Práticas em Bioquímica I

Prof.Dr. Israel José Pereira Garcia

Bioquímica – 4ºPeríodo
Espectrofotometria

Introdução:
Noções teóricas de fotometria:
As ondas eletromagnéticas transportam energia e, quanto maior for a frequência
da onda, maior será a energia transportada por ela. Observe atentamente o
esquema do espectro de luz visível. Perceba que há diferenças na frequência
das diversas ondas de luz visível. Assim, as ondas de luz colorida transportam
diferentes quantidades de energia, dependendo da sua cor. Se fizermos a luz de
uma lâmpada comum (de filamento incandescente) passar através de um
prisma, ela será decomposta em várias cores, questão popularmente
conhecidas como arco-íris. Cientificamente, o que se obtém é chamado de
espectro da luz visível.
Os primeiros estudos sobre biomoléculas foram realizados envolvendo a sua
interação com a luz. A zona de espectro eletromagnético correspondente ao
espectro visível vai de 400 a 750nm. Abaixo de 400nm corresponde à faixa
ultravioleta e acima de 750nm, à região infravermelha. A análise fotométrica é
uma das maneiras mais usadas para determinar a concentração de soluções de
compostos biologicamente importantes. É um dos métodos mais comumente
empregados nas análises de amostras em bioquímica clínica.
Faixa de Cores Faixa de comprimento de onda
em nanômetros
Raio-X e Radiações nucleares (invisível) 0-8nm
Ultravioleta no vácuo (invisível) 8-180nm
Ultravioleta (invisível) 180-400nm
Violeta 400-450nm
Azul 450-500nm
Verde 500-750nm
 Amarelo 570-590nm
Alaranjado 590-620nm
Vermelho 620-750nm
Infravermelho (invisível) 750-100.000nm
Microonda 100.000-1.000.000

Lei de Lambert-Beer:
Se um raio de luz monocromática atravessar a solução de uma substância
capaz de absorver energia desse comprimento de onda, uma parte da luz que
incide sobre a solução é absorvida e não emerge do outro lado. Chama-se
transmitância (T) a razão entre a intensidade da luz emergente (I) e a
intensidade da luz incidente (Io): T = I/Io.

A transmitância de uma solução de substância que absorve a luz depende dos

seguintes fatores: natureza da substância, concentração da substância e
espessura da solução atravessada pela luz. Essa dependência é descrita
 quantitativamente pela lei de Beer:

T = 10-kce
onde:
k = constante de absortividade molar (própria de cada cromóforo, num dado
comprimento de onda)
c = concentração
e = espessura da cubeta (amostra)

Aplicando-se a função – log nessa equação temos:

-log T = A = k.c.e

O valor de –log T é chamado de absorbância (A). Portanto, segundo a lei de

Beer, uma solução de substância que absorve luz de determinado comprimento
de onda tem absorbância diretamente proporcional à concentração do
cromóforo:

A = c (e =1)

Esta lei é a base da determinação fotométrica da concentração de soluções.

Medida fotométrica
❖ A determinação da transmitância ou absorbância de uma solução é feita através
da passagem de luz (na faixa de comprimento de onda desejada) por uma
cubeta que contém a solução em estudo e que incide sobre uma célula
fotoelétrica, que traduz a intensidade luminosa por um sinal elétrico, detectado
por um galvanômetro.
❖ Ao dosar qualquer substância (proteínas, carboidratos) precisamos de uma
curva padrão, que represente seu parâmetro e de um controle, tubo sem
amostra. A curva padrão deveria ser realizada em duplicata ou triplicata de
forma minimizar os erros.
 Objetivos:
✓ Compreender o conceito de soluções e suas concentrações.
✓ Efetuar diluição de soluções.

Técnica:
Diluir a solução estoque de sulfato de cobre 0,25 mol/L, a fim de obter 5 mL de
solução nas concentrações indicadas abaixo:

Tubos [ ] CuSO4 Volume Volume de A 805 nm

CuSO4 Água destilada
0,25mol/L

Tubo 1 0,01 mol/L

Tubo 2 0,02 mol/L

Tubo 3 0,035 mol/L

Tubo 4 0,07 mol/L

Tubo 5 0,10 mol/L

Tubo 6 0,15 mol/L

Amostra1 - - -

Amostra - - -
2

➢ Calibrar o aparelho espectrofotômetro em 805 nm, utilizando água

destilada como branco;
➢ Efetuar a leitura das soluções preparadas;
➢ Fazer a leitura da amostra;
➢ Construir um gráfico de curva padrão relacionando os valores de
absorbância com as respectivas concentrações das soluções diluídas de
sulfato de cobre;
➢ Calcular a concentração da amostra.