UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

CAMPUS UNIVERSITÁRIO PROF. ANTÔNIO GARCIA FILHO

DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA
Disciplina: Prof. responsável:
FARML0039.10 - HABILIDADES FARMACÊUTICAS VI Dr. Rodrigo Simões
Tópico:
VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS

VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS

Medidas analíticas só são aceitáveis como verdadeiras se for provada estatisticamente a sua veracidade. Assim, a
validação deve demonstrar que o método analítico produz resultados confiáveis e é adequado à finalidade a que se destina,
de forma documentada e mediante critérios objetivos.
A seguir serão discutidos os principais aspectos relacionados à RDC 166, DE 24 DE JULHO DE 2017 da ANVISA. Esta
Resolução estabelece critérios para a validação de métodos analíticos. É basicamente esta resolução que deve ser seguida
para validação de métodos a serem empregados por indústrias ou laboratórios que tenham suas atividades regulamentadas
e fiscalizadas pela ANVISA.
A seguir serão abordados os principais parâmetros da validação analítica (também chamados de figuras de mérito)
de acordo com a RDC 166/2017 ANVISA.

MODELO 1: LINEARIDADE, LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO E LIMITE DE DETECÇÃO

LINEARIDADE
A linearidade de um método deve ser demonstrada por meio da sua capacidade de obter respostas analíticas
diretamente proporcionais à concentração de um analito em uma amostra. Uma relação linear deve ser avaliada em toda a
faixa estabelecida para o método.
Para o estabelecimento da linearidade, deve-se utilizar, no mínimo, 5 (cinco) concentrações diferentes da SQR para
as soluções preparadas em, no mínimo, triplicata.

LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO
O limite de quantificação é a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com precisão
e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.
LQ = (10. σ)/IC
Em que: IC é a inclinação da curva de calibração,  é o desvio padrão e pode ser obtido de 3 formas:
• a partir do desvio padrão do intercepto com o eixo Y de, no mínimo, 3 curvas de calibração construídas
contendo concentrações do analito próximas ao suposto limite de detecção;
• a partir do desvio padrão residual da linha de regressão;
• a partir da estimativa de ruído proveniente da análise de um apropriado número de amostras do branco.

LIMITE DE DETECÇÃO
Limite de detecção deve ser demonstrado pela obtenção da menor quantidade do analito presente em uma amostra
que pode ser detectado, porém, não necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas.
 A determinação do limite de detecção pode ser realizada por meio de método visual, da razão sinal-ruído, baseado
na determinação do branco ou em parâmetros da curva de calibração, considerando-se as particularidades do método
analítico utilizado.
Para métodos visuais, o limite de detecção é determinado pela menor concentração para a qual é possível constatar
o efeito visual esperado.
Para a determinação baseada em parâmetros da curva analítica, o limite de detecção pode ser calculado pela: LQ =
(3,3. σ)/IC.

PENSE E RESPONDA
Problema 1. (Adaptado de Química Nova, Vol. 43, No. 2, 175-180, 2020). Os parabenos são conservantes usados em uma
grande variedade de produtos cosméticos, além de produtos alimentícios e farmacêuticos. São ésteres do ácido p-
hidroxibenzóico, sendo os mais usados: metilparabeno (MP), etilparabeno (EP), propilparabeno (PP) e butilparabeno (BP). Os
parabenos possuem baixo custo e oferecem poderosa ação antimicrobiana,1 o que popularizou o seu uso como agentes
conservantes. No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) estabelece os limites de concentração entre 0,4%
(m/m), para a utilização de um único parabeno, e 0,8% (m/m) para a mistura de parabenos. Para o FE o limite máximo é de
1,0% em produtos de higiene pessoal, cosméticos e perfumes. Visando garantir a qualidade, segurança e eficácia dos
produtos cosméticos, faz-se necessário o controle de qualidade dos produtos comercializados. A segui são apresentados
dados sobre a validação de método baseado em QuEChERS PARA determinação dos conservantes 2-Fenoxietanol (FE), 4-
hidroxibenzoato de metilo (MP) e 4-hidroxibenzoato de propilo (PP) em cosméticos por HPLC-DAD.
LINEARIDADE
• Para 4-hidroxibenzoato de metilo (MP) e 4-hidroxibenzoato de propilo (PP) a faixa de concentração de 0,10 a 2,50
µg mL-1 foi empregada.
• Para o 2-Fenoxietanol (FE) a faixa analisada foi de 1,50 a 6,00 µg mL-1
Tabela 1. Parâmetros da regressão linear pelo método dos mínimos quadrados para determinação da linearidade e
determinação do limite de quantificação (LQ) e limite de detecção (LD).

