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Proteínas – doseamento por

PL2 espectrofotometria UV/Visível

I. Objetivos
 Compreender o conceito espectrofotometria;
 Utilizar a técnica espectrofotometria no doseamento de substâncias;
 Saber calibrar um espectrofotómetro;
 Saber determinar a validade dos métodos de quantificação
espectrofotométrica.

II. Introdução
1. Espectrofotometria

A espectrofotometria estuda as interações entre a energia radiante

e a matéria, incidindo tanto nos aspetos qualitativos como nos
quantitativos. Ou seja, a espectrofotometria permite tirar
conclusões sobre a natureza e composição de uma amostra desconhecida
e permite, por outro lado, determinar a concentração de uma
substância conhecida.

Todas as substâncias absorvem energia radiante, isto é, radiações

eletromagnéticas, desde as ondas de rádio até às radiações gama
(Figura 1), numa certa extensão. Mesmo materiais que são considerados
transparentes para a vista têm espectro de absorção no ultravioleta
ou no infravermelho – o vidro e a água respetivamente.

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Fig. 1 Espectro eletromagnético.

A absorção de energia por uma molécula apenas pode ocorrer quando a

energia do fotão incidente é igual à diferença de energia entre dois
níveis eletrónicos, promovendo assim a transição de um eletrão de um
nível de energia baixo para um mais elevado. Antes que um outro fotão
possa ser absorvido, o estado excitado deve perder esta energia e
reverter ao estado de energia inicial.

Um espectrofotómetro é um aparelho concebido para medir a quantidade

de energia radiante absorvida por moléculas em solução. Os
componentes básicos de um espectrofotómetro são (Figura 2):

i. uma fonte de luz policromática, normalmente de tungsténio, para

comprimentos de onda entre 350-900 nm, ou de deutério para a
região dos UV (200-400 nm);
ii. um prisma que decompõe a luz e um filtro ótico que permite
selecionar os comprimentos de onda desejados (monocromador);
iii. um compartimento para alojar a amostra (cuvete);
iv. um detetor, normalmente um tubo fotoelétrico ou um díodo de
silicone, que mede a intensidade de luz transmitida pela
amostra.

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Fig. 2 Componentes básicos de um espectrofotómetro.

A razão entre a intensidade de luz transmitida depois de atravessar

uma solução colocada no aparelho - It - e a intensidade de luz na
ausência de amostra - I0 chama-se transmitância (T):

Ao log10 da razão inversa de T chama-se absorvância - A: A = log10

(I0/It) = -log10 T

A transmitância pode ter um valor entre 0 e 1 e é frequentemente

multiplicada por 100 sendo assim indicada como uma percentagem. A
absorvância traduz a quantidade de luz absorvida pela substância em
solução.

2. Leis da Absorção
2.1. Lei de Lambert

Para uma concentração baixa de soluto e para qualquer comprimento de

onda de luz considerado, a absorvância da solução é diretamente
proporcional à espessura do compartimento que contém a solução –
trajeto ótico da luz na amostra = l (expresso em cm).

A = k’ l

2.2. Lei de Beer

Para uma concentração baixa de soluto e para qualquer comprimento de

onda de luz considerado, a absorvância da solução é diretamente
proporcional à concentração do soluto = c.

A = k’’c

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Combinando as duas leis, a equação fundamental para a absorção da

luz passa a ser:

A = k l c

Em que a constante de proporcionalidade k constitui o chamado

coeficiente de extinção e é por isso representada por E:

A = E l c

Em que:
A (absorvância): adimensional, é uma razão entre valores
diferentes do mesmo parâmetro (intensidade luminosa).
l (trajeto ótico da luz): é representado em cm, corresponde à
largura da cuvete utilizada para a medição de absorvância que
é sempre igual a 1 cm.
E (coeficiente de extinção): as suas unidades terão que ser o
recíproco da concentração e o recíproco do comprimento:
- Se a concentração for expressa em g L-1, E vem expresso
em L g -1 cm-1;
- Se a concentração for expressa em molaridade (mol L-1)
o coeficiente de extinção é representado por Ɛ e designa-
se coeficiente de extinção molar. Ɛ virá expresso em L
mol-1 cm-1.

O coeficiente de extinção é uma constante característica de cada

espécie química dissolvida num determinado solvente e depende do
comprimento de onda da radiação incidente e da temperatura.

O coeficiente de extinção mais vulgarmente utilizado é o coeficiente

de extinção molar – Ɛ. Neste caso a lei de Lambert-Beer corresponde
a:

A = Ɛ l c

Olhando para esta expressão pode verificar-se que o coeficiente de

extinção molar de uma substância, para um determinado λ, corresponde
à absorvância de uma solução com a concentração 1M:

l = 1cm, c = 1M então A = Ɛ x 1 x 1, ou seja, A = Ɛ.

O coeficiente de extinção molar pode ser consultado em tabelas para

inúmeras substâncias e, assim, a partir da absorvância de soluções

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de concentração desconhecida, pode-se determinar facilmente a

respetiva concentração utilizando a lei de Lambert-Beer.

Em determinadas situações não é conveniente a expressão da

concentração em molaridade e não é possível recorrer a um Ɛ pré-
determinado:

 para moléculas poliméricas de tamanho variável ou de peso

molecular indefinido - caso de cadeias de DNA ou de
polissacarídeos;
 quando se deseja determinar a concentração, não de uma espécie
química, mas de uma classe de compostos (por exemplo, todos os
lípidos presentes numa amostra);
 quando se pretende medir uma concentração indiretamente através
de uma reação colorimétrica.

Nestes casos, a constante de proporcionalidade k tem que ser

determinada para cada situação. É necessário construir a reta que
representa a lei de Lambert-Beer a partir dos valores de absorvância
obtidos para soluções preparadas no laboratório com concentrações
conhecidas da substância em estudo. Esta reta é designada reta padrão
e a sua equação corresponde à lei de Lambert Beer para essa situação.
O declive da reta corresponde obviamente à constante de
proporcionalidade k. Para construir uma reta padrão são, portanto,
necessárias soluções com concentrações conhecidas – normalmente
designadas soluções padrão, e é necessário obter os respetivos
valores de absorvância. Estes valores são colocados num gráfico no
qual o eixo das abcissas representa a concentração – variável
independente – e o eixo das ordenadas a absorvância – variável
dependente. Desenha-se então a melhor reta que traduz a nuvem de
pontos tomando como ponto fixo a origem das coordenadas (Figura 3).

Alternativamente pode determinar-se a equação da melhor reta

representada pelo conjunto de pontos através dum método estatístico
de regressão linear.

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Fig. 3 Reta padrão com limite de linearidade.

3. Aplicações da espectrofotometria

As aplicações da espectrofotometria podem ser divididas em duas

categorias:

i. medição da absorvância a um determinado comprimento de onda.

Exemplo: utilização do coeficiente de extinção molar ou
construção de uma reta padrão para a determinação da
concentração de um determinado composto em solução.
ii. medição da variação da absorvância num intervalo de
comprimentos de onda. Exemplo: obtenção de um espectro de
absorção para identificação de biomoléculas. O espectro de
absorção de um composto é obtido medindo a absorvância a vários
comprimentos de onda e registando a absorvância em função do
comprimento de onda (figura 4).

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Fig. 4 Espectro de absorção da clorofila a e b.

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4. Doseamento de biomoléculas
4.1. Proteínas

O desenvolvimento de metodologias e estudos comparativos de

metodologias espectrofotométricas para a determinação de proteínas
totais sempre foram de grande interesse para profissionais, tanto
ligados à indústria de alimentos, laboratórios de análises clínicas,
como para investigadores de diversas áreas.

A quantificação total de proteínas engloba métodos tradicionais como

o ensaio do ácido bicinconínico (BCA), os métodos de Bradford e de
Lowry. Os reagentes são vendidos normalmente em kits, mais práticos,
desenvolvidos pelos fornecedores comerciais. As quantificações
envolvendo apenas uma proteína específica incluem o teste ELISA,
western blot, espectrometria de massa, entre outros.

4.2. Ensaios de quantificação de proteínas

A tabela 1 resume os principais ensaios de quantificação de

proteínas. Na escolha do ensaio é importante que se avaliem alguns
parâmetros para saber o mais adequado, como a compatibilidade do
ensaio com o tipo de amostra, a faixa de deteção, o volume da amostra,
ter um espectrofotómetro apropriado, o tempo e custo do ensaio, etc.

Tabela 1 Principais ensaios de quantificação de proteínas.

Ensaio Abs. Mecanismo Limite Vantagens Desvantagens

Incompatível
Baixos volumes com detergentes
Absorção de 0.1-
280 de amostra, e agentes
Absorção UV tirosina e 100
nm rápido, baixo desnaturantes,
triptofano µg/mL
custo alta
variabilidade

Compatível com
Redução do Praticamente
detergentes e
Ácido Cobre (Cu2+ 20- nenhuma
562 agentes
Bicinconínico para Cu+), o 2000 compatibilidade
nm desnaturantes,
(BCA) BCA reage µg/mL com agentes
baixa
com Cu+ redutores
variabilidade

Formação de
complexo Compatível com
Bradford/Azul 20-
595 entre o Azul agentes Incompatível
de Coomassie 2000
nm de Coomassie redutores, com detergentes
brilhante µg/mL
e as rápido
proteínas

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Redução do
cobre por
proteínas,
Incompatível
redução do
com detergentes
reagente 10- Alta
750 e agentes
Lowry Folin- 1000 sensibilidade e
nm redutores,
Ciocalteu µg/mL precisão
processo
pelo
demorado
complexo
proteínas-
cobre

4.3. Método de Bradford

O método de Bradford é uma técnica para a determinação de proteínas

totais que utiliza o corante de Coomassie brilliant blue BG-250.
Este método é baseado na interação entre o corante BG-250 e
macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias
laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, a interação entre
a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o
deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniónica, que
absorve fortemente a 595 nm. Esta interação entre o corante de
Coomassie com a proteína, causa uma visível mudança de coloração
inicialmente castanho para tons de azul, de acordo com a concentração
da proteína (figura 5).

Fig. 5 Reação de Bradford

4.3.1. Aplicações

O método de Bradford é mais rápido e sensível que o de Lowry e tem

sido utilizado para a determinação de proteínas totais em diversos

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meios: plasma ou soro sanguíneo, líquido cefalorraquidiano, saliva,

produtos alimentícios, leite, tecidos de plantas, suspensões de
células, avidina e estreptavidina, urina e detergentes.

Alguns autores recomendam o método de Bradford para a determinação

de proteínas totais em leite, líquido cefalorraquidiano e urina. No
entanto, com relação à urina, diversos autores destacam dois fatores
contra a utilização desta metodologia, sendo um deles a dependência
entre o número de diluições da amostra e o resultado da concentração
de proteína obtido e, o outro, a presença de proteínas de baixo peso
molecular, subestimando a concentração de proteínas totais na urina,
principalmente, de pacientes com proteinúria.

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III. Materiais e reagentes

Materiais e Equipamentos Reagentes

Materiais e equipamentos: Água destilada
Balões volumétricos, 20 mL e Albumina de Soro Bovino (BSA do
50 mL inglês Bovine Serum Albumin)
Cuvetes de plástico Reagente de Bradford
Eppendorfs
Gobelé
Micropipetas (P10, P100 e
P1000)
Pontas de micropipetas
Balança analítica
Espectro fotómetro

IV. Procedimento experimental

Parte 1: Determinação do espectro de atividade do complexo

albumina/azul de Coomassie

1. Colocar 500 L do reagente de Bradford (azul de Coomassie) em 2

cuvetes de plástico (identificar com 1 e 2).
2. Adicionar na cuvete 1 – 50 L de água destilada e na cuvete 2 –
50 L de uma solução a 0,5 mg/mL de BSA.
3. Homogeneizar com papel parafilme as duas cuvetes e esperar 5
minutos.
4. Regular o espectrofotómetro para a determinação de um espectro de
absorção entre 400 e 700 nm.

5. Traçar o espectro para ambas as soluções.

6. Analisar o os espectro e identificar o máximos de absorção.

Parte 2: Construção de uma reta padrão para a determinação de

proteínas

1. Preparar as soluções stock:

1.1. Solução de BSA 5 mg/mL.
1.2. Solução de BSA 1 mg/mL.

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2. Pipetar para tubos eppendorf, devidamente legendados, as

quantidades (em µL) indicadas na tabela seguinte:

Solução padrão 1 2 3 4 5 6 7
Volume de BSA (1 mg/mL), µL 10 20 30 40 50 100 -
Volume de BSA (5 mg/mL), µL - - - - - - 60
Volume de H2O, µL 90 80 70 60 50 0 40

3. Homogeneizar no vórtex.
4. Adicionar 500 µL do reagente de Bradford (azul de Coomassie) e
aguardar 5 minutos.
5. No espectrofotómetro:
5.1. Regular o equipamento para os 595 nm.
5.2. Zerar o equipamento com uma solução de BSA de concentração
0 mg/mL – branco.
5.3. Ler a absorvância de cada solução preparada no ponto 2 e
registar.

Parte 3: Determinação da quantidade de albumina numa amostra

1. Ler a absorvância das amostras 1 e 2 e registar.

2. Calcular a quantidade de albumina em cada uma das amostras.

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