amostra laboratorial; seleo do mtodo de anlise clssicos (gravimetria e volumetria) ou instrumentais (potenciometria, espectrofotometria UV/Visvel, absoro atmica, infravermelho, fotoluminescncia e cromatografia) e tratamento de dados/ validao. O controle de qualidade das diversas matrias-primas e dos produtos industrializados, os resduos gerados nesses processos produtivos, as reaes qumicas na natureza e as pesquisas envolvendo a transformao de substncias em novos produtos so reas onde a qumica analtica est presente. Os requisitos de qualidade para diversos produtos na rea da sade so estabelecidos pelas farmacopeias. A Farmacopeia Brasileira o cdigo oficial farmacutico do pas. A qumica orgnica o ramo da qumica que estuda as substncias que contm tomos de carbono em sua composio, as quais so classificadas de acordo com o seu grupo funcional caracterstico. A qumica orgnica experi-

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mental envolve reaes de sntese e purificao, caracterizao de grupos funcionais, separao, purificao e estudo das propriedades fsico-qumicas.
Questes para reflexo

1) Um tcnico de laboratrio preparou uma soluo aquosa de sulfato de cobre, armazenando-a em um recipiente de vidro, na geladeira. Algum tempo depois, ele observou a presena de um precipitado de sulfato de cobre no fundo do recipiente. O tcnico decidiu, ento, aquecer a soluo, sob agitao, at que o precipitado dissolvesse completamente. Logo aps, deixou a soluo em repouso sobre a bancada at que a mesma atingisse a temperatura ambiente. O tcnico observou que a soluo permaneceu homognea. Explique o que aconteceu antes e depois do aquecimento da soluo. 2) Descreva, com as suas palavras, a sequncia correta a ser seguida para o preparo de um litro de uma soluo salina (ou soro caseiro) na concentrao de 0,9% (m/v). Liste os materiais, reagentes, equipamentos, procedimento (tcnica de preparo e armazenagem) e clculos necessrios. Reflita sobre os cuidados gerais a serem adotados quando do preparo de solues. 3) Um tcnico recebeu uma amostra de gua deionizada para anlise no laboratrio. Descreva o procedimento a ser seguido, desde o recebimento dessa amostra at o seu descarte, incluindo as etapas para a realizao das determinaes analticas, preconizadas pela farmacopeia, para esse tipo de amostra.

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Bibliografia Consultada
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Anexos

288 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Anexo 1 | 289

Anexo 1

290 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade