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Espectrofotometria
Por Luiz Ricardo dos Santos

Categorias: Físico-química, Química

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Conteúdo deste artigo

Espectrofotometria de absorção no UV-Visível

Fundamento da espectrofotometria
Espectro eletromagnético representando os
comprimentos de onda correspondente a cada
radiação
Lei de Lambert-Beer
Análise espectrofotométrica
Cuidados em espectrofotometria

Espectrofotometria de
absorção no UV-Visível

A espectrofotometria pode ser definida como

toda técnica analítica que usa a luz para medir
as concentrações das soluções, através da
interação da luz com a matéria.

A palavra espectro de origem grega foi

empregada para nomear raios luminosos em
virtude de na antiguidade as pessoas
sepultarem seus mortos em covas rasas, e o
simples fato de alguém desavisado pisar em
cima, de uma dessas sepulturas fazia com que o
gás metano fosse expelido, visto que corpos em
decomposição liberam diversos gases, entre
eles o metano, que apresenta uma propriedade
de auto inflamar-se apresentando um aspecto
luminoso intenso. Quando alguém era
surpreendido por uma bola gasosa dessa ficava
assustado e dizia estar sendo assustado por um
fantasma que em grego é espectro.

Fundamento da
espectrofotometria

A luz de uma maneira geral é mais bem descrita

como sendo uma radiação eletromagnética em
virtude de sua natureza dualística. Ou seja, ela
existe e tem um comportamento de campos
elétricos e magnéticos oscilantes como a figura
abaixo representa:

OndaEletromagnética
Campo
Elétrico(E)
Санро
Magnético(B)
Direçãode
propagação
de(A)
onda

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Onde:

O comprimento de onda (λ) é distancia em

metros, de um pico ao outro da onda;

A frequência (v) é o grau de oscilação das

ondas, em função da velocidade da luz no vácuo
que é representada pela constante c (c=2,
998x108m. s-1). De modo que:

λ.v=c

Espectro eletromagnético
representando os
comprimentos de
onda correspondente a cada
radiação

A técnica espectroscópica é baseada na no

aumento de energia em função do aumento da
frequência da radiação incidida. Quando uma
espécie química absorve energia na forma de
fótons, seus elétrons ficam excitados e ocorre
uma transição de um orbital de mais baixa
energia para outro de maior energia. Um
exemplo disso são compostos químicos que
apresentam duplas ligações C=C no benzeno e
C=O, a carbonila, por exemplo.

Benzeno

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As cetonas da ligação peptídica

O aumento de energia é representado pela

condição de frequência de Bohr:

E = hv

Onde:

E é a energia que aumenta em função da

frequência, e h é a constante de Planck
h=6,626x10-34J.s.

A transição eletrônica de duplas ligações, ocorre

em virtude de uma ligação dupla ser formada
por um orbital sigma (σ) e um orbital (π), de
modo que o elétron que está no orbital pi ligante
vai para o orbital pi antiligante que tem maior
energia. (para detalhes maiores vide teoria do
orbital molecular). A transição nas C=C é na
C=O é representada na figura abaixo, essa
espécies químicas são denominadas
cromóforos ou substâncias que trazem a cor:

Para C=C : π-π*

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Para C=O : (orbital não-ligante) n-π*

Reposição p/
Detectores
Aminoácidos como a Fenilalanina, Tirosina e
Gases
Triptofano são os principais responsáveis pela
absorçãoVendas
de luz de
dasDetectores devirtude de
proteínas em
Gases
possuírem o anel benzênico em sua estrutura
química,Testes
além de
da Respostas
ligação peptídica listada
acima. ABump-Tes Manutenção
luz é absorvida na faixa de em
280nm.
Detectores de Gases;
Substituição de Peças.
Lei de Lambert-Beer
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A “força vital” da espectrofotometria está
fundamentada na lei de Lambert-Beer, que
estabelece:

ABRIR
“A absorbância é diretamente proporcional
a concentração da solução de amostra.”

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Ou:
Log(I/I0)=εcl
A= εcl

Onde :
A é a absorbância,
ε é o coeficinte de extinção molar e
l é o comprimento da cubeta.

