Ministério da Educação

Secretaria de Educação Profissional e Tecnológica

Instituto Federal Goiano Campus Urutaí

ESPECTROFOTOMETRIA

Discente: Nathália Taynar Nascimento de Souza

Disciplina: Química Analítica Instrumental
Doscente: Prof. Dr. Pamela Oliveira
 ESPECTROFOTOMETRIA
o É um método de análise quantitativa instrumental mais
usado nas investigações biológicas e físico-químicas.

o Método de análise óptico baseado em medidas de

absorção de radiação eletromagnética.

o Espectrofotometria Óptica

o Comprimento de onda corresponde à luz visível ou ultra-

violeta:

• faixa entre aproximadamente 180ª 800nm                           

            
2
 ESPECTROFOTOMETRIA

o Quando a luz atravessa uma substância, parte da

energia é absorvida absorvância.

o A cor das substâncias se deve a absorção de certos

comprimentos de ondas da luz branca que incide
sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos
apenas aqueles comprimentos de ondas não
absorvidos transmitância.                                                  

3
• O espectrofotômetro é um instrumento que permite comparar a radiação
absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma quantidade
desconhecida de soluto. Espectrofotômetro
• Função de medir e comparar a quantidade de luz (energia radiante) absorvida por
uma determinada solução.
• Ou seja, medir a concentração de substâncias, que absorvem energia radiante,
em um solvente.

4
• A base da espectrofotometria, portanto é passar um feixe de luz através da
amostra e fazer a medição da intensidade da luz que atinge o detector. O
espectrofotômetro compara quantitativamente a fração de luz que passa
através de uma solução de referência e uma solução de teste;

• Um recipiente para colocar a amostra a ser analisada (a amostra deve estar

em recipientes apropriados como as cubetas e tubos de ensaio);

• Um seletor de faixa espectral (monocromatizadores como os prismas, que

seleciona o comprimento de onda da luz que passa através da solução de
teste); Um recipiente para colocar a amostra a ser analisada (a amostra deve
estar em recipientes apropriados como as cubetas e tubos de ensaio);

• Um detector de radiação, que permite uma medida relativa da intensidade da

luz.
5
Esquema do funcionamento interno de um espectrofotômetro

6
 OS PRINCIPAIS COMPONENTES DE UM
ESPECTROFOTÔMETRO
• Fonte de Luz: é composta por uma lâmpada de deutério e uma lâmpada de tungstênio. A
lâmpada de deutério emite radiação UV e a de tungstênio emite luz visível.

• Monocromador: alguns equipamentos ainda possuem um prisma como monocromador,

porém, os mais modernos possuem dispositivos eletrônicos que transformam a luz incidida
em vários comprimentos de onda em um único comprimento de onda, ou seja, luz
monocromática.

• Detector: é um dispositivo que detecta a fração de luz que passou pela amostra e transfere
para o visor e para o computador acoplado ao aparelho.

• Amostras: só podem ser analisados por espectrofotometria de absorção compostos que

absorvem luz. Em caso de soluções fortemente coloridas como permanganato, dicromatos,
cromatos e outros compostos com cores altamente acentuadas deverão ser feitas, no
mínimo, 5 diluições.

• Cubeta / Recipiente: é um pequeno recipiente utilizado para conter o material a ser

analisado. As cubetas podem ser quadradas, retangulares ou redondas e são constituídas de
vidro, sílica (quartzo) ou plásticas.

7
 Fontes Luminosas

Luz UV (180 a 400 nm)

Luz Visível (400 a 800 nm)
– Tungstênio
– Lâmpada de gás
hidrogênio

– Mercúrio

Espectro da radiação eletromagnética

8
 CORES EM ESPECTROFOTOMETRIA

A luz é uma forma de radiação eletromagnética que possui características de onda e de

partícula (fóton). Os diferentes elementos absorvem energia em comprimentos de onda
específicos.

A cor de uma solução está relacionada ao comprimento de onda complementar ao

apresentado. Portanto, uma solução aparece como branca porque transmite luzes de todas
as cores.

Quando absorve luzes de todas as cores, a solução é preta. Finalmente, a solução é verde
quando absorve luz vermelha e transmite luz verde (amarelo + azul), denominada de cor
complementar.

As radiações eletromagnéticas com comprimento de onda entre 380 e 780 nm são visíveis
ao olho humano. Abaixo de 380 nm é denominada ultravioleta (UV) e acima de 780 nm
correspondem à zona infravermelha.

9
Relação entre comprimento de onda e as
características de cor:
Comprimento de onda Cor absorvida Cor complementar

abaixo de 380 nm ultravioleta

380 a 435 nm violeta verde-amarelado

435 a 480 nm azul amarelo

480 a 490 nm azul-esverdeado laranja

490 a 500 nm verde-azulado vermelho

500 a 560 nm verde púrpura

560 a 580 nm verde-amarelado violeta

580 a 595 nm amarelo azul

595 a 650 nm laranja azul-esverdeado

650 a 780 nm vermelho verde-azulado

acima de 780 nm infravermelho

10
 Cubetas

• Espectrofotometria de Luz Visível

– Cubeta de Vidro ou Plástico
                  

• Espectrofotometria de Luz Ultra- Violeta

– Cubeta de Quartzo

11
 Cubetas
• A cubeta, também chamada de célula, é o recipiente que contém a
amostra, utilizada para permitir a leitura óptica.

