Introdução:

As proteínas são as moléculas orgânicas mais abundantes e importantes nas células,

estando presentes em todas as células, uma vez que são fundamentais sob todos os aspectos da
estrutura e função celulares. Existem diferentes tipos de proteínas, cada exercendo uma função
biológica diversa. Além disso, a maior parte da informação genética é expressa pelas proteínas.
Por serem formadas por aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas, são
pertencentes à classe dos peptídeos, onde, uma ligação peptídica é a união do grupo amino (-NH
2) de um aminoácido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminoácido, através da formação
de uma amida. Figura 01.

Figura 01: ligação peptídica

Nos animais, as proteínas correspondem a cerca de 80% do peso dos músculos

desidratados, cerca de 70% da pele e 90% do sangue seco. Mesmo nos vegetais as proteínas estão
presentes.
A importância das proteínas, entretanto, não está relacionada com sua quantidades, mas
sim, com sua função no organismo. Por exemplo, todas as enzimas conhecidas são proteínas, que
por muitas vezes, existem em porções pequenas no organismo. Contudo, estas substâncias
catalisam todas as reações metabólicas e possibilitam aos organismos a construção de outras
moléculas como: proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos e lipídios, que são essenciais para a
vida dos organismos.
E inevitável o estudo das proteínas quando se deseja estudar Bioquímica, portanto, torna-
se importante a existência de técnicas adequadas de purificação e quantificação dessa classe
compostos. A purificação e caracterização de uma proteína está diretamente ligada as suas
características físico-químicas.
 Reações de Coloração de Proteínas

A formação de produtos coloridos nas reações de coloração, e devido a presença de

diferentes aminoácidos e ligações peptídicas. Onde as proteínas podem reagir com uma variedade
de reagentes, para obtenção desses produtos.
Algumas reações de coloração são específicas para aminoácidos encontrados na
composição das proteínas, por exemplo: reação xantoproteíca (tirosina, triptofano e fenilalamina),
reação deMillon (tirosina), reação de HopkinsCole (triptofano), reação de Sakaguchi (arginina),
etc. A importância dessas reações não estão apenas no fato de se identificar determinada proteína,
mas também, a dosagem de proteínas e aminoácidos.
Outras reações importantes também são utilizadas de forma qualitativa, são aquelas ditas
gerais, porque irão caracterizar grupamentos comuns a todas as proteínas, ou seja, grupo amino e
ligações peptídicas

Teste com a Ninhidrina

A ninhidrina é um poderoso agente oxidante que reage com aminoácidos, entre pH 4 e 8,

originando um composto de cor púrpura, com exceção dos aminoácidos prolina e hidroxiprolina,
que apresentam coloração amarela. Essa e uma reação especifica usada na detecção de
aminoácidos por ser característica da função amina primária.

Reação do Biureto

Proteínas e peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácidos, apresentam resultado

positivo para o teste com Biureto. Substâncias que contém 2 grupos carbamínicos (-CO-NH2)
ligados diretamente ou através de um único átomo de carbono ou nitrogênio, também são positiva
para o teste com Biureto. Onde proteínas ou peptídeos tratados por uma solução de sulfato de
cobre, em meio alcalino, dão uma coloração violeta característica.

Precipitação de Proteínas com Desnaturação

A desnaturação envolve alterações nas estruturas quaternária, terciária e secundária de

proteínas, mas não da primária. Isso sendo resultado da modificação da estrutura tridimensional
nativa de uma proteína, com consequência, a alteração dessas propriedades é conhecida como
desnaturação.
 A desnaturação, usualmente decresce a solubilidade das proteínas, sendo explicada pela
exposição de radicais hidrofóbicos e outros que prejudiquem a interação proteína-água e
favoreçam a interação proteína-proteína.
Várias estratégias podem ser utilizadas para desnaturar proteínas, tais como: calor, ácidos,
álcalis, solventes orgânicos, detergentes, sais de metais pesados, etc. Entre as alterações que se
pode observar, por conta da desnaturação protéica, estão: diminuição da solubilidade, perda de
atividade biológica, aumento da reatividade de radicais da cadeia polipeptídica, alterações na
viscosidade e etc.
A precipitação com desnaturação, além de serem utilizadas para caracterizar a presença
de proteínas em solução, também são úteis para proceder a desprotenização de líquidos biológicos
para análise de componentes não protéicos

Precipitação por Ação do Calor

Efeito no qual o fornecimento de energia a um meio aquoso contendo proteínas, desfaz a

interação entre os radicais das mesmas e as "desenrolada", expondo ao meio aquoso seus radicais
apolares que estavam contidos no seu interior, levando à desnaturação e precipitação. Isso ocorre,
pois, a estrutura terciária de uma proteína é mantida por interações hidrofóbicas entre os radicais
apolares que se abrigam no meio aquoso, procurando se agruparem no interior do glóbulo
proteico.

Precipitação por reação com os reagentes para alcaloides

Determinados agentes, como os reagentes para alcalóides podem ser usados na

precipitação de proteínas, o que é útil na desproteinização de materiais biológicos, como o sangue:
ânions de ácidos complexos (tricloroacético, tânico, fosfotúngstico) formam sais insolúveis onde
a proteína funciona como cátion.

Precipitação por Ação de Solventes Orgânicos

A precipitação de proteínas podem ser feitas através da adição de solventes orgânicos,

como o etanol, éter etílico e acetona, às soluções aquosas de proteínas. Isto pode ser explicado
pelo fato destes solventes apresentarem uma constante dielétrica inferior à da água. Outro ponto,
e que, a desnaturação de proteínas podem ser evitadas ao se utilizar solventes orgânicos em baixas
temperaturas (0º C ou menos).
 Entretanto, a temperatura mais elevada, os solventes orgânicos podem levar à
desnaturação por romperem as ligações de hidrogênio e interações apolares, importantes pela
formação da conformação protéica.
Como a água possui uma alta constante dielétrica, a interação proteína-agua prevalece,
ao invés da proteína-proteína. Isso ocorre pois a força de atração entre moléculas protéicas
contendo radicais com cargas opostas é baixa, dessa forma, a adição de solventes pode inverter
esta situação, levando à agregação e precipitação das moléculas protéicas.

Efeito da Força Iônica sobre a Solubilidade das Proteínas

O fenômeno denominado “salting-in” e o efeito onde em concentrações reduzida, os sais

aumentam a solubilidade de muitas proteínas, provavelmente devido à interação da proteína com
os sais causando diminuição da interação proteína-proteína e, portanto, aumentando a
solubilidade. Essa propriedade está relacionada com sua força iônica que tanto depende de sua
concentração como na valência de cátions e ânions que formam o sal.

Precipitação (Salting Out) Reações de Precipitação sem Desnaturação

Uma outra estratégia a ser utilizada e a variação do pH ocasionando a precipitação de

proteínas no seu ponto isoelétrico, pH no qual a repulsão eletrostática entre as moléculas é
mínima. Este efeito é denominado de “salting-out”.
Assim a ressolubilização de proteínas podem ser feita mantendo as suas características
estruturais nativas por uma variação de pH acima ou abaixo do ponto isoelétrico.

Objetivos:

• Caracterizar a presença de proteínas em material biológico.

• Verificar experimentalmente a precipitação de proteínas com e sem desnaturação.
• Relacionar as observações práticas com a teoria de propriedades gerais, estrutura
e isolamento de proteínas.