LIMITES DE DETECÇÃO (LD) E LIMITES DE QUANTIFICAÇÃO (LQ)

Para cada um dos analitos, os seus respectivos limites de detecção (LD) e limites de quantificação (LQ) do método foram
estimados a partir dos parâmetros de suas curvas analíticas. O LD é calculado como (3,3s)/S e o LQ como (10s)/S, sendo s o
desvio do coeficiente linear da equação e S é o coeficiente angular da curva analítica.

Baseado no que foi apresentado e nos princípios de validação analítica, responda:

 a) Qual a equação da reta para:
a. FE
b. MP
c. PP
b) Para qual analito o método mostrou-se menos sensível? Justifique sua resposta empregando os dados
apresentados.
c) Qual a diferença entre limite de quantificação e de detecção?
d) O cromatograma a seguir apresenta o resultado da análise de uma amostra real:

Sabendo que as áreas sob os picos normalizadas foram: 2,36125 (FE), 4,624 (MP) e 0,5331 (PP). Calcule a
concentração de cada um dos analitos. Também, determine se as concentrações calculadas estão acima do LQ.

Problema 2. A seguir estão apresentados dados relativos ao doseamento de ATENOLOL em comprimidos de 50mg
empregado cromatografia líquida de alta eficiência.

Instrumentação: cromatógrafo provido de detector ultravioleta a 226 nm; coluna de 250 mm de comprimento e 4,6 mm de
diâmetro interno, empacotada com sílica quimicamente ligada a grupo octadecilsilano (5 μm), mantida à temperatura
ambiente; fluxo da Fase móvel de 0,6 mL/minuto.

Fase móvel: tampão fosfato 0,05 M pH para 3,0 : álcool metílico, 70:30 (v/v).

Solução amostra: foram transferidos 10 comprimidos para balão volumétrico de 1000 mL, adicionados 500 mL de Fase móvel
e deixado em banho de ultrassom durante 15 minutos. O volume foi ajustado com o mesmo solvente, homogeneizado e
centrifugado. 2 mL do sobrenadante foi transferido para balão volumétrico de 100mL e o volume foi ajustado com o mesmo
solvente homogeneizada. O procedimento foi realizado em triplicata.

Curva de calibração: soluções padrão de 1, 3, 6, 9, 12 e 15 μg/mL empregando como solvente a fase móvel.

Atenolol Procedimento: foram injetados, separadamente, 10 μL de cada uma das Soluções padrão e da Solução amostra, os
cromatogramas foram registrados e as áreas sob os picos medidas.

A seguir estão o cromatógrafo representativo mostrando o pico do Atenolol e o registro gráfico da regressão linear,
juntamente com a equação da reta e o coeficiente de correlação oriundos das análises das soluções padrão:
Os resultados (área sob o pico) das análises das três soluções amostra foram: 185001, 186021 e 184254. Considere os
procedimentos experimentais e os dados apresentados e determine o Teor% médio (quantidade de fármaco quantificada em
relação ao valor previsto) para o medicamento analisado.