•     As    cubetas
             de
     espectrofotômetro
    são fabricadas em uma variedade de
materiais para suportar diferentes padrões de comprimento de onda e
requisitos do caminho óptico. As cubetas podem ser de quartzo ou vidro
(reutilizáveis) e ainda de acrílico (descartável), sendo empregadas
dependendo de qual é a faixa o espectro a ser analisada.

• A de quartzo é usada para a região ultravioleta do espectro, já o vidro é

usado para a faixa visível e a cubeta de acrílico, para ensaios rápidos e
menos exigentes.

12
 Cubetas
• É preciso ter cuidado ao manusear as cubetas, mesmo uma ligeira
impressão digital pode interferir nos resultados. É muito importante não
tocar na superfície óptica da cubeta, pois óleos de sua pele, partículas de
     tecidos
           de
     limpeza,
            poeira e outros contaminantes podem afetar as
leituras.

• A utilização e limpeza corretas são a base de qualquer análise

espectrofotométrica, ajudando a evitar erros de medição.
• As cubetas não devem ser secas por aquecimento em uma estufa ou
chama porque isso pode provocar danos físicos e/ou mudar o caminho
óptico.

13
 PADRÃO BRANCO EM ESPECTROFOTOMETRIA
• Quando um feixe de luz monocromática atravessa uma
cubeta de espectrofotômetro, parte da luz sofre refração,
reflexão, absorção pelos reagentes e outras interações
     indesejáveis.
               

• Para eliminar tais interferências, deve-se zerar o

aparelho com uma solução que é denominada “branco”.

• O branco deve conter todos os constituintes do sistema,

exceto a amostra a ser estudada. A cada conjunto de
determinações, bem como após alterar o comprimento
de onda, o aparelho deve ser sempre zerado e calibrado
com o tubo que contém o branco.

14
 Absorção de Radiação
• Vários fenômenos podem ocorrer com a
radiação luminosa, como: reflexão, refração,
espalhamento ou ser absorvida pelo material.

                                                        

15
 Absorção de Radiação
• O comprimento de onda que uma certa substância absorverá a
radiação luminosa é característico da sua estrutura, diferindo de
substância para substância
• Ex:
– DNA e RNA = 260 nm
– Proteínas = 280 nm
– Azul de metileno = 660 nm

16
 Transmitância

• Transmitância é a fração da luz incidente em um

comprimento de onda específico, que atravessa uma
amostra de matéria.

                                                                                                                           
                        

17
 Absorvância

• É a fração da energia luminosa que é absorvida por um determinado material.

A = - log10 T
                                                                                                                   
                                

18
 Lei de Lambert-Beer
                                  
• A absorvância é proporcional à concentração da espécie
química absorvente, sendo constantes o comprimento de
onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e
demais fatores.

• Por meio dessa lei, intensidades da radiação incidente e

emergente podem ser relacionadas com as concentrações
do material presente na solução.

• Efeitos de reflexão, refração e espalhamento não são

considerados nessa lei.

• A radiação incidente deve ser monocromática

19
 = intensidade da radiação incidente

• I = intensidade transmitida pela amostra

• l = comprimento

             

                                    
20
 TÉCNICAS QUE UTILIZAM A DETECÇÃO UV-VISÍVEL

• ANÁLISE POR INJEÇÃO EM FLUXO (FIA)

• CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ATA

EFICIÊNCIA (HPLC)

• ELETROFORESE CAPILAR (CE)

             

                                     21
 Uso e aplicação da espectrofotometria

• Espectrofotometria é uma ferramenta importante e versátil amplamente

utilizada para a análise em diversas áreas como química, física,
biologia, bioquímica, materiais, engenharia química e aplicações
clínicas e industriais.

• Dentre as diversas aplicações o espectrofotômetro é usado para medir

determinados ingredientes em uma droga, medir o crescimento
bacteriano, ou diagnosticar um paciente com base na quantidade de
ácido úrico presente em sua urina. Sendo que as análises podem ser
quantitativas (identificação da concentração da substância) e
qualitativas (identificação de uma substância desconhecida), já que
cada substância irá refletir e absorver a luz de forma diferente.

22
 Referências:
Skoog, D.A.; Holler, F.J. & Nieman, T.A. – Princípios (Fundamentos) de
Análise Instrumental,

Harris, D.C. - "Análise Química Quantitativa”

Sawyer, D.T.; Heineman, W.R. & Beebe, J.M. - "Chemistry Experiments for
Instrumental Methods", New York, John Wiley (1984), 427 p; a

Ohlweiler, O.A. "Fundamentos de Análise Instrumental", Rio de Janeiro,

Livros Técnicos e Científicos (LTC) (1981), 486 p. - Wang, J.

Stripping “Analysis. Principles, Instrumentation, and Applications” VCH,

1985, Florida, ISBN 0-89573-143-6

Willard, H.H.; et al. - "Instrumental Methods of Analysis", 7a.edition,

Belmont, Wadsworth (1988), 895 p.

23