Universidade Federal de Pernambuco

Centro de Tecnologia e Geociências

Curso de Engenharia Química

VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
ANALÍTICOS

Prof. Fernanda Honorato

 CONCEITOS
“A validação deve garantir,
através de estudos experimentais,
que o método atenda às exigências
das aplicações analíticas,
assegurando a confiabilidade dos
resultados” (ANVISA)
“A validação de métodos assegura a
credibilidade destes durante o uso
rotineiro, sendo algumas vezes
mencionado como o “processo que
fornece uma evidência documentada
de que o método realiza aquilo para o
qual é indicado para fazer” (USP)
“É a confirmação por exame e
fornecimento de evidência objetiva
de que os requisitos específicos para
um determinado uso pretendido são
atendidos” (ISO 17025)
“Processo de definir uma
exigência analítica e confirmar
que o método sob investigação
tem capacidade de desempenho
consistente com o que a aplicação
requer” (Eurachem)
“Verificação na qual os
requisitos especificados são
adequados para um uso
pretendido” (VIM)
 Porquê VALIDAR ?

✓ Necessidade de mostrar a qualidade das medições químicas, seja por

razões legais, técnicas ou comerciais;
✓ Exigência dos órgãos reguladores do Brasil e de outros países;
✓ Oferecer evidências objetivas de que os métodos e os sistemas são
adequados ao uso desejado.
 TIPOS DE VALIDAÇÃO

➢ Validação no Laboratório (“in house validation”): consiste

das etapas de validação dentro de um único laboratório; útil nas
etapas preliminares do desenvolvimento de uma metodologia e na
publicação de artigos científicos;
➢ Validação completa (“full validation”): envolve todas as
características de desempenho, um estudo interlaboratorial de
acordo com um protocolo oficial (ISO, INMETRO, ANVISA, etc.).
 LEGISLAÇÃO

➢ Agências credenciadoras no Brasil: ANVISA e INMETRO

- ANVISA: Resolução RDC 166 (2017)
- INMETRO: DOQ-CGCRE-008 (06/2020)
➢ FDA
✓ Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation, 05/2018
✓ Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods Validation,
2015
➢ ICH (International Council for Harmonisation)
✓ Validation of Analytical Procedures: Definitions and Terminology, Q2A
(CPMP/ICH/381/05), 2005
✓ Validation of Analytical Procedures: Methodology, Q2B
(CPMP/ICH/281/05), 2005
➢ Outros Guias: IUPAC, ISO
 Quando VALIDAR?

Para confirmar que os métodos são apropriados para o uso

pretendido!

*Se aplica a:
✓ Métodos não normalizados;
✓ Métodos criados/desenvolvidos pelo laboratório;
✓ Métodos normalizados usados fora dos escopos para os quais
foram concebidos;
✓ Ampliações e modificações de métodos normalizados.

*DOQ-CGCRE-008 – 2020
 *PLANEJAMENTO E EXECUÇÃO DA VALIDAÇÃO

✓ Definir a aplicação, objetivo e escopo do método;

✓ Definir os parâmetros de validação e critérios de aceitação;
✓ Verificar se as características de desempenho do
equipamento estão compatíveis com o exigido pelo método em
estudo;
✓ Qualificar os materiais, por exemplo, padrões e reagentes;
✓ Planejar os experimentos de validação, incluindo o
tratamento estatístico;
✓ Fazer os experimentos de validação.

*DOQ-CGCRE-008 – 2020
 FORMAS DE FAZER A VALIDAÇÃO

✓ Comparando-se os resultados com os obtidos por outros

métodos normalizados ou similares já validados;
✓ Comparações Interlaboratoriais;
✓ Comparações Intralaboratoriais;
✓ Avaliação sistemática dos fatores que influenciam o resultado;
✓ Avaliação da incerteza de medição com base no conhecimento
dos princípios do método e na experiência prática;
✓ Ensaios de repetitividade e reprodutibilidade.
PARÂMETROS ANALÍTICOS PARA
VALIDAÇÃO
 INMETRO x ANVISA

INMETRO ANVISA
Seletividade Especificidade e Seletividade
Faixa de trabalho e Faixa linear de trabalho Intervalo
Linearidade - Sensibilidade (inclinação da Linearidade
curva)
Limite de Detecção (LD) Limite de Detecção (LD) (sensibilidade)
Limite de Quantificação (LQ) Limite de Quantificação (LQ)
Tendência/Recuperação Exatidão
Precisão Precisão
Repetitividade Repetibilidade (precisão intracorrida)
Precisão intermediária (precisão
Precisão intermediária
intercorridas)
Reprodutibilidade (precisão
Reprodutibilidade
interlaboratorial)
Robustez Robustez
 SELETIVIDADE

Capacidade de avaliar, de forma inequívoca, a substância

de interesse na presença de componentes que possam
interferir na análise.