MODELO 2: PRECISÃO E EXATIDÃO

Para a avaliação da precisão e exatidão costuma-se empregar nove soluções controle (soluções de padrão SQR)
contemplando o intervalo linear do método analítico, ou seja 03 em concentração baixa (por volta de 20% do limite superior
de quantificação), 03 em concentração média (por volta de 50% do limite superior de quantificação) e 03 em concentração
alta (por volta de 80% do limite superior de quantificação).

PRECISÃO
A precisão deve avaliar a proximidade entre os resultados obtidos por meio de ensaios com amostras preparadas
conforme descrito no método analítico a ser validado.
A precisão deve ser demonstrada pela dispersão dos resultados, calculando-se o desvio padrão relativo (DPR) da
série de medições.
A precisão deve ser expressa por meio da repetibilidade, da precisão intermediária ou da reprodutibilidade.
• Repetibilidade - avaliar as amostras sob as mesmas condições de operação, mesmo analista e mesma
instrumentação, em uma única corrida analítica.
• Precisão intermediária - expressar a proximidade entre os resultados obtidos da análise de uma mesma
amostra, no mesmo laboratório, em pelo menos dois dias diferentes, realizada por operadores distintos.
• Reprodutibilidade - deve ser avaliada por meio da proximidade dos resultados obtidos em laboratórios
diferentes. A reprodutibilidade é aplicável em estudos colaborativos ou na padronização de métodos
analíticos para inclusão desses em compêndios oficiais, mediante testes estatísticos adequados.

EXATIDÃO
A exatidão de um método analítico deve ser obtida por meio do grau de concordância entre os resultados
individuais do método em estudo em relação a um valor aceito como verdadeiro.
A exatidão deve ser expressa pela relação entre a concentração média, determinada experimentalmente, e a
concentração teórica correspondente a cada uma das soluções controle analisadas.

PENSE E RESPONDA
Problema 1. (Adaptado de Química Nova, Vol. 43, No. 2, 175-180, 2020). Continuação dos dados relativos à validação
analítica é a avaliação sistemática de um método por meio de ensaios experimentais de modo a confirmar e fornecer
evidências objetivas de que os requisitos específicos para seu uso pretendido são atendidos. Em outras palavras: é a maneira
de provar que um método analítico é confiável. A seguir serão apresentados dados relativos à validação de método baseado
em QuEChERS PARA determinação dos conservantes 2-Fenoxietanol (FE), 4-hidroxibenzoato de metilo (MP) e 4-
hidroxibenzoato de propilo (PP) em cosméticos por HPLC-DAD.
 Tabela 1. Parâmetros da regressão linear pelo método dos mínimos quadrados para determinação da linearidade e
determinação do limite de quantificação (LQ) e limite de detecção (LD).

Tabela 2. Resultados da avaliação da precisão e da exatidão do método.

Considere os dados apresentados e os princípios relativos à validação de métodos analíticos e marque o item INCORRETO:

a) A precisão de um método avalia a proximidade entre os resultados obtidos e é demonstrada pela dispersão dos
resultados, calculando-se o desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV) de séries de medições.
b) A exatidão de um método analítico deve ser obtida por meio do grau de concordância entre os resultados
individuais do método em estudo em relação a um valor aceito como verdadeiro. Para tanto é muito comum o
emprego do cálculo do erro relativo percentual.
c) As soluções empregadas para o teste de precisão e exatidão estão dentro da faixa linear do método.
d) A repetibilidade e a precisão intermediária são coisas diferentes, apesar de avaliar o mesmo parâmetro da validação
(a precisão).
e) Neste método o limite de quantificação para cada um dos analitos é maior do que o limite de detecção para o
mesmo analito. Mas, isso não é uma regra. É possível haver métodos validados com limites de detecção maiores que
limites de quantificação.

MODELO 3: SELETIVIDADE, EFEITO DE MATRIZ E ROBUSTEZ

SELETIVIDADE
A seletividade do método analítico deve ser demonstrada por meio da sua capacidade de identificar ou quantificar o
analito de interesse, inequivocamente, na presença de componentes que podem estar presentes na amostra, como
impurezas, diluentes e componentes da matriz.

EFEITO MATRIZ
O efeito de matriz deve ser analisado quando se trabalha com matrizes complexas.
 O efeito matriz deve ser determinado por meio da comparação entre os coeficientes angulares das curvas de
calibração construídas com a SQR do analito em solvente e com a amostra fortificada com a SQR do analito.
O paralelismo das retas é indicativo de ausência de interferência dos constituintes da matriz e a sua demonstração
deve ser realizada por meio de avaliação estatística adequada. Deve ser adotado o nível de significância de 5% (cinco por
cento) no teste de hipóteses.
Robustez

ROBUSTEZ
A robustez é um parâmetro tipicamente realizado no desenvolvimento do método analítico que indica a sua
capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações das condições analíticas.
Caso haja susceptibilidade do método a variações nas condições analíticas, essas deverão ser controladas por meio
de precauções descritas no método.
A seguir estão apresentadas algumas condições para a avaliação da robustez para diferentes métodos:
• Preparo das Amostras
o Estabilidade das soluções analíticas
o Tempo de extração
o Compatibilidade de filtros
• Espectrofotometria
o Variação do pH da solução
o Diferentes lotes ou fabricantes de solventes
• Cromatografia Líquida
o Variação do pH da fase móvel
o Variação na composição da fase móvel
o Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
o Temperatura
o Fluxo da fase móvel
• Cromatografia Gasosa
o Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
o Temperatura
o Velocidade do gás de arraste

PENSE E RESPONDA
Problema 1. (Adaptado de Química Nova, Vol. 43, No. 2, 175-180, 2020). Continuação dos dados relativos à validação
analítica é a avaliação sistemática de um método por meio de ensaios experimentais de modo a confirmar e fornecer
evidências objetivas de que os requisitos específicos para seu uso pretendido são atendidos. Em outras palavras: é a maneira
de provar que um método analítico é confiável. A seguir serão apresentados dados relativos à validação de método baseado
em QuEChERS PARA determinação dos conservantes 2-Fenoxietanol (FE), 4-hidroxibenzoato de metilo (MP) e 4-
hidroxibenzoato de propilo (PP) em cosméticos por HPLC-DAD.
SELETIVIDADE
A seletividade foi avaliada pela comparação entre os cromatogramas dos extratos de amostras branco com os extratos das
amostras branco fortificadas com solução padrão de MP, PP e FE na concentração de 1,0 µg mL -1 para os parabenos e 3,0 µg
mL-1 para FE.

Figura 1. Cromatogramas obtidos na análise de amostra branco e amostra branco fortificada com 3,00 µg mL-1 para FE, e 1,00
µg mL-1 para MP e PP em comparação com a solução padrão dos analitos.
De acordo com os dados apresentados é possível afirmar que o método é seletivo? Justifique sua resposta.

Problema 2. (Adaptado de Analytica Chimica Acta, v. 538, n.1-2, p. 25-34, 2005). A seguir são apresentados dados
relacionados ao teste de seletividades de um método analítico que visa a determinação estereosseletiva dos principais
metabólitos do ibuprofeno na urina humana por microextração de fase sólida e cromatografia líquida de alta eficiência com
detecção ultravioleta.
A seletividade do método foi assegurada pela análise de 25 μL de soluções padrão de diversos fármacos na concentração de
1 mg/mL (Tabela 1). Amostras de urina sem os analitos alvos também foram analisadas para avaliar a capacidade do pré-
tratamento da amostra para eliminar interferências endógenas.
Tabela 1. Avaliação da interferência de alguns fármacos na análise do ibuprofeno e seus principais metabólitos.

De acordo com os dados apresentados é possível afirmar que o método é seletivo? Justifique sua resposta.