BIOQUÍMICA ANIMAL PROF(A).

ALINE
AULA PRÁTICA - 4
DISCENTE:_______________________________________________________________________
Aminoácidos, Peptídeos e Proteínas

Roteiro

Na bioquímica, as análises de biomoléculas podem ser realizadas de forma qualitativa, onde a molécula
pesquisada está presente ou ausente em uma amostra ou de forma quantitativa, onde se pode determinar a
quantidade exata da molécula pesquisada em um determinado material biológico.

Teste Qualitativo

Todas as proteínas existentes nos seres vivos, desde os vírus até os seres humanos, são constituídas
por combinações de apenas 20 aminoácidos. Esses blocos constituintes da vida se unem entre si, como
contas de um colar, para formar longas cadeias e moléculas complexas que configuram a estrutura de todos
os organismos vivos. O aminoácido é um composto orgânico que apresenta, em sua molécula, um grupo
ácido (-COOH) e um grupo amino (-NH2), além de um radical –R, que vai ser responsável pela
diferenciação entre os diversos tipos de aminoácidos existentes.
As proteínas podem ser caracterizadas e diferenciadas por propriedades específicas como a carga
elétrica, massa molar, solubilidade e afinidade por certos compostos de caráter sintético ou natural. Além
disso, podem também ser caracterizadas por reações de precipitação e/ou coloração.
Todas as reações desenvolvidas baseiam-se na presença de ligações peptídicas e também na
presença de diferentes aminoácidos, evidenciadas pela afinidade específica que essas moléculas possuem a
certos compostos.

Preparo da Amostra

Solução de ovoalbumina 10%

Adiciona-se 50mL de água destilada em 10mL de clara de ovo fresco, completa-se o volume para 100mL,
homogeneizando bem. Esta solução deve ser preparada no momento do uso ou acondicionada em geladeira.

1 - Reação de Biureto (sulfato de cobre em meio alcalino)

Fundamento: Está reação é específica para substâncias que possuem pelo menos dois grupos CO-NH unidos
por carbono e nitrogênio como ocorre no biureto, que empresta o seu nome para a reação.
As proteínas e seus produtos de hidrólise que contém duas ou mais ligações peptídicas dão resultado
positivo neste teste. A reação é também positiva para as substâncias que contém dois grupos carbamínicos
(-CO-NH2) ligados diretamente ou através de um único átomo de carbono ou nitrogênio. Esta é uma reação
geral para proteínas. Esse fenômeno deve-se à formação de um complexo entre o íon Cu2+, presente no
reativo, e os átomos de N presentes na molécula:
Fig. 1: representação da reação do íon cobre com os grupos polarizados presente nos resíduos de aminoácidos.

Objetivo: Identificar a presença de peptídeos na amostra através do reativo de biureto.

Reagentes:
• Reativo de biureto
• Amostra (Solução de ovoalbumina 10%)

Procedimento:
Colocar 2mL do reativo de biureto em dois tubos de ensaio. Ao primeiro juntar 1mL de ovoalbumina e no
segundo 1mL de água destilada. Agitar e observar a reação.

Resultado esperado:
• Tubo 1 (ovoalbumina): formação de coloração violácea indicando positivo para proteína.
• Tubo 2 (água destilada): não há mudança de cor, indicando reação negativa.

Resultado obtido:
• Tubo 1: ____________________________________________
• Tubo 2: ____________________________________________

2 - Desnaturação Protéica pelo Calor

A maioria das proteínas pode ser desnaturada pelo calor, que afeta as interações fracas em
uma proteína (principalmente as ligações de hidrogênio), mas dificilmente afeta as ligações covalentes. A
desnaturação proteica implica a perda da conformação nativa da proteína, com consequente perda da
solubilidade e precipitação.

Reagentes:
• Amostra Caseira de Proteína

Procedimento:
Utilizar calor (assar, fritar, cozinhar...) para desnaturar a proteína, ou seja, mudar a conformação nativa da
proteína de forma irreversível.

Quem quiser pode anexar foto da desnaturação da proteína do leite por adição de reagente, exemplo (ácido
acético).
Resultado obtido: __________________________________________

3 - Teste Quantitativo

Um dos principais instrumentos para as análises quantitativas na bioquímica são os métodos

ópticos como a colorimetria e a espectrofotometria. Essas análises se baseiam na capacidade de
algumas soluções absorverem a luz.
Considerando que a luz é definida como uma radiação eletromagnética composta de uma
gama de comprimentos de ondas (nm), as análises colorimétricas se baseiam na absorção de luz
visível pela substância a ser dosada e na espectrofotometria o princípio é semelhante, entretanto
o espectro de luz absorvido apresenta comprimentos de onda entre o ultravioleta e o
infravermelho. Assim, quanto maior a concentração da molécula pesquisada, maior a absorção de
luz, sendo relações diretamente proporcionais.