Como avaliar?

✓ Fazer a análise com a amostra e materiais de referência pelo

método em estudo e outros métodos validados;
✓ Analisar amostras contendo vários interferentes suspeitos na
presença do analito de interesse.
Ex.: Espectros de varredura da solução de BZN (a) 20 mg mL-1, (b)
na presença de componentes do sistema emulsionado e da solução
contendo apenas o sistema emulsionado, sem fármaco (c) nas
mesmas condições de análise da solução padrão de fármaco.

Os diferentes espectros de varredura demonstram que os

componentes não absorvem na região do comprimento de onda (315
nm) utilizado para a análise quantitativa do fármaco.

Quim. Nova, Vol. 34, No. 8, 1459-1463, 2011

 LINEARIDADE

Corresponde à capacidade do método em fornecer resultados

diretamente proporcionais à concentração da substância em
exame, dentro de uma determinada faixa de aplicação.

Regressão linear (r)

ANVISA = 0,99
INMETRO = r é um bom indicativo,
mas não conclusivo
 LINEARIDADE
✓ Calculada pelo método dos mínimos quadrados avaliando o coeficiente
de correlação (regressão linear) e os resíduos;
✓ Uma alternativa para avaliar a linearidade é a realização da análise de
variância (ANOVA) na regressão.

Relação entre as
concentrações das misturas
biodiesel:diesel e as áreas
referente a espectros MIR

Quim. Nova, Vol. 31, No. 2, 421-426, 2008

 PRECISÃO

✓ Grau de concordância mútua entre dados obtidos da mesma maneira;

✓ Fornece uma medida do erro aleatório, ou indeterminado, de uma
análise;
✓ As figuras de mérito para a precisão incluem: desvio-padrão absoluto,
desvio-padrão relativo, coeficiente de variação e variância (s2).

s=
 (xi − x )2 CV =
s
100
n −1 x
✓ A precisão em validação de métodos é considerada em três
níveis diferentes:

REPETITIVIDADE

PRECISÃO INTERMEDIÁRIA

REPRODUTIBILIDADE
 Repetitividade

✓ As condições de repetitividade podem ser caracterizadas

utilizando:
• Mesmo procedimento de medição;
• Mesmo observador;
• Mesmo instrumento usado sob mesmas condições;
• Mesmo local;
• Repetições no menor espaço de tempo possível.

- ANVISA: Mínimo de 9 determinações (ex: 3 níveis de

concentração, 3 réplicas) ou 6 determinações de 1
concentração;
- INMETRO: 7 ou + repetições
Precisão Intermediária

✓ Refere-se à precisão avaliada sobre a mesma amostra, amostras

idênticas ou padrões, utilizando o mesmo método, no mesmo laboratório,
mas definindo exatamente quais as condições a variar (uma ou mais), tais
como:
• diferentes analistas;
• diferentes equipamentos;
• diferentes tempos;
✓ Esta medida de precisão representa a variabilidade dos resultados em
um laboratório.
Reprodutibilidade

✓ Embora não seja um componente de validação de método executado

por um único laboratório, é considerada importante quando se busca a
verificação do desempenho dos seus métodos em relação aos dados de
validação obtidos por meio de comparação interlaboratorial.
✓A partir do desvio padrão obtido sob condições de reprodutibilidade é
possível calcular o limite de reprodutibilidade (R), o qual permite ao
analista decidir se a diferença entre os valores da duplicata das
amostras analisadas sob condições de reprodutibilidade é significante.

INMETRO - No mínimo 5 laboratórios!

 EXATIDÃO

Grau de concordância entre os resultados individuais

encontrados em um determinado ensaio e um valor de
referência aceito como verdadeiro.

A exatidão de um método analítico é definida como a

diferença entre o valor obtido (média) e o valor
verdadeiro presente na amostra.

Como avaliar??

