UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE (CCBS)

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA (DFS)
BIOQUÍMICA

CATARINA ARAGÃO GOMES

GABRIELA DA SILVA SANTANA

CURVA PADRÃO DE PROTEÍNA

SÃO CRISTÓVÃO – SE
2023
 CATARINA ARAGÃO GOMES
GABRIELA DA SILVA SANTANA

CURVA PADRÃO DE PROTEÍNA

Relatório da aula prática requisitado como

componente parcial da primeira avaliação da
disciplina Bioquímica do curso de Farmácia da
Universidade Federal de Sergipe.

Prof. Dr. Humberto Reis Matos.

SÃO CRISTÓVÃO – SE
2023
 1. INTRODUÇÃO
As proteínas desempenham papéis importantes na maioria dos processos
biológicos. O desenvolvimento de metodologias para quantificá-las é fundamental em
várias áreas da ciência, como, por exemplo, em análises clínicas, auxiliando no
diagnóstico de certas doenças correlacionadas com a alteração da quantidade de
proteínas nos fluidos biológicos. Os métodos para a determinação da concentração de
proteínas são variados, entretanto, as metodologias mais utilizadas são as
espectrofotométricas no ultravioleta e no visível, conhecidas como UV-Vis.
A espectrofotometria é uma das técnicas analíticas mais utilizadas para
determinações quantitativas de espécies químicas, devido à robustez, instrumentação
relativamente simples e de baixo custo, e ao grande número de aplicações
desenvolvidas. Essa técnica se baseia na medida da absorção de radiação
eletromagnética nas regiões visível e ultravioleta por espécies químicas em solução.
Na análise quantitativa, a atenuação do feixe de radiação é, dentro de certos limites,
proporcional à concentração da espécie química a ser determinada. As espécies
químicas de interesse geralmente estão presentes em solução líquida, embora seja
também possível medidas em fase sólida ou gasosa. (BERGAMIN, H. F.; et al., 2010)
A lei de Beer fundamenta a espectrometria, quando um feixe de radiação de
comprimento de onda definido (i.e. de energia apropriada) e de intensidade I0 incide
sobre uma amostra, uma parte desta energia é absorvida (Ia), uma parte é transmitida
(It) e outra é refletida ou espalhada (Ir), de forma que:
Io = Ia + It + Ir
 A figura 1 esquematiza a determinação quantitativa da absorção de luz por uma
amostra, ou melhor, sua densidade óptica, na qual incide um feixe de luz de
comprimento de onda λ e intensidade I0; ao ser refratado, a intensidade do feixe decai
exponencialmente com o caminho óptico l percorrido no interior da amostra.
O resultado destas observações foi expresso por uma equação relacionando a
absorção da radiação com a concentração da espécie absorvente e com o caminho
óptico da cela de medida:

Essencialmente, estas expressões mostram que a medida da absorbância da

amostra é proporcional a três quantidades: ελ que é uma característica intrínseca às
propriedades eletrônicas de cada cromóforo em cada comprimento de onda e aos
parâmetros experimentais extrínsecos, a concentração do cromóforo e o caminho
óptico percorrido pela luz na amostra. (GALO, A. L.; COLOMBO, M. F., 2009)
No entanto, as Leis de Lambert–Beer nem sempre são obedecidas. Algumas
desobediências são conhecidas e atribuídas a fatores como: mudança na natureza do
soluto, valores muitos altos ou muitos baixos das concentrações das soluções, etc.
Também as presenças de ácidos, bases e sais na solução podem contribuir para essas
desobediências, por estarem mais completamente dissociados, à medida que aumenta
a diluição, visto que a absorção da luz pelos íons é diferente daquela apresentada
pelas moléculas não ionizadas.
Para se evitar discrepâncias das Leis de Lambert-Beer, deve se trabalhar com
soluções mais diluídas e construir, previamente, uma curva padrão, em que são usadas
concentrações conhecidas (e crescentes) da substância em análise, e verificar as
absorbâncias no comprimento de onda indicado e na cubeta de caminho óptico
adequado. Desta forma, teremos os limites de concentração nos quais a solução
obedece às Leis de Lambert-Beer, ou seja, onde há linearidade. Com o emprego da
curva padrão, podemos, também, determinar a concentração de uma solução
problema. O comprimento de onda (λλλλ) usado para a obtenção da curva padrão é
obtido pela preparação do espectro de absorção da substância em estudo e é,
normalmente, o λλλλ onde a absorbância para a substância apresenta o valor máximo.
(UFF, 2012)
2. OBJETIVOS
● Construir uma curva padrão de proteína
● Determinar a concentração de proteína numa amostra desconhecida
● Utilizar o método de biureto para leitura no espectrofotômetro
● Familiarizar-se com o equipamento espectrofotômetro

3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Materiais
● Eppendorfs
● Cubeta do espectrofotômetro
● Albumina 0,124g
● Água destilada
● Reativo de biureto
● Saliva
● Béquer
● Micropipetas
● Pipeta graduada
● Pêra pipetadora
● Estante

3.2 Metodologia
Diluir 124 mg, de padrão albumina com água destilada, 1 mL ou
1000 µL num eppendorf. Separar 5 eppendorfs, o primeiro será para o
reagente branco: contendo tudo menos a amostra, 1 mL de água destilada +
1 mL de reativo de biureto, o segundo: pipetar 10 µL do padrão, neste
eppendorf teremos 1,24 mg, no terceiro: pipeta 20 µL do padrão, teremos
2,48 mg, no quarto: pipetar 25 µL do padrão, teremos 3,1 mg e no último e
quinto: pipetar 50 µL do padrão, teremos 6,2 mg. Completar os últimos 4
eppendorfs, que contém albumina, com água destilada, para ter 1 mL, no
primeiro 990 µL, no segundo 980 µL, no terceiro 975 µL e no quarto 950 µL.
Adicionar 1 mL de reativo de biureto, para agir como um cromóforo, nos 4
eppendorfs que contém albumina. Por fim, para produzir a amostra: adicione
100 µL de saliva, 900 µL de água destilada e 1 mL de reativo de biureto. Para
a leitura no espectrofotômetro, utilizando-se do método de biureto, ajuste para
 o comprimento de onda de 525 nm. Ler na ordem, começando pelo branco e
ao fim, a amostra desconhecida. Anote os resultados da absorbância para
construção da curva padrão da proteína.

4. RESULTADOS
4.1. Escala do gráfico da curva padrão de proteína

Concentração (mg/µL) Absorbância

1,24 0,222

2,48 0,261

3,10 0,322

6,20 0,356
Quadro 1: Valores de absorbância obtidos no espectrofotômetro a partir de uma concentração

4.2. Curva padrão de proteína

Gráfico 1: Curva padrão da proteína. Eixo X trata da concentração e o eixo Y da absorbância.

A partir do gráfico de dispersão, é possível produzir a equação da

2
reta e descobrir 𝑅 .
 𝑌= 𝑎 × 𝑥 + 𝑏
𝑌 = 0, 02612 × 𝑥 + 0, 20523
2
𝑅 = 0, 84034
É essa equação que torna possível descobrir a concentração de
qualquer amostra desconhecida, pela sua absorbância. No caso da amostra
disponível, com 100 µL de saliva, 900 µL de água destilada e 1 mL de reativo
de biureto, descobrimos que a absorbância era de 0,400. Então, ao substituir
na equação da reta, temos a concentração de:
0, 400 = 0, 02612 × 𝑥 + 0, 20523
𝑥 = 7, 456738132
5. DISCUSSÃO
A construção de uma curva padrão, neste caso de proteína, é
importante para determinar a concentração de uma proteína desconhecida
numa amostra. Para essa construção, fazemos uso de um padrão, utilizamos
a albumina. Diluímos em 1000 µL/1 mL, pois a sensibilidade do método de
biureto, ao qual utilizamos, é de 1 mg até 10 mg.
Produzimos concentrações diferentes da mesma substância diluída
para produzir um padrão e adicionamos o reativo de biureto para que sirva de
cromóforo, já que as soluções sem ele são incolores, ou seja, inúteis de
serem lidas no espectrofotômetro, visto que é um instrumento de análise
capaz de medir e comparar a quantidade de luz (radiação eletromagnética)
absorvida, transmitida ou refletida por uma determinada amostra.
Fazemos uso de uma solução denominada “branco” para tarar o
espectrofotômetro e descobrir a absorbância real da proteína, por isso deve
ser lida primeiro. Na leitura, deve-se ter atenção à intensidade da cor das
soluções, pois esta deve aumentar com o aumento de mg, e assim também a
absorbância. Interessante apontar que as soluções são completadas com
água destilada para que todas lidas tenham 2 mL.
A partir da leitura no espectrofotômetro, do branco, da menor
concentração para a maior e da amostra, podemos construir a curva padrão e
descobrir sua equação da reta para podermos determinar a concentração da
proteína desconhecida na amostra. Também obtemos o valor do coeficiente
2
de determinação da regressão (𝑅 ), o qual expressa numericamente o
 percentual da variação total do sinal analítico (Y) explicado pela variação da
concentração do analito (X). Este valor é aceitável a partir de 0,95 e ideal em
0,99, pois vai até o 1 e por isso quanto mais próximo, maior a correlação
entre os eixos. Obtivemos o valor de 0,84034, seria então necessário refazer
o experimento. Todavia, com a equação da reta, ainda podemos calcular a
concentração da proteína na amostra de saliva e determinamos o valor de,
aproximadamente, 7,47 mg/µL.

6. CONCLUSÃO
Utilizamos do método do biureto para leitura no espectrofotômetro
de amostras que nos ajudariam a construir uma curva padrão de proteína.
Dessa forma, nos familiarizamos com o equipamento, e também pudemos, ao
determinar a curva, encontrar a equação da reta para descobrir as
concentrações de proteínas em amostras desconhecidas, como a de saliva
utilizada. Infelizmente o valor do coeficiente de determinação da regressão foi
muito baixo, assim, seria ideal refazer o experimento. Razões para essa
adversidade podem variar, do baixo número de soluções lidas para a
construção da reta, ou inexperiência ao fazer uso das pipetas, até qualquer
falha no processo. Conclui-se então que os objetivos desta prática foram
alcançados, todavia é fundamental praticar este experimento para resultados
mais conclusivos.

REFERÊNCIAS

BERGAMIN FILHO, Henrique; KRUG JOSÉ, Francisco; GUIDETTI ZAGATTO,

Elias Ayres; PIOVEZANI ROCHA, Fábio Rodrigo. ESPECTROFOTOMETRIA
NO ULTRAVIOLETA E VISÍVEL, 2010. Disponível em:
</https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4275863/mod_resource/content/1/Apo
stila-espectrofotometria.pdf>. Acesso em 19 março 2023.

DE ALMEIDA, Alessandra Balbina; et al. QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

TOTAIS EM FOLHAS DE Mangifera indica L. PELO MÉTODO DO BIURETO.
Multidisciplinaridade nas ciências ambientais - Biotecnologia de alimentos e
plantas e impactos ambientais das atividades agropecuárias, UEPA, 2017.
Disponível em:
<https://paginas.uepa.br/eduepa/wp-content/uploads/2019/06/Multidisciplinaridad
e-CI%C3%8ANCIAS-AMBIENTAIS-2-E-BOOK-eduepa.pdf#page=70>. Acesso
em 19 março 2023.

GALO, André Luiz; COLOMBO, Márcio Francisco. Espectrofotometria de

longo caminho óptico em espectrofotômetro de duplo-feixe convencional,
2009. Disponível em:
<https://www.scielo.br/j/qn/a/ZY45c79NHd9vMzfgJWVXZHR/?lang=pt#>. Acesso
em 19 março 2023.

MANSUR, João de Souza; et al. Determinação do fator de proteção solar por

espectrofotometria. An. bras. dermatol ; 61(3): 121-4, maio-jun. 1986. tab, ilus.
Disponível em: <https://pesquisa.bvsalud.org/portal/resource/pt/lil-34224>.
Acesso em: 19 março 2023.

SAGIO, S; et al. Curvas padrões para determinação de açúcares redutores,

açúcares solúveis totais, proteínas e aminoácidos. Universidade Federal de
Lavras. Departamento de Biologia Setor de fisiologia vegetal. Minas Gerais,
2007, p. 2-46.

SILVA, G.C.; SOUZA,T.S. Avaliação do teor de proteína em diferentes

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Espírito Santo, 2011, p. 2-36.

TRINDADE, Vera Maria Treis; et al. SIMULAÇÃO DE UMA CURVA PADRÃO

DE PROTEÍNAS E DOSAGEM VIRTUAL DE PROTEÍNAS NUMA AMOSTRA
BIOLÓGICA, 2010. Disponível em:
<https://www.lume.ufrgs.br/bitstream/handle/10183/62623/Ensino2011_Resumo_
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UFF; ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS: FUNDAMENTOS DE FOTOMETRIA E

ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO, 2012.