LISTA DE EXERCÍCIOS - VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS

Exercício 1)
Um laboratório pretende validar um método analítico para a determinação de uma
determinada substância em uma amostra de água. O método utiliza
espectrofotometria UV-Visível e a faixa de concentração esperada da substância na
amostra é de 5 a 50 ppm.

Para avaliar a linearidade do método, o laboratório preparou 6 soluções padrão com

concentrações diferentes: 5, 10, 20, 30, 40 e 50 ppm. Cada solução foi analisada
em triplicata e a resposta analítica foi registrada como absorbância em 532 nm.

Com base nos resultados, o laboratório construiu um gráfico de regressão linear. A

equação da reta obtida foi y = 0,0253x + 0,0262, onde y é a absorbância e x é a
concentração da substância em ppm.

Com base nos dados acima, responda às seguintes perguntas:

● O método analítico é linear na faixa de concentração testada?

● Qual é a faixa de trabalho linear do método?
● Qual seria a concentração esperada de uma amostra com absorbância de 0,1
em 532 nm?
● Se uma amostra desconhecida apresentar uma concentração fora da faixa de
trabalho linear do método, qual é a melhor estratégia para determinar sua
concentração?

Gabarito:
O método analítico é linear na faixa de concentração testada?
Sim, para avaliar a linearidade do método, o laboratório preparou 6 soluções padrão
com concentrações diferentes dentro da faixa de 5 a 50 ppm. A regressão linear foi
construída a partir desses dados e a equação obtida apresentou um coeficiente de
determinação (R²) próximo de 1, o que indica uma boa correlação linear entre a
concentração e a resposta analítica. Portanto, pode-se concluir que o método é
linear na faixa de concentração testada.

Qual é a faixa de trabalho linear do método?

A faixa de trabalho linear do método é a faixa de concentração onde a linearidade
foi avaliada e demonstrada. No exercício, foram preparadas 6 soluções padrão com
concentrações entre 5 e 50 ppm, portanto, essa é a faixa de trabalho linear do
método.

Qual seria a concentração esperada de uma amostra com absorbância de 0,1

em 532 nm?
Utilizando a equação da reta obtida na regressão linear (y = 0,0253x + 0,0262) e
substituindo y (0,1) na fórmula, temos:

0,1 = 0,0253x + 0,0262

0,1 - 0,0262 = 0,0253x
0,0738 = 0,0253x
x = 2,92 ppm

Portanto, a concentração esperada de uma amostra com absorbância de 0,1 em

532 nm é de 2,92 ppm.

Se uma amostra desconhecida apresentar uma concentração fora da faixa de

trabalho linear do método, qual é a melhor estratégia para determinar sua
concentração?
Se uma amostra desconhecida apresentar uma concentração fora da faixa de
trabalho linear do método, uma estratégia recomendada é diluir a amostra em uma
concentração dentro da faixa linear do método e analisá-la novamente. Assim, é
possível obter uma concentração mais precisa da amostra original através de
cálculos de diluição. Caso não seja possível diluir a amostra, é necessário utilizar
outro método analítico com faixa de trabalho adequada para a concentração da
amostra.
Exercício 2) Um laboratório deseja validar um método de ELISA para a
determinação de uma proteína em amostras biológicas. A faixa de trabalho
pretendida é de 10 a 100 ng/mL. Foram preparadas soluções padrão da proteína em
concentrações de 10, 20, 40, 60, 80 e 100 ng/mL. Cada concentração foi analisada
em triplicata. Os resultados obtidos foram:

Concentração Leitura 1 Leitura 2 Leitura 3 Média

(ng/mL)

10 0,052 0,056 0,051 0,053

20 0,101 0,096 0,099 0,099

40 0,201 0,203 0,198 0,201

60 0,300 0,298 0,302 0,300

80 0,398 0,402 0,400 0,400

100 0,500 0,502 0,498 0,500

a) Plote um gráfico de dispersão dos resultados, com as concentrações no eixo x e

as leituras médias no eixo y.

b) Calcule a equação da reta de regressão e determine o coeficiente de correlação.

c) Analise se os resultados apresentam linearidade na faixa de trabalho pretendida e

se o método pode ser considerado linear para a determinação da proteína.

d) Qual é a concentração da proteína em uma amostra com uma leitura de 0,250?

Gabarito:
a) Utilize uma ferramenta estatística (como o Excel) para plotar o gráfico.

b) y = 0,0057x + 0,0232 e o coeficiente de correlação é 0,9994.

c) Analisando o gráfico de dispersão e o coeficiente de correlação obtido, é possível

observar que os resultados apresentam uma relação linear positiva entre as
concentrações e as leituras médias na faixa de trabalho pretendida. Portanto, o
método pode ser considerado linear para a determinação da proteína.

d) Substituindo o valor de 0,250 na equação da reta de regressão, temos:

0,250 = 0,0057x + 0,0232

0,2268 = 0,0057x

x = 39,79 ng/mL

Portanto, a concentração da proteína em uma amostra com leitura de 0,250 é de

39,79 ng/mL.
Exercício 3) Cloro é uma substância química amplamente usada na indústria e no
tratamento de água. Um laboratório está validando um método de titulação para
determinar a concentração de cloro em amostras de água. Para avaliar a robustez
do método, eles decidiram testar a influência de duas variáveis: temperatura e
tempo de agitação da amostra.

Foram preparadas 10 amostras de solução de cloro com concentração de 0,5 mg/L,

que foram analisadas por titulação. Os resultados obtidos foram registrados. Em
seguida, as mesmas amostras foram reanalisadas sob condições diferentes:
temperatura mais alta (5 graus Celsius acima da temperatura ambiente) e tempo de
agitação reduzido pela metade. Novamente, os resultados foram registrados.

Amostra Condições Iniciais Condições Alteradas

1 0,48 mg/L 0,51 mg/L

2 0,50 mg/L 0,53 mg/L

3 0,49 mg/L 0,52 mg/L

4 0,52 mg/L 0,55 mg/L

5 0,47 mg/L 0,50 mg/L

6 0,51 mg/L 0,54 mg/L

7 0,50 mg/L 0,53 mg/L

8 0,48 mg/L 0,51 mg/L

9 0,53 mg/L 0,56 mg/L

10 0,49 mg/L 0,52 mg/L

a) Plote um gráfico de dispersão dos resultados para cada variável testada, com as
concentrações no eixo x e as leituras de titulação no eixo y.

b) Calcule a média e o desvio padrão dos resultados para cada conjunto de

condições.

c) Analise se os resultados para cada variável testada apresentam diferenças

significativas em relação aos resultados obtidos nas condições padrão.
d) Verifique se os resultados obtidos ainda estão dentro da especificação de
aceitação do método, que é de ±5% em relação ao valor real da concentração de
cloro.

e) Discuta as implicações dos resultados para a implementação do método em

laboratório e proponha medidas para minimizar os efeitos das variáveis testadas.

Gabarito
a) Para cada variável testada (temperatura e tempo de agitação), plote um gráfico
de dispersão dos resultados com as concentrações no eixo x e as leituras de
titulação no eixo y.

b) Calcule a média e o desvio padrão dos resultados para cada conjunto de

condições (condições padrão, temperatura mais alta e tempo de agitação reduzido
pela metade).

c) Realize um teste estatístico (como o teste t ou o teste de análise de variância)

para verificar se os resultados para cada variável testada apresentam diferenças
significativas em relação aos resultados obtidos nas condições padrão.

d) Verifique se os resultados obtidos ainda estão dentro da especificação de

aceitação do método, que é de ±5% em relação ao valor real da concentração de
cloro.

e) Discuta as implicações dos resultados para a implementação do método em

laboratório e proponha medidas para minimizar os efeitos das variáveis testadas,
como o uso de um banho termostático para manter a temperatura constante e o
aumento do tempo de agitação para compensar a redução da agitação da amostra.
Também pode ser necessário realizar uma nova validação do método com as
condições otimizadas.
Exercício 4) Clorofenóis são compostos químicos que podem estar presentes em
diversos materiais, como água, solo e alimentos. Um laboratório deseja validar um
método de espectrometria de massas para a determinação de 2,4,6-triclorofenol em
amostras de água. A faixa de trabalho pretendida é de 0,1 a 10 ng/mL. Foram
preparadas soluções padrão da substância em concentrações de 0,1, 0,5, 1, 5 e 10
ng/mL. Cada concentração foi analisada em triplicata. Os resultados obtidos foram:

Concentração Leitura 1 Leitura 2 Leitura 3 Média Desvio Padrão

(ng/mL)

0,1 0,017 0,018 0,019 0,018 0,001

0,5 0,086 0,084 0,083 0,084 0,002

1 0,175 0,176 0,174 0,175 0,001

5 0,855 0,851 0,854 0,853 0,002

10 1,706 1,708 1,709 1,708 0,001

a) Calcule o limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) do método.

b) Determine se o método atende à especificação de LOD ≤ 0,1 ng/mL e LOQ ≤ 0,3

ng/mL, de acordo com as diretrizes da Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA).

c) Plote um gráfico de dispersão dos resultados, com as concentrações no eixo x e

as leituras médias no eixo y. Inclua as linhas do LOD e LOQ.

d) Analise se os resultados obtidos estão dentro da faixa de trabalho pretendida e se

o método pode ser considerado adequado para a determinação de
2,4,6-triclorofenol em amostras de água.

e) Discuta as implicações dos resultados para a implementação do método em

laboratório e proponha medidas para minimizar os efeitos de interferentes ou
variáveis ambientais que possam afetar a precisão e exatidão das medidas.

Gabarito:
a) O limite de detecção (LOD) é calculado como 3 vezes o desvio padrão da leitura
da solução de menor concentração (0,1 ng/mL) dividido pelo fator de inclinação da
curva de calibração. Assim:
LOD = 3 * (0,001 ng/mL) / (0,020 - 0,018) = 15 ng/mL

O limite de quantificação (LOQ) é calculado como 10 vezes o desvio padrão da

leitura da solução de menor concentração dividido pelo fator de inclinação da curva
de calibração. Assim:

LOQ = 10 * (0,001 ng/mL) / (0,020 - 0,018) = 50 ng/mL

b) O método não atende à especificação de LOD ≤ 0,1 ng/mL e LOQ ≤ 0,3 ng/mL da
ANVISA.

c) O gráfico de dispersão é apresentado abaixo:

d) Os resultados obtidos estão dentro da faixa de trabalho pretendida (0,1 a 10

ng/mL), mas o método não atende às especificações de LOD e LOQ. Assim, pode
ser necessário melhorar a sensibilidade do método antes de utilizá-lo para a
determinação de 2,4,6-triclorofenol em amostras de água.

e) Para minimizar os efeitos de interferentes ou variáveis ambientais, é importante

realizar a calibração do equipamento regularmente e utilizar soluções padrão de boa
qualidade. Também é recomendado realizar ensaios em branco para avaliar a
presença de interferentes na matriz de amostra e utilizar técnicas de
pré-concentração para aumentar a sensibilidade do método.
Exercício 5) Cloridrato de propranolol é um fármaco utilizado para tratar problemas
cardíacos e hipertensão arterial. Um laboratório está validando um método de HPLC
para determinar a concentração de cloridrato de propranolol em amostras de soro
humano. A faixa de trabalho pretendida é de 10 a 1000 ng/mL.

Foram preparadas soluções padrão da substância em concentrações de 10, 50,

100, 500 e 1000 ng/mL. Cada concentração foi analisada em triplicata. Os
resultados obtidos foram:

Concentração Leitura 1 Leitura 2 Leitura 3 Média Desvio Padrão

(ng/mL)

10 3,17 3,14 3,16 3,16 0,015

50 15,87 15,83 15,85 15,85 0,020

100 31,57 31,59 31,58 31,58 0,010

500 157,97 157,94 157,96 157,96 0,015

1000 315,88 315,91 315,92 315,90 0,020

a) Calcule a exatidão, precisão, linearidade e robustez do método.

b) Determine se o método atende à especificação de seletividade, comprovando a

ausência de interferentes.

c) Calcule o limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) do método.

d) Determine se o método atende à especificação de LOD ≤ 10 ng/mL e LOQ ≤ 30

ng/mL, de acordo com as diretrizes da Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA).

e) Plote um gráfico de dispersão dos resultados, com as concentrações no eixo x e

as leituras médias no eixo y. Inclua as linhas do LOD e LOQ.

f) Analise se os resultados obtidos estão dentro da faixa de trabalho pretendida e se

o método pode ser considerado adequado para a determinação de cloridrato de
propranolol em amostras de soro humano.
g) Discuta as implicações dos resultados para a implementação do método em
laboratório e proponha medidas para minimizar os efeitos de interferentes ou
variáveis ambientais que possam afetar a precisão e exatidão das medidas.

Gabarito:
a) Para calcular a exatidão, precisão, linearidade e robustez do método, são
necessárias as seguintes análises:

Exatidão: determinação da média percentual de recuperação das amostras de

concentrações conhecidas, comparando-as com as concentrações teóricas
esperadas.
Precisão: cálculo do desvio padrão relativo (RSD) das leituras obtidas em cada
concentração padrão.
Linearidade: construção de uma curva de calibração com os dados de leitura
obtidos em cada concentração padrão, com a análise do coeficiente de correlação
(r²).
Robustez: análise da influência de pequenas variações de parâmetros operacionais
(como mudanças no pH, na temperatura e na vazão) sobre os resultados obtidos.
b) Para determinar se o método atende à especificação de seletividade, é
necessário testar a ausência de interferentes adicionando substâncias que possam
estar presentes nas amostras e avaliando se há alteração nos resultados.

c) Para calcular o limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) do

método, é possível utilizar as seguintes fórmulas:

LOD = 3,3 x (desvio padrão do branco / inclinação da curva de calibração)

LOQ = 10 x (desvio padrão do branco / inclinação da curva de calibração)
d) Para determinar se o método atende à especificação de LOD ≤ 10 ng/mL e LOQ
≤ 30 ng/mL, é necessário comparar os valores obtidos com as diretrizes da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).

e) O gráfico de dispersão dos resultados pode ser construído com as concentrações

no eixo x e as leituras médias no eixo y. As linhas do LOD e LOQ podem ser
incluídas como limites inferiores da faixa de trabalho pretendida.

f) Para analisar se os resultados obtidos estão dentro da faixa de trabalho

pretendida e se o método pode ser considerado adequado para a determinação de
cloridrato de propranolol em amostras de soro humano, é necessário comparar as
leituras obtidas com a curva de calibração e verificar se estão dentro da faixa de
trabalho e se apresentam desvio aceitável.
g) As implicações dos resultados para a implementação do método em laboratório
podem ser a necessidade de ajustes nas condições operacionais para minimizar os
efeitos de interferentes ou variáveis ambientais que possam afetar a precisão e
exatidão das medidas, bem como a realização de novas validações caso ocorram
alterações significativas no método ou nos procedimentos de análise. Medidas para
minimizar os efeitos de interferentes ou variáveis ambientais podem incluir a
utilização de técnicas de extração ou purificação de amostras, o controle rigoroso
das condições ambientais, a manutenção preventiva dos equipamentos e a
calibração regular dos instrumentos de medida.
Exercício 6) Cloro é um agente sanitizante amplamente utilizado na indústria
alimentícia para garantir a segurança microbiológica dos alimentos. Um laboratório
está validando um método de contagem de bactérias heterotróficas em água potável
tratada com cloro. A faixa de trabalho pretendida é de 10 a 1000 UFC/mL.

Foram preparadas soluções padrão da bactéria Escherichia coli em concentrações

de 10, 50, 100, 500 e 1000 UFC/mL. Cada concentração foi analisada em triplicata.
Os resultados obtidos foram:

Concentração Leitura 1 Leitura 2 Leitura 3 Média Desvio Padrão

(ng/mL)

10 12 9 11 10,7 1,0

50 51 53 49 51 2,0

100 102 100 101 101 1,0

500 496 498 501 498,3 2,0

1000 1004 1002 1006 1004 2,0

a) Calcule a exatidão, precisão, linearidade e robustez do método.

b) Determine se o método atende à especificação de seletividade, comprovando a

ausência de interferentes.

c) Calcule o limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) do método.

Gabarito
a) Para calcular a exatidão, precisão, linearidade e robustez do método, podemos
utilizar os seguintes parâmetros:

Exatidão: Calculada pela média percentual de recuperação dos valores obtidos em

relação às concentrações padrão esperadas. Podemos calcular a exatidão
utilizando a fórmula:
Exatidão (%) = [(valor médio encontrado / valor esperado) x 100]
Precisão: Avaliada pelo desvio padrão das leituras em relação à média. Podemos
calcular a precisão utilizando a fórmula:
Desvio padrão relativo (%) = [(desvio padrão / média) x 100]

Linearidade: Verificada pela correlação entre as concentrações e as leituras obtidas.

Podemos calcular a linearidade utilizando a fórmula:
Coeficiente de correlação (r) = [n(∑xy) - (∑x)(∑y)] / [√[n(∑x^2) - (∑x)^2] x √[n(∑y^2) -
(∑y)^2]]

Robustez: Testada pela avaliação das leituras obtidas quando o método é

submetido a variações nos parâmetros críticos, como tempo, temperatura, pH, etc.

Linearidade:
Coeficiente de correlação (r) = 0.9999

Robustez:
Não foi realizado o teste de robustez.

b) Para determinar se o método atende à especificação de seletividade, é

necessário comprovar a ausência de interferentes. O laboratório deve realizar testes
de interferência com substâncias conhecidas por afetar a contagem de bactérias
heterotróficas em água potável tratada com cloro, tais como cloro residual, sulfato
de alumínio, entre outros.

c) Para calcular o LOD e LOQ, precisamos calcular o desvio padrão relativo do

branco, que é dado por:

Desvio padrão relativo do branco = desvio padrão do branco / média do branco

O branco corresponde a uma amostra sem bactérias adicionadas. Podemos

considerar a concentração do branco como zero.

Desvio padrão do branco = 0

Média do branco = 0

Desvio padrão relativo do branco = 0 / 0 = indeterminado

Como o desvio padrão relativo do branco é indeterminado, não é possível calcular o

LOD e LOQ utilizando as fórmulas mencionadas. Nesse caso, é comum utilizar um
valor arbitrário para o desvio padrão relativo do branco, como 0,1% ou 1%.
Dependendo da regulamentação ou norma aplicável, pode ser estabelecido um
valor mínimo para o desvio padrão relativo do branco que deve ser utilizado para o
cálculo do LOD e LOQ.

Vamos assumir que o desvio padrão relativo do branco seja de 1%. Então, temos:

LOD = 3,3 x 1% = 0,033 UFC/mL

LOQ = 10 x 1% = 0,1 UFC/mL

Portanto, o LOD do método é de 0,033 UFC/mL e o LOQ é de 0,1 UFC/mL.

Exercício 7) Um laboratório está validando um método de identificação de
compostos orgânicos utilizando espectroscopia Raman. Foram preparadas 5
amostras de compostos puros: tolueno, benzeno, naftaleno, antraceno e fenantreno.
Cada amostra foi analisada em triplicata e os resultados obtidos estão apresentados
na tabela abaixo:

Composto Leitura 1 Leitura 2 Leitura 3 Média Desvio

Padrão

Tolueno 1025 1026 1025 1025,3 0,6

Benzeno 998 999 999 998,7 0,6

Naftaleno 1026 1027 1028 1027 0,6

Antraceno 1025 1026 1025 1025,3 0,6

Fenantreno 1030 1031 1030 1030,3 0,6

Calcule a precisão do método.

Gabarito:
Para calcular a precisão do método, podemos utilizar o desvio padrão relativo
(DPR), que é dado por:

DPR = (desvio padrão / média) x 100%

O valor encontrado para o DPR é de 0,06%, indicando que o método apresenta uma
boa precisão.