✓ Materiais de referência;
✓ Comparação de métodos;
✓ Ensaios de recuperação.
 Material de Referência Certificado (MRC)

➢ Os MRC são materiais de referência acompanhados de um

certificado que possui o valor de concentração de uma dada
substância, ou outra grandeza para cada parâmetro e uma
incerteza associada;
➢ Os valores obtidos pelo laboratório (a média e a estimativa do
desvio padrão de uma série de replicatas) da mesma amostra
padrão devem ser comparados com os valores certificados do
material de referência, para verificar a exatidão do método;
➢ Cálculo: erro relativo (ER, %); teste de hipóteses; índice z;
erro normalizado
 Comparação de Métodos

✓ Consiste na comparação entre resultados obtidos empregando-se o

método em desenvolvimento e os resultados obtidos através de um
método de referência, avaliando o grau de proximidade entre os
resultados obtidos pelos dois métodos, ou seja, o grau de exatidão
do método testado em relação ao de referência.
Recuperação

✓ A Recuperação (ou fator de recuperação), R, é definida como a

proporção da quantidade da substância de interesse, presente ou
adicionada na porção analítica do material teste, que é extraída e
passível de ser quantificada.

✓As amostras podem ser fortificadas com o analito (spike) em pelo

menos três diferentes concentrações: baixa, média e alta, da faixa de
uso do método.

Valorobservado
100
Valoresperado
 LIMITE DE DETECÇÃO (LD)

Menor concentração da substância em exame que pode ser

detectada, mas não necessariamente quantificada, utilizando
um determinado procedimento experimental.

Para a validação de um método analítico, é normalmente

suficiente fornecer uma indicação do nível em que a detecção do
analito pode ser distinguida do sinal do branco/ruído (INMETRO).

Como determinar??

✓ Método Relação Sinal-Ruído

✓ Método baseado em parâmetros da curva analítica
 Método Relação Sinal-Ruído

✓ Aplicado para métodos analíticos que mostram o ruído da

linha de base.

Relação sinal-ruído
2:1 ou 3:1
Método baseado em parâmetros da curva analítica

✓ O limite depende da razão entre a magnitude do sinal analítico e o

tamanho das flutuações estatísticas do sinal do branco;
✓ O sinal analítico mínimo distinguível é dado por:

Sbr é o sinal médio do branco;

S m = S br + ksbr k é um múltiplo (valor recomendado é 3);
sbr é o desvio padrão do branco.

✓ Sm é obtido por medidas repetidas do branco (20 a 30 vezes);

✓ A partir da equação para a curva analítica, converte-se Sm em cm,
definido como limite de detecção:

S m − S br m: inclinação da reta
LD = Cm =
m
 LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LQ)

A concentração mais baixa de um analito que pode ser determinada

com precisão aceitável (repetitividade) e exatidão, nas condições
declaradas do teste.

É a característica de desempenho que define a habilidade de um

processo de medida química quantificar um analito
adequadamente.

Como determinar??

LQ = X + 10s

X = média das leituras dos brancos

s = desvio-padrão amostral dos brancos
 ROBUSTEZ

A robustez de um método mede a sensibilidade que este

apresenta diante de pequenas variações.

Como determinar??

✓ Pode-se recorrer ao teste de Youden: teste que permite não só avaliar

a robustez do método, como também ordenar a influência de cada uma
das variações nos resultados finais, indicando qual o tipo de influência de
cada uma dessas variações.
 INCERTEZA DE MEDIÇÃO

Parâmetro associado ao resultado de uma medição, que

caracteriza a dispersão de valores que poderiam ser
razoavelmente atribuídas ao mensurando.

✓ Fontes de incerteza: fatores que contribuem na obtenção da

incerteza do resultado de uma medida.
Etapas para o Cálculo de Incerteza

1. Identificação das fontes de incertezas que podem influenciar nos

resultados do ensaio;
2. Quantificar os componentes de incerteza e atribuir à distribuição
de probabilidade;
3. Determinação da incerteza padrão (ui) para cada fonte de
incerteza;
4. Cálculo da incerteza padrão combinada (uc);
5. Cálculo dos graus de liberdade efetivo (eff) e do fator de
abrangência(k);
6. Cálculo da incerteza expandida (U).
 Exemplo de Cálculo de Incerteza: pH

pH = Y = f (X1, X2, X3, X4)

Sendo:
X1 = Analista
X2 = Equipamento
X3 = Temperatura
X4 = Material de Referência Certificado
 Exemplo de Cálculo de Incerteza: pH

➢ Cálculo da incerteza padrão combinada (uc);

➢ Cálculo dos graus de liberdade efetivo (eff) e do fator de abrangência(k);
➢ Cálculo da incerteza expandida (U).
Exemplo de Cálculo de Incerteza: pH
Que parâmetros utilizar para VALIDAR um método?

Varia de acordo com o tipo de ensaio...