Procedimento Experimental

1. Reação de coloração de proteínas

1.1 Reação da Nihidrina
Inicialmente enumerou-se 2 tubos de ensaio. No primeiro colocou-se 2 mL da solução de
ninhidrina, juntou-se 5 gotas da solução de proteínas e levou-se a fervura no bico de Bunsen
durante 2 minutos. Observou-se. No segundo tubo, colocou-se 2 mL da solução de ninhidrina,
juntou-se 5 gotas de glicina e ferveu-se em chama direta durante 2 minutos. Observou-se.
1.2 Reação do Biureto
Primeiramente, enumerou-se 3 tubos de ensaio e colocou-se no primeiro tubo 1 mL da
solução de proteínas, juntou-se 5 gotas de NaOH 2,5 M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%.
Observou-se. Logo em seguida, no segundo tubo colocou-se 1 mL de solução de glicina, juntou-
se 5 gotas de NaOH 2,5 M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. Observou-se. Por fim, no terceiro
tubo colocou-se 1mL de H2O destilada, adicionou-se 5 gotas de NaOH 2,5 M e 3 gotas de sulfato
de cobre 1%. Observou-se.
2. Reações de precipitação de proteínas
2.1 Reação de precipitação com desnaturação
2.1.1 Precipitação por ação do calor
Em um tubo de ensaio colocou-se 2 mL da solução de proteínas e aqueceu-se diretamente
na chama. Observou-se.
2.1.2 Precipitação com os reagentes para alcaloides
Em um tubo de ensaio colocou-se 1 mL da solução de proteínas e adicionou-se 1 mL de
ácido tricloroacético a 10% (TCA). Observou-se.
2.1.3 Precipitação por ação de solventes orgânicos
Em um tubo de ensaio colocou-se 1 mL da solução de proteína e adicionou-se álcool
etílico (1 a 3 volumes) até que houvesse a formação do precipitado de proteínas.
2.2 Reação de precipitação de proteínas sem desnaturação
2.2.1 Solubilização ("salting-in")
Primeiramente, colocou-se 3 mL de clara de ovo em um béquer pequeno, posteriormente
diluiu-se com pequeno volume de água destilada, agitando suavemente com um bastão de vidro,
até que notou-se o aparecimento de um precipitado. Adicionou-se, em seguida, solução de cloreto
de sódio, gota a gota, até redissolução do precipitado.
2.2.2 Precipitação (“salting–out”)
Pipetou-se 2 mL da solução obtida na experiência anterior ("salting-in") em um tubo de
ensaio. Adicionou-se, em seguida, 2 mL de solução saturada de sulfato de amônio e observou-se
a formação de precipitado de proteínas. Por fim, juntou-se 4 a 6 mL de água destilada a fim de
recompor a força iônica anterior e como consequência, redissolver o precipitado.
 Resultados e Discussão:

1. Reação de coloração de proteínas

1.1 Reação da Nihidrina

A nihidrina reage com os grupos α amino terminal presentes nos aminoácidos e nas
proteínas sob aquecimento, fazendo com que o teste analítico dê positivos nesses casos, com a
formação da purpura de Rühemann, tal como no mecanismo apresentado abaixo.

Fig 02: Mecanismo de reação da Nihidrina

No tubo 1, observou-se a formação de uma solução azul violeta de menor intensidade do

que no segundo tubo, como mostrado nas imagens a baixo. A mudança de coloração deu-se já no
início do aquecimento.

Figura 03: Tubos 1 e 2, experimento da Nihidrina antes, durante e após aquecimento.

Reação do Biureto

A reação do biureto se dá devido às ligações peptídicas, dando positiva para proteínas e

peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácidos. A reação é também positiva para as
substâncias que contêm 2 grupos carbamínicos (-CO-NH2 ) ligados diretamente ou através de um
único átomo de carbono ou nitrogênio. As proteínas ou peptídeos, quando tratados por uma
solução de sulfato de cobre, em meio alcalino, por isso o uso do hidróxido de sódio, dão uma
coloração violeta característica. O responsável pela cor é um complexo, do biureto com um átomo
de cobre, tal como representado na figura 04.

Figura 04: complexo Biureto-cobre.

No tubo 1 observou-se uma coloração violeta, dando então positivo para o teste do
biureto, no segundo tubo pode-se observar uma coloração azul clara assim como no terceiro. O
terceiro tubo foi considerado como branco, ou seja, o teste com os reativos necessários para
precipitação de proteínas, mas sem as proteínas presentes, apenas para comparar caso os testes
sejam positivos (precipitação de proteínas – cor violeta) ou negativos (não precipitação de
proteínas – cor azul). O segundo tubo, continha apenas glicina (figura 05), que é o aminoácido
mais simples e, portanto, não possui ligações peptídicas, que reagiriam com o biureto, tornando a
solução então violeta como observado no primeiro tubo, mas sim, observou-se a mesma coloração
azul clara que no tubo 03.

Figura 05 : estrutura da glicina

Figura 06: Tubos 1, 2 e 3 no teste de biureto.

