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Automação Livre para Laboratórios com Linux - AL3

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15. Espectrofotometria
Vamos mostrar o desenvolvimento de uma interface gráfica para aquisição automática das
leituras de um espectrofotômetro.

Para quem já conhece os fundamentos da espectrofotometria e os tipos de espectrofotômetros,

pode economizar tempo e ir direto para a seção "Automação".

15.1. Fundamentos
15.1.1. Natureza Eletromagnética da Luz

A ligação entre luz, eletricidade e magnetismo foi sendo concebida ao longo do tempo através de
sucessivas descobertas.

O astrônomo William Herschel, investigando a relação entre luz e calor utilizando um termômetro
e um prisma, descobriu que a temperatura era maior em uma região além da região do vermelho
no espectro de cores da luz visível. Herschel sugeriu que deveria haver "algum tipo de luz" que
não era perceptível ao olho humano.

15.1.2. Radiação Eletromagnética

O termo, radiação eletromagnética, proposto por James Clerk Maxwell, designa as características
elétricas e magnéticas características a todas as formas de enegia ondulatória da qual a luz
visível representa apenas uma pequena fração.

Figura 78. Espectro Eletromagnético.

A medida padrão para o comprimento de onda (λ) costuma ser feita em nanômetro (10-9 m) e
definida como a distância entre dois picos (ou vales) sucessivos.

A freqüência (f) corresponde ao número de ciclos (comprimentos de onda) que passam por um
dado ponto por segundo e expressa comumente em Hz ou cps (ciclos por segundo).

Figura 79. Onda Eletromagnética.

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Essas grandezas estão relacionadas entre si e com a velocidade da luz (c) pela seguinte relação:
c=λxf

15.1.3. Cores

A cor é relacionada com os diferentes comprimento de onda do espectro eletromagnético.

(Fonte: Wikipedia)

Figura 80. Comprimento de onda e as cores.

Tabela 5. Faixas do Espectro Visível

Comprimento de Onda (nm) Cor

340-400 Ultravioleta próximo (Invisível)
400-430 Violeta
430-500 Azul
500-570 Verde
570-620 Amarelo - Laranja
620-670 Vermelho claro

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Comprimento de Onda (nm) Cor

670-750 Vermelho escuro
750 Infravermelho próximo (Invisível)

15.1.4. Absorção de Luz

É a absorção seletiva de luz visível que determina a cor exibida pela maior parte das
substâncias. Quando uma amostra de matéria absorve praticamente toda a gama de radiações
visíveis, não transmitindo nem refletindo luz, então ela apresenta-se-nos preta. Se, pelo
contrário, praticamente nada absorve de luz visível, tudo transmitindo ou refletindo da luz
incidente, então trata-se de uma substância incolor (se essencialmente transmite luz recebida)
ou branca (se essencialmente a reflete). Entre estes dois casos extremos situam-se as
substâncias ou materiais corados. A percepção de cor é o resultado da absorção seletiva de
diferentes comprimentos de onda. (Fonte: http://www.angelfire.com/ab/prvs/absor.html

Figura 81. Conjunto dos comprimentos de onda correspondentes ao espectro de emissão

de uma lâmpada de tungstênio-halogênio (luz branca)(Fonte: Site da Profa. Deborah H. M.
Bastos)

Figura 82. Região espectral transmitida por uma solução aquosa de azul de bromotimol
10-5molar (laranja!) e o respectivo espectro de absorção.(Fonte: Site da Profa. Deborah H.
M. Bastos)

Figura 83. Região espectral transmitida por uma solução de solução etanólica (amarela) de
fluoresceína 10-5 molar e o respectivo espectro de absorção.(Fonte: Site da Profa. Deborah
H. M. Bastos)

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15.1.5. Lei de Lambert-Beer

A figura abaixo mostra um feixe de radiação monocromática de Potência P00 incidindo sobre uma
solução, o qual, após os processos internos de absorção sai da solução com uma potência
radiante P.

Figura 84. Diagrama da absorção de um feixe de luz "monocromática" atravessando uma

cubeta de tamanho b.(Fonte: Wikipedia)

A quantidade de radiação absorvida pode ser calculada de diferentes maneiras, Transmitância

ou Absorbância:

Transmitância, T = P/P0

T(%) = 100 x T

Absorbância, A = log10 P0/P

A = log 10 1/T

Figura 85. Para uma solução com transmitância de 100% a Absorbância é zero ese toda a
luz for absorvida a transmitância é 0 e a absorbância é infinita!

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A lei de Lambert-Beer pode ser expressa pela equação:

A = ebc

A - é a absorbância (adimensional, A = log 10 P0/P),

e - absortividade molar ou coeficiente de extinção molar (L mol-1 cm-1)

c - concentração do analito na solução (mol L-1)

Atenção
Por que se usa a Absorbância ao invés da Transmitância em análises quantitativas?

Porque, (até um limite de concentração) existe uma relação linear entre a absorbância e a
concentração da substância absorvente. Portanto, mantendo-se o caminho óptico constante,
pode-se determinar a concentração de uma espécie em solução, através da medida de
absorbância.

Figura 86. Gráficos da relação de Transmitância e Absorbância para diferentes

concentrações de permanganato de potássio.

Na prática, um gráfico de calibração (absorbância versus concentração), da espécie de interesse

é construída com o uso de soluções padrão (de concentração conhecida) e a concentração da
amostra que se quer analisar é determinada pela interpolação da leitura de absorbância no
gráfico de calibração.

No entanto a relação não é linear para altas concentrações. Por isso é importante definir a faixa
de concentração adequada para medidas quantitativas, na qual a relação entre absorbância e
concentração é linear.

Figura 87. Desvio da Lei de Beer em altas concentrações

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Atenção
Por isso uma regra prática em Química Analítica é evitar fazer leituras com
absorbância maior que 1, ou seja, construir a curva de calibração com valores de
absorbância menor que 1.

Qual o significado de "e" na equação A = ebc ?

Rearranjando:

e = A / bc

"e" é a absortividade molar e pode ser definida como a quantidade de luz que é absorvida por
unidade de concentração.

É constante para uma determinada substância.

Para se ter uma idéia, a absortividade molar dos íons Cu+2 em solução de sulfato de cobre
(CuSO4) é 20 L mol-1 cm-1 enquanto o β-caroteno, responsável pela cor das cenouras, possui
uma absortividade molar de 100.000 L mol -1 cm-1.

Fiz uma introdução muito sucinta da espectrofotometria de absorção molecular. Agora vamos
fazer um breve resumo da instrumentação usada.

15.2. Instrumentos
15.2.1. Espectrofotômetros de Absorção

A concepção física de um espectrofotômetro para absorção é diferente de um espectrofotômetro

para luminescência, o qual é denominado espectrofluorímetro. Além disso estaremos nos
referindo a equipamentos operando na região espectral do visível (Vis) (380-400 nm < λ <
700-800 nm) e do ultravioleta (UV) (200 < λ < 380-400 nm).

Não vamos abordar os equipamentos que operam na região do infravermelho próximo (do inglês,
near infrared - NIR) (800 nm < λ < 3300 nm).

Espectrofotômetros de absorção, em geral, são instrumentos compostos por:

fonte de radiação eletromagnética (luz),

sistema óptico que leva a radiação até a amostra,

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compartimento de amostra,

detectores que medem a intensidade de radiação.

15.2.2. Fontes de Radiação

As fontes de radiação podem ser lâmpadas de filamento ou LEDs que emitem radiação na região
do espectro que se pretende utilizar.

Características ideais:

intensidade constante ao longo da faixa de trabalho

pouco ruído (pouca oscilação na intensidade)

longa durabilidade

O espectrofotômetros têm, normalmente, dois tipos de fontes:

lâmpadas de deutério (tempo de vida: 1.000 h), para excitação na região do ultravioleta (<
350 nm)

lâmpadas de tungstênio ou tungstênio-halogênio (>350 nm; tempo de vida 10.000 h) para

excitação na região do visível e infravermelho próximo.

Diodo Emissor de Luz LED

Figura 88. Espectro emissão de uma lâmpada de deutério.

Figura 89. Espectro emissão de uma lâmpada de tungstênio.

Com respeito às lâmpadas é importante lembrar que com o tempo de uso das lâmpadas

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aumentam as variações na intensidade da luz introduzindo ruídos (erros) nas determinações os

quais podem ser monitorados com a adoção de procedimentos de controle de qualidade. (A ser
discutido em outro documento!)

Atenção
Uma outra questão prática é o fato de que a maioria dos procedimentos analíticos
para águas e efluentes utiliza a região visível do espectro. No entanto é muito comum
a compra de espectrofotômetros UV-Vis, mais caros, e cubetas de quartzo, mas que
serão utilizados apenas para leituras na região do Visível (380-400 < λ < 700-800 nm)!

15.2.3. Sistema Óptico

Dependendo dos tipos de componentes ópticos, os espectrofotômetros são classificados em:

dispersivos, com prismas ou grades e os interferométricos.

Elementos dispersivos são aqueles que difratam a luz, como por exemplo prismas e grades de
difração.

Elementos interferométricos utilizam processos de interferência da radiação eletromagnética,

como por exemplo o interferômetro de Michelson, que é utilizado nos espectrofotômetros
operando na região do infravermelho com o uso da transformada de Fourier do sinal.

A finalidade destes componentes é difratar a luz de modo que diferentes comprimentos de onda
irão incidir sobre a amostra permitindo que se determine sua absorbância para os diferentes
comprimentos de onda.

Uma grade de difração contém uma série de ranhuras, responsáveis pela difração. Quanto maior
o número de ranhuras por milímetro melhor a resolução dos espectros.

Figura 90. Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por um prisma.(Fonte: Site da
Profa. Deborah H. M. Bastos)

Figura 91. Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por uma grade de difração.
(Fonte: Site da Profa. Deborah H. M. Bastos)

15.2.4. Detectores

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Considerando-se apenas os sistemas que usam grade de difração, podemos dividir os

espectrofotômetros em duas classes: os que utilizam como sistema de detecção um tubo
fotomultiplicador e os que utilizam arranjo de diodos.

15.2.4.1. Fotomultiplicadora

Um tubo fotomultiplicador é formado por um tubo de vidro ou de quartzo sob vácuo, no qual
existe um conjunto de placas metálicas interligadas.

Figura 92. Ao lado, um esquema e uma fotografia do tubo fotomultiplicador HAMAMATSU

- R928, utilizado no espectrofotômetro Cary 2300 - Varian.

Quando a radiação incide sobre estas placas metálicas elas induzem uma corrente elétrica,
devido ao efeito fotoelétrico proposto por Einstein. Esta "fotocorrente" é amplificada por um
circuito eletrônico e registrado.

As fotomultiplicadoras, apresentam sensibilidades que dependem da faixa espectral da radiação

incidente.

Com o uso deste tipo de detector, o sistema óptico deve selecionar cada comprimento de onda,
seqüencialmente, que deve incidir sobre a fotomultiplicadora gerando, segundo uma certa
escala, um sinal de absorbância.

Atenção
É importante lembrar que ao abrir o compartimento de um espectrofotômetro, a
fotomultiplicadora deve ser protegida da luz para que não seja queimada.

15.2.4.2. Arranjo de Diodos

O segundo tipo de detector é arranjo de diodos ou detectores do tipo fotodiodo, PDA (photodiode
array).

De modo simplificado, um arranjo de diodos consiste em uma série de detectores fotodiodo

posicionado lado a lado em um cristal de silício, de modo que cada comprimento de onda
difratado pela grade atinge um ponto deste arranjo, e conseqüentemente um detector. Deste
modo, a absorbância em todos os comprimentos de onda é determinada de modo simultâneo.

Figura 93. Visão lateral de um fotodiodo. (Fonte: http://parts.digikey.com)

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15.2.4.3. CCD

Além dos arranjos de diodos existem os detectores CCD (charge-coupled device), os quais
também permitem detecção simultânea de todo o espectro de absorção. Assim como no arranjo
de diodos a luz dispersada pela grade atravessa a amostra e os diferentes comprimentos de
onda atingem os diferentes pixels do detector.