Um raio de luz monocromática ao atravessar uma solução contendo uma substância, uma parte da luz
será absorvida (absorbância) e outra parte será transmitida atravessando a solução (transmitância). A luz
pode ser refletida pelo recipiente que contém a solução, entretanto, nas análises bioquímicas este fenômeno
pode ser desconsiderado já que a natureza das cubetas (quartzo ou vidro) onde as soluções são depositadas
para a leitura ou eliminadas por comparação de amostra.
Pode-se descrever portanto:

A transmitância é a razão da luz emergente (I) com a intensidade da luz incidente (Iº), isto é:
T = I/Iº
Esta relação é determinada pela Lei de Lambert-Beer que é obtida da relação de duas leis distintas:
a lei de Lambert que diz que cada camada sucessiva do meio absorve uma fração igual da radiação,
destacando a importância da espessura da cubeta usada; a lei de Beer determina a relação entre a absorção
e a concentração da substância em solução, sendo razões diretamente proporcionais.
Os fotocolorimetros e espectrofotômetros são aparelhos que se baseiam nestes fenômenos físico-
químicos para quantificar uma determinada amostra tendo um padrão de referência.
Para a medida da absorção de luz ou visível ou invisível, as indústrias oferecem vários modelos de
aparelhos com o objetivo de viabilizar as análises bioquímicas. Para o seu funcionamento, todo
fotocolorimetro ou espectrofotômetro apresentam uma fonte de luz, que em geral é uma lâmpada de
tungstênio para luz visível e uma Lâmpada de deutério para ultravioleta. O feixe de luz é direcionado para
um monocromador, onde um comprimento de onda é selecionado, permitindo então a emissão de uma luz
monocromática. A luz incide no compartimento onde a cubeta, contendo a amostra, é encaixado. A luz
transmitida pela amostra alcança um fotomultiplicador que converte o estímulo óptico em elétrico que é
então convertido em valores de absorbância, transmitância ou até mesmo em concentração, dependendo dos
recursos do aparelho em uso.

Reagentes:
• R1 (Biureto)
• STD (padrão) 5g/dL
• Amostra

Procedimento: pipetar em tubos de ensaio:

Amostra
STD (padrão) ---
Amostra 20µL
R1 (Biureto) 2,0mL

Homogeneizar bem e aguardar 10 minutos em temperatura ambiente.

Medir a absorbância da Amostra frente ao Branco (soente Biureto) a 540nm. A cor é estável por 2 horas.

Cálculos:
Fator: Concentração do STD (g/dL) / absorbância do STD
O FATOR É 38,18
Proteínas Totais (g/dL): absorbância da amostra x fator

Resultado Obtido: __________________________________________

Interpretação: As proteínas são sintetizadas predominantemente no fígado, células plasmáticas, linfonodos,

no baço e na medula óssea. Na evolução de uma doença, a concentração de proteína total e suas frações
podem desviar-se significativamente do valor normal. A medida da proteína total pode ser usada no
diagnóstico e tratamento de uma variedade de doenças envolvendo o fígado, rim ou medula óssea, bem como
em outras desordens metabólicas ou nutricionais. Hipoproteinemia pode ser causada por doenças e
desordens, tais como: perda de sangue, síndrome nefrótica, queimaduras severas, síndrome de retenção de
sal e deficiência aguda de proteína. Hiperproteinemia pode ser observada em casos de desidratação severa
e em enfermidades como o mieloma múltiplo.

Questionário

1. Escreva a estrutura geral de um aminoácido, citando os componentes da estrutura.

2. Em que se baseia a reação do Biureto?
3. Quais são os aminoácidos essenciais e não essenciais? No que se baseia essa classificação?
 4. Qual é o aminoácido mais simples encontrado em proteínas e por que é considerado o mais
simples?
5. Quais os aminoácidos que possuem enxofre na sua estrutura?
6. Defina Ponto Isoelétrico (pI).
7. O peptídeo Gly-Cys-Glu-Ser-Asp-Arg-Cys, é capaz de formar uma ligação dissulfeto interna?
Explique.
8. Todas as proteínas são formadas por um encadeamento de aminoácidos. Como ocorre a ligação
peptídica?
9. Conceitue estrutura primária das proteínas.
10. Correlacione as proteínas com as estruturas em que estão presentes.
Estrutura Macroscópica Proteína
( 1 )Músculo ( )colágeno
( 2 )Cabelo ( )queratina
( 3 )Tecido Conjuntivo ( )fibroína
( 4 )Asas de Insetos ( )mioglobina
( 5 )Teias de aranha ( )resilina
11. Cite as funções das proteínas e dê exemplos.
12. Explique desnaturação protéica e cite agentes desnaturantes.
13. Turma A vai acrescentar a foto de um experimento caseiro de desnaturação proteica por
calor e explicar o processo. (ítem 2 do roteiro acima)

Devido as fortes chuvas da semana passada, essa aula (experimento 1 e 3 será executado na próxima
aula prática.

O questionário com a foto deverá ser entregue hoje até as 22:00 horas.