 Reações de precipitação de proteínas

Reações de precipitação com desnaturação

A precipitação de proteínas se dá pela falta de solubilidade destas no meio, vários fatores

podem influenciar isto, tal como, o calor, presença de reagentes para alcaloides, solventes
orgânicos entre outros. Muitas vezes isso ocorre devido a competição desses reagente para
formação da ligação de hidrogênio, diminuindo a interação das proteínas com o meio fisiológico.

Ação do calor

O calor é um dos métodos para a precipitação da proteína, por tanto observou-se que ao
aquecer o tubo contendo a solução de glicina, houve a precipitação, formando um coagulo branco
no fundo do tubo de ensaio.

Reagentes para alcaloides

Os reagentes para alcalóides são ácidos que além de precipitarem alcalóides também
podem combinar-se com as proteínas que possuam carga positiva (quando o pH da solução estiver
no lado ácido do ponto isoelétrico da proteína) formando complexos insolúveis. Nesse caso, usou-
se o ácido tricloroacético (TCA), que ao ser adicionado formou um complexo insolúvel de
coloração branca, chamado tricloroacetato de proteína.

Figura 07: estrutura do ácido tricloroacético

Precipitação por ação de solventes orgânicos

Ao adicionar solventes orgânicos às soluções aquosas de proteínas, há a precipitação das

mesmas, devido a diferença da constante dielétrica ser inferior à da agua, tornando-as insolúveis
no meio por conta da agregação proteica. Por tanto, ao adicionar etanol na solução de proteínas,
observou-se turvação imediata da solução e precipitado branco no fundo do tubo de ensaio.
 Figura 08: tubos com solução de proteína, por ação do calor, TCA e adição do etanol.

Precipitação sem desnaturação

A precipitação sem desnaturação é caracterizada pela possibilidade de solubilizar

novamente as proteínas precipitadas. Isso pode ocorrer com a alteração da força iônica do meio,
como nde muitas proteínas, um fenômeno denominado "salting-in", provavelmente devido a
interação da proteína com os sais causando diminuição da interação proteína-proteína e, portanto
aumentando a solubilidade.
Em altas forças iônicas, conseguidas pela adição de grandes quantidades de um sal muito
solúvel (por exemplo, o sulfato de amônio) a uma solução de proteína, pode ocorrer remoção da
água de hidratação das moléculas, o que leva a predominância da interação proteína- proteína,
resultando em precipitação. Este efeito é denominado "salting-out".

Salting in

Ao adicionar aproximada mente 10 gotas de água, foi possível observar pequenos fios
brancos na clara do ovo, com uma agitação suave, de forma que não haja desnaturação da proteína.
Com a adição de um volume muito maior que o de água, de NaCl foi possível a redissolução do
precipitado anteriormente formado. (Figura 09)

Figura 09: Clara do ovo tratada com agua e solução do NaCl.

 Salting out

A alíquota retirada da solução anterior, foi tratada com a adição do sulfato de amônio e
tornou-se turva. Pode-se identificar o precipitado de cor branca formado. Com a adição de água
a solução que era turva voltou a ser transparente, mas ainda continha alguns precipitados dispersos
na solução. As globulinas da clara de ovo precipitam com 50% de saturação com sulfato de
amônio, enquanto que a ovoalbumina precipita com 100% de saturação com sulfato de amônio.

Figura 10: solução de clara do ovo tratada com sulfato de amônia.

Conclusão:

As reações de coloração e precipitação permitiram a caracterização e análise das

propriedades químicas e físicas das proteínas. Como, a presença de ligações peptídicas, estrutura
molecular, solubilidade, força iônica e concentração molar. Reações especificas utilizando
determinados reativos permitiu a detecção de proteínas em materiais biológicos, os quais
originam substâncias coloridas que absorvem luz na região visível, podendo permitir até mesmo
a sua quantificação. Ao contrário das reações de precipitação que podem alterar as estruturas
quaternárias, terciárias e secundárias das proteínas como as reações por ação térmica, presença de
alcalóides, sais de metais pesados e solventes orgânicos
 Referencias

Moreira, Ana Beatriz & Gonçalvez, Joaquim. Processos de desnaturação protéica.Universidade

do Porto, 2008.
Lehninger, A. Lester. Fundamentos de Bioquímica. 4ª ed. São Paulo: Sarvier, 2006.