A resolução depende da grade, do projeto do espectrofotômetro e do tamanho de cada pixel do

detector. Esses instrumentos costuman ser relativamente pequenos permitindo separar o
sistema óptico do compartimento de amostra com o uso de fibras ópticas que transmitem a luz
para/da amostra.

Figura 94. Exemplo de um espectrofotômetro com detector CCD da Ocean Optics

(USB2000) com dimensões de 8.9 cm x 6.3 cm x 3.4 cm e pesando 190 g (Fonte:
www.oceanoptics.com)

15.2.5. Configuração

15.2.5.1. Espectrofotômetro de Feixe Simples

O procedimento experimental convencional de obtenção de espectros de absorção em um

instrumento deste tipo envolve inicialmente o registro de um espectro do ruído de fundo
(background) ou do solvente ou do ar (a serem utilizados como branco). Arquiva-se o mesmo e,

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em seqüência, se obtém o espectro da amostra e se efetua a subtração dos dois. O resultado

deve ser o espectro da amostra tendo-se o solvente (ou ar) como branco.

Figura 95. Diagrama esquemático de um espectrofotômetro de Feixe Simples

O procedimento de calibração consiste em ajustar o nível de 100% de transmitância (zero de

absorbância) do equipamento com uma cubeta contendo todos os componentes da solução a
ser medida, menos a substância de interesse ("branco"), e o nível 0% de transmitância com o
obturador do aparelho fechado.

As leituras das amostras serão feitas em relação ao branco, substituindo-o pelas amostras.

15.2.5.2. Espectrofotômetro de Duplo Feixe

Na configuração de duplo feixe é necessário um componente denominado obturador

eletromecânico (chopper), que tem a finalidade de alternar a passagem da luz pela cela de
amostra e referências.

Os sinais elétricos gerados pelos detectores são amplificados e "comparados" pelo sistema
eletrônico gerando um espectro de absorbância ou transmitância da amostra "subtraído" do
espectro da referência.

Figura 96. Diagrama esquemático de um espectrofotômetro de Duplo Feixe

Para equipamentos de duplo feixe, a radiação proveniente do monocromador é igualmente

dividida em dois feixes, que incidem em dois compartimentos, o de referência e o da amostra. O
ajuste inicial é feito colocando-se o "branco" nos dois compartimentos e regulando-se o aparelho
para absorbância zero, e as leituras são feitas substituindo-se o "branco" do compartimento da
amostra pelas amostras a serem medidas. O usuário deverá ler atentamente o manual do seu
equipamento para se informar sobre os demais detalhes operacionais.

15.2.6. Cubetas

Todo espectrofotômetro deve possuir um compartimento para acomodar a cubeta ou cela de

leitura.

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Os compartimentos podem dispor de recursos para termostatização da cubeta permitindo

realizar medidas de absorção em diferentes temperaturas.

Figura 97. Compartimento para cubeta do espectrofotômetro Femto 600S

Figura 98. Existem cubetas com diferentes geometrias para diferentes finalidades.

15.2.7. Celas de Fluxo

Para os métodos de análise em fluxo são usadas celas de fluxo nas quais a amostra circula
continuamente através da cela com leitura simultânea da Absorbância ou Transmitância.

Figura 99. Os fabricantes fornecem celas de fluxo com diferentes geometrias e caminho
óptico.(Fonte: www.starna.com)

Figura 100. Exemplo da cela de fluxo Hellma 178.711-OS, com 1 cm de caminho óptico,
30µL de volume, transmitância de 80% na região de 320-2500nm.(Fonte: Helma)

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Com o uso de fibras ópticas é possível manter o compartimento de leitura com a cela de fluxo
separada do conjunto do espectrofotômetro oferecendo maior versatilidade para o sistema de
análise.

Figura 101. Cela de fluxo em Z, com janela de sílica fundida.(Fonte:

www.flowinjection.com)

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espectrofotômetro - I

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