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Departamento de Bioquímica

Dosagem virtual de proteínas pelo

método de Biureto

1. Objetivos.
● Compreender e aplicar uma reação colorimétrica;
● Compreender os princípios do uso do espectrofotômetro;
● Compreender e aplicar a reação de biureto na quantificação de proteínas.

2. Introdução.
A espectrofotometria de luz ultravioleta ou visível é uma das técnicas mais
utilizadas em determinações analíticas por ser de baixo custo, utilizar
equipamentos robustos, ser de fácil operacionalização e com boa sensibilidade
(10-4 a 10-5 mol.L-1, podendo alcançar 10-6 a 10-7 mol.L-1).
A principal variável que diferencia as ondas de luz é seu comprimento de
onda (ƛ - lambda) e este será utilizado durante o uso do espectrofotômetro, pois
para cada reação colorimétrica, haverá um ƛ de leitura.

O uso do espectrofotômetro para quantificação em

reações colorimétricas tem como princípio a lei de
Lambert-Beer, a qual apresenta que a absorbância de luz é
diretamente proporcional a concentração da solução de
amostra ou inversamente proporcional ao logaritmo da luz
transmitida, ou seja, quanto maior a concentração/reação,
maior a absorção de luz.
 Para o procedimento de espectrofotometria de luz, após se inserir a
amostra em uma cubeta, aplica-se um feixe de luz monocromático (no ƛ adequado
para a reação), sendo que, após passar pela amostra, quantifica-se a luz
emergente, considerando-se esta a transmitância.

A transmitância consiste na medida da luz transmitida. Quando um raio de

luz monocromática de intensidade inicial definida incide sobre uma solução
colorida, a intensidade da luz emergente é menor que a luz incidente, ou seja,
parte da luz foi absorvida. Destaca-se que nesse processo há perdas, por
reflexão, dispersão, além da absorção pela amostra.
Dessa forma, a transmitância será a razão entre a Energia radiante
emergente a energia radiante incidente:

De forma complementar, calcula-se

absorbância. Esta representa a medida da
luz absorvida, medindo-se a intensidade de
luz absorvida por uma solução corada a
partir da redução da transmitância.

Assim:
A = log (1 / T) = log (P0 / P)

Quando A = 0; T = 1 → 100 % transmissão

Quando A = 1; T = 0,1 → 10% transmissão e 90% de absorção

Para esta prática virtual, utilizaremos a reação de biureto para quantificar a

concentração de proteína presente em uma amostra.
A reação tem como princípio a interação do Cu2+ com o oligo (pelo menos
tripeptídio) ou polipeptídios. O nome desta reação se deve ao fato de que,
historicamente, se observou interação similar do Cu2+ com o biureto (molécula
resultante da condensação de duas moléculas de uréia).
3. Procedimento.
Antes de iniciar esta prática, assista a explicação: https://youtu.be/rS1jiy_vsX4

Para realizar o procedimento, baixe o arquivo zip com o aplicativo para executar o
mesmo: https://www.desenvolvimentovirtual.com/bioq/protvirt.zip

Utilize o vídeo a seguir: https://youtu.be/YgTmBbY-nVw

● (dosagem_proteína_MAC para IOS; dosagem_proteina_WIN.exe para
Windows; dosagem_proteina.html, para quem conseguir usar flash no
navegador)

Caso não seja possível executar o aplicativo, utilize o vídeo alternativo indicando o
uso do aplicativo: https://youtu.be/YgTmBbY-nVw

3.1 Delineamento experimental

Realizaremos uma sequência de tubos, sendo os tubos de 1 a 8 com

concentrações conhecidas e os tubos 9 e 10 desconhecidos.

A partir dos dados das amostra conhecidas, será possível construir a curva
padrão, obtendo-se a fórmula para cálculo das amostras desconhecidas.
3.2 Uso do aplicativo/simulação

Utilize o aplicativo sobre dosagem de proteínas para realizar a simulação virtual de

uma das técnicas para determinação de proteínas.

A partir da tela inicial do software, você poderá acessar as diversas áreas:

conceitos sobre ligação peptídica, reação do biureto e espectrofotômetro,
simulação e bibliografia.

Após acessar o aplicativo, siga as instruções:

1 – Acesse as informações sobre ligação peptídica e relembre o que é um

aminoácido e como se ligam.

2 – Acesse as informações sobre Biureto.

3 – Acesse as informações sobre o espectrofotômetro.

4 – Faça a simulação da dosagem de proteínas.

- Siga os passos do roteiro.

Ao fim de cada passo, você poderá visualizar o botão para seguir.

Atenção para as instruções na tela!
Para fazer o espectrofotômetro funcionar, clique sobre um dos botões.

- Atenção quando utilizar o espectrofotômetro, lembre-se de inicialmente inserir o

lambda e após, medir a absorbância da amostra 1 (Branco).

5 – Após medição de todas as amostras, anote os valores de absorbâncias e

concentrações conhecidas e digite-as em uma planilha (ex. Calc – BrOffice, MS
Excel).

6 – Crie um gráfico de dispersão (x,y) com seus dados. A Absorbância será a

abscissa e a concentração a coordenada.

7 – Gere a regressão linear e obtenha a equação da reta e o coeficiente de

correlação (R).

8 – Aplique os dados das absorbâncias das amostras desconhecidas na fórmula e

descubra a concentração de proteínas (Tubos 9 e 10).
4. Questões.
1. Como o método do Biureto funciona?
2. Qual princípio de reações colorimétricas?
3. Como o espectrofotômetro pode quantificar as proteínas numa solução?
4. Quais possíveis motivos para o valor do coeficiente de correlação estar
muito abaixo de 1 no experimento de dosagem de proteínas com a reação
do biureto?
5. Qual valor do R para a regressão linear gerada para os dados? (O mesmo
está adequado? )
6. Quais concentrações de proteínas nas amostras 9 e 10?

5. Materiais.

● Videoaula com conceitos básicos: https://youtu.be/rS1jiy_vsX4

● Vídeo de utilização do software: https://youtu.be/YgTmBbY-nVw
○ (alternativo para quem não puder usar o aplicativo ou desejar um
tutorial)
● ProtVirt: https://www.desenvolvimentovirtual.com/bioq/protvirt.zip
○ (descompactar o arquivo zip e utilizar o arquivo .exe no windows)
● Slides da apresentação - clique aqui para baixar