Os componentes principais de um
espectrofotômetro são apresentados e suas
respectivas funções:

Fonte de Luz: é composta por uma lâmpada de

deutério e uma lâmpada de tungstênio
(semelhante à lâmpada de carro). A lâmpada de
deutério emite radiação UV e a de tungstênio
emite luz visível.

Monocromador: alguns espectrofotômetros

ainda possuem um prisma como monocromador,
porém os mais modernos possuem dispositivos
eletrônicos que transformam a luz incidida em
vários comprimentos de onda, em um só
comprimento, ou seja, a luz monocromática.

Cubeta: é o
recipiente
propício para
conter a amostra
que será utilizada
na análise, as
cubetas podem
ser de quartzo,
vidro e acrílico,
Cubetas utilizadas em
porém espectrofotometria.
recomenda-se Geralmente usa-se cubeta
de 1 cm, a fim de facilitar os
que seja usada
cálculos da Lei de Lambert-
uma cubeta de Beer.
quartzo por que o
vidro e o plástico
absorvem UV e causa a reflexão da luz visível.

Detector: o detector é um dispositivo que

detecta a fração de luz que passou pela amostra
e transfere para o visor e para o computador
acoplado ao aparelho.

Análise espectrofotométrica

Passo 1: a amostra deve ser preparada com a

quebra da amostra por métodos mecânicos,
químicos ou físicos;

Passo 2: a amostra é solubilizada no solvente

escolhido em um balão volumétrico limpo e
seco;

IMPORTANTE: o solvente na maioria das vezes

é água, porém, quando tratar-se de amostras
apolares que precisam ser diluídas em solvente
orgânico nunca utilize alcenos, alcinos, cetonas
ou qualquer outro que tenha ligações C=C ou
C=O ou triplas.

Passo 3: em uma cubeta é colocado o solvente

puro e lido no comprimento de onda o mesmo
que será lida a amostra, esse procedimento é
chamado leitura em branco, e tem como
finalidade minimizar os erros causados, pela
absorção luz ocasionados pelo vidro e pela
água;

Passo 4: a amostra é filtrada em uma

membrana de 0,2 µm, por que a solução deve
estar totalmente límpida a fim de diminuir ao
máximo o erro causado por partículas em
suspensão, a cubeta contendo o branco e
retirado do equipamento e sua absorção
anotada. Após esse processo a solução de
interesse é lida, e dessa absorbância é
subtraído a leitura do branco.

Cuidados em
espectrofotometria

É imprescindível que o equipamento seja

calibrado e manuseado de acordo com as
instruções do fabricante, por ele já traz a
margem de erro que o aparelho tem;
Evitar erros de leitura certificar-se de que o
equipamento esteja fechado. Antes da leitura
a luz do ambiente pode interferir no resultado;
Manter sempre limpo e fechado a fim de evitar
o acumulo de partículas de poeira que
interferem na análise. Em hipótese alguma
toque a cubeta com as mãos sem luvas, a
nossa mão contém gorduras e interferem na
leitura.
Só podem ser analisados por
espectrofotometria de absorção compostos
que absorvem luz.
Em caso de soluções fortemente coloridas
como permangantos, complexos altamente
coloridos, dicromatos, cromatos e outros
compostos com cores altamente acentuadas
deverão ser feitas no mínimo 5 diluições de
concentração conhecida e lidas no
espectrofotômetro e uma curva analítica
deverá ser traçada afim de determinar o
coeficiente de extinção molar. Soluções muito
concentradas tendem provocar erros de leitura
por que existem muitas moléculas próximas
umas das outras.

Bibilografia:
Harris, Daniel C.; Análise Química
Quantitativa;tradução Carlos Alberto Riehl...[et
al.].5.ed. LTC Editora, Rio de Janeiro:1999.
cp.19,20,21.

Lenhinger, Albert Lester; Princípios de

Bioquímica.3.ed. Guanabara Koogan, Rio de
Janeiro:1992. cp.3.

Fundamentos de Química Analítica - West,

Donald M.; Holler, F. James; Skoog, Douglas A.

Jones, Loretta; Atkins, Peter Princípios de

Química - Questionando a Vida Moderna e o
Meio Ambiente - 3 ª Ed-Porto Alegre:Bookman,
2006.

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