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EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS: Extração e caracteização do amido da batata e do glicogênio hepático

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UNESP FACULDADE DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA FCT – Campus de Presidente Prudente

Unesp

Relatório de Bioquímica
EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS:
EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO AMIDO DE BATATA EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO GLICOGÊNIO HEPÁTICO

Discentes: Gabriela Bitto de Oliveira José Carlos de Oliveira Junior Tamara Murisugi de Oliveira Docente: Profa. Dra. Maria de Lourdes Corradi C. Da Silva Disciplina: Bioquímica Curso: Engenharia Ambiental 2° ano

Presidente Prudente, 07 de abril de 2010

Índice
1. Introdução ......................................................................................................................................2 2. Objetivos .........................................................................................................................................4 3.Matérias ...........................................................................................................................................4
3.1. Extração e caracterização do amido da batata ................................................................................................4 3.2.Extração e caracterização do glicogênio hepático ...........................................................................................4

4. Metodologias ..................................................................................................................................5
4.1. Extração e caracterização do amido da batata
4.1.1. Extração do amido ........................................................................................................................ 5 4.1.2. Preparo de uma solução de amido. ............................................................................................... 5 4.1.3. Caracterização do amido por reação de fenol ácido sulfúrico ......................................................5 4.1.4. Caracterização do amido por reação com iodo .............................................................................5 4.1.5. Precipitação do amido por solução saturada de sulfato de amônio ...............................................5 4.1.6. Precipitação do amido por álcool etílico ......................................................................................5

4.2. Extração e caracterização do glicogênio hepático
4.2.1. Extração do glicogênio hepático com KOH a quente ...................................................................6 4.2.2. Caracterização Colorimétrica e Hidrólise Enzimática do Glicogênio ..........................................6

5. Resultados e Discussões .................................................................................................................7
5.1. Extração e caracterização do amido da batata
5.1.1. Extração do amido .........................................................................................................................7 5.1.2. Preparo de uma solução de amido .................................................................................................7 5.1.3. Caracterização do amido por reação de fenol ácido sulfúrico ......................................................7 5.1.4. Caracterização do amido por reação com iodo .............................................................................7 5.1.5. Precipitação do amido por solução saturada de sulfato de amônio ...............................................8 5.1.6. Precipitação do amido por álcool etílico .......................................................................................8

5.2. Extração e caracterização do glicogênio hepático
5.2.1. Extração do glicogênio hepático com KOH a quente ...................................................................8 5.2.2. Caracterização Colorimétrica e Hidrólise Enzimática do Glicogênio ..........................................9

6. Conclusão .....................................................................................................................................10 7. Bibliografia ..................................................................................................................................11

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1. INTRODUÇÃO Os principais polissacarídeos encontrados na natureza são constituídos de glicose, um carboidrato, mostrado na Figura 1.1. A glicose,o glicogênio e o amido que são polissacarídeos estruturais das plantas, de reserva animal e reserva vegetal, respectivamente, são formados exclusivamente de glicose. A reação de fenol ácido sulfúrico pode ser utilizada para caracterizar a presença de glicose e carboidratos em geral. O mecanismo da reação baseia-se na formação de furfural e hidroximetil-furfural pela ação de um ácido forte sobre uma pentose e hexose, respectivamente

Figura 1.1 Molécula de Glicose

O amido, um composto grande e complexo, é considerado a principal reserva das plantas armazenado nas células do parênquima amilífero(tecido vegetal presente nos tubérculos com células armazenadoras de amido) de caules (batatinha) e raízes (mandioca) e de muitas algas. Dentro das células encontram-se na forma de dois principais grânulos: a amilose e amilopectina, polissacarídeos que diferem na estrutura molecular. Apresentam-se como pós finos de coloração esbranquiçada, formas e estratificações variáveis. A molécula de amilose não apresenta ramificações e, no espaço, apresenta estrutura helicoidal. Já a amilopectina, possui uma estrutura ramificada, sendo que os ligantes aparecem a cada 24-30 moléculas de glicose; a ligação entre as unidades de glicose é do tipo alfa 1-4 na mesma cadeia, porém, unindo as cadeias aparece as ligações do tipo 1-6. O grão de amido é constituído de hilo (ponto inicial de formação) e lamelas ou estrias (zonas claras e escuras). Na análise microscópica devem ser observadas características como a forma (esféricos, ovóides, poliédricos, periformes, elipsóides etc.), presença de lamelas, tipo de hilo (pontuado, estrelado, linear etc.) e estado de agregação.

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Figura 1.2 Estrutura do Amido

Para caracterizar a presença de amido em algum material basta adicionar iodo, pois coramse de azul-arroxeado frente ao iodo, pelo fato deste halogênio formar um complexo com os polissacarídeos, principalmente amilose. Por este motivo, utiliza-se como corante de identificação a glicerina iodada ou o lugol. Quando tratados por água aquecida, entumecem. São solúveis em solução aquosa de cloral hidratado. São refringentes e apresentam uma cruz negra de braços recurvos (cruz de Malta) quando observados à luz polarizada. Já o glicogênio, um polissacarídeo de reserva nas células animais, possui uma estrutura mais compacta e ramificada do que o amido. Aparece em abundância no fígado (até 10% do peso efetivo) e também compõe significativamente o músculo esquelético (1 a 2%). Nos hepatócitos o glicogênio aparece como grandes agregados moleculares, grânulos ou “rosetas”, formados por grânulos menores. O glicogênio constituí-se de uma molécula ramificada formada por unidades de glicