UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ

Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia

Relatório de aula prática:

ABSORÇÃO DE LUZ – CURVA DE CALIBRAÇÃO

Alex Martins
Eduarda Fagundes
João Poletto
Pedro Barbosa

Toledo, abril/2023

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INTRODUÇÃO

O teste de absorção de luz, também conhecido como espectrofotometria, é um método

analítico que estuda a interação qualitativa e quantitativa da absorbância da radiação
eletromagnética com as substâncias. Cada composto absorve, transmite ou reflete a luz dentro
de uma faixa específica de comprimento de onda. Sua principal finalidade é quantificar e
identificar a concentração de compostos em solução e é amplamente utilizado em laboratórios
de análises clínicas.

Grande parte dos equipamentos utilizados na técnica de espectrofotometria são

compostos basicamente de uma fonte de luz, um monocromador, uma cubeta (ou célula de
amostra), um detector e um sistema de processamento de sinal. A fonte de luz emite radiação
eletromagnética na região do espectro de interesse, que é selecionada pelo monocromador. A
luz passa pela cubeta contendo a amostra e é detectada pelo detector, que converte a radiação
em um sinal elétrico. O sinal é processado para obter a absorbância que é medida de 0 a 1,
dependendo dos seguintes fatores da lei de Lambert-Beer: a cor do composto ou o tipo de
ligação química presente, o tamanho da partícula, a transparência da solução e a combinações
dos fatores anteriores. Portanto, a intensidade de absorção é proporcional à concentração da
solução, quanto mais concentrada a solução, maior será a absorção de luz.

Uma curva de calibração corresponde à relação gráfica entre os valores de absorbância e

concentração de uma determinada substância. O gráfico permite verificar a linearidade da
reação e calcular o fator de conversão para a concentração do valor de absorbância.
Calibradores de concentração conhecida são usados ​para determinar sua respectiva
absorbância, isso permite transformar cores em números. De acordo com a lei de
Lambert-Beer, a intensidade da luz emitida diminui exponencialmente com o aumento
aritmético da espessura do meio absorvente.

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PARTE EXPERIMENTAL

Solução aquosa de alaranjado de metila

Para o preparo da solução estoque, com a ajuda de uma espátula, pesou-se em uma balança
analítica exatamente 5mg de alaranjado de metila em um papel alumínio. Com a ajuda de um
béquer, fez-se a diluição do alaranjado de metila em água destilada, depois transferiu-se a
solução para um balão de 500ml. Para que não ficasse nenhum resquício de alaranjado de
metila no béquer, lavou-se o mesmo com água destilada pelo menos 3 vezes, passando tudo
para o balão e em seguida completando até o volume de 500 mL.

Após isso, fez-se o cálculo de volume da solução estoque necessária para realizar as
diluições utilizando a fórmula C1 . V1 = C2 . V2. Assim que o volume da solução estoque
que seria utilizado em cada diluição foi conhecido, com o auxílio de pipetas graduadas e
pêras de sucção, iniciou-se a transferência das alíquotas para seus respectivos balões
volumétricos de 50 mL, completando o volume sempre com água destilada.

Por fim, coletou-se uma amostra de cada solução para fazer a leitura no espectrofotômetro em
450 nm. Inicialmente calibrou-se o mesmo com água destilada e, em sequência, foram
transferidas separadamente as amostras das soluções para a cubeta do espectrofotômetro para,
assim, descobrir a absorbância de cada uma. Repetiu-se o mesmo procedimento para as 3
amostras desconhecidas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Cálculo do volume da solução estoque necessária para as diluições

Após o preparo da solução estoque usando 5 mg de alaranjado de metila diluído e completado
com água destilada até o volume de 500 mL, foi feito o cálculo do volume para as diluições
usando a fórmula já conhecida: C1 . V1 = C2 . V2. Onde C1 é a concentração da solução
estoque; V1 é o que queremos descobrir; C2 e V2 são, respectivamente, a concentração e o
volume da solução que iremos preparar.
Com isso, segue a tabela com os cálculos e o resultado dos volumes que serão utilizados.

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Tabela 1: Dados para a diluição da solução estoque.

Solução Concentração (mg/mL) Cálculo Volume da solução

estoque

S1 1 mg/ 50 mL V1: 1 mg x 50 mL/ 5 mg 10 mL

S2 2 mg/ 50 mL V1: 2 mg x 50 mL/ 5 mg 20 mL

S3 3 mg/ 50 mL V1: 3 mg x 50 mL/ 5 mg 30 mL

S4 4 mg/ 50 mL V1: 4 mg x 50 mL/ 5 mg 40 mL

Fonte: Autoria própria.

Leitura no espectrofotômetro de 450 nm

Depois do preparo das soluções, mediu-se a absorbância das mesmas no espectrofotômetro de
450 nm, outras 3 soluções de concentrações desconhecidas também passaram pelo mesmo
procedimento. As medições foram feitas conforme mostra a tabela 2, a qual também serviu
para a construção da curva de calibração.

Tabela 2: Concentração e absorbância das soluções.

Concentração (mg/mL) Absorbância

1 0,147

2 0,350

3 0,418

4 0,547

5 0,741

Amostra desconhecida 1 0,332

Amostra desconhecida 2 0,455

Amostra desconhecida 3 0,592

Fonte: Autoria própria.

Fez-se então a curva de calibração com os valores de absorbância em função da

concentração, junto da linha de tendência (regressão linear), R2 e equação da reta (y = ax +/-
b), sendo o eixo x a absorbância e o eixo y a concentração, como segue na figura 1.

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 Figura 1: Curva de calibração.

Fonte: Autoria própria.

Para descobrir as concentrações das amostras desconhecidas, utilizou-se a equação de reta já

fornecida, arredondando os valores para facilitar o cálculo.
f(x)= 6,94 x + 0,048
O x foi substituído pelo valor das absorbâncias medidas pelo espectrofotômetro, sendo assim,
temos:

Tabela 3: Resultado das concentrações das amostras desconhecidas.

Concentração (mg/mL) Absorbância

2,26 0,332

3,11 0,455

4,06 0,592
Fonte: Autoria própria.

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CONCLUSÃO

Com base nos resultados obtidos neste trabalho é possível concluir que este método escolhido
e testado no laboratório não precisou de equipamentos sofisticados e reagentes com alto grau
de pureza. Através deste método foi possível medir absorção de luz entre os nossos solutos,
onde a maior concentração do nosso soluto em um dos quatro béqueres absorve mais luz
diante as moléculas concentradas que são encontradas no mesmo e por isso sua emissão de
resposta com a luz do outro lado é pouca. Logo, o método escolhido é simples, rápido e
reproduzível.

No experimento foi possível observar que o método apresentou um bom resultado dos dados
experimentais, posto que os valores de absorbância em função da concentração (R2) obtido
ficou muito próximo da linha de tendência. Portanto, a curva de calibração está expressa
quase que de forma linear com os pontos obtidos das concentrações das soluções analisadas.
Usando a equação fornecida pela referência da curva, é possível calcular a concentração da
substância que se deseja, neste caso, foi o alaranjado de metila diluído e completado com
água destilada, um indicador de pH usados para titulações em laboratórios.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. HARGREAVES, AB. Métodos de Análises – Fotocolorimetria e pHmetria. Rio de Janeiro:

Atheneu, 1979.
2. UFRGS. Conceito da Lei de Lampert-Beer. Disponível em:
<https://www.ufrgs.br/leo/site_espec/conceito.html>. Acesso em: 10 de abril de 2023.
3. TRINDADE, Evandro. Espectrofotometria UV/Visível (Fotocolorimetro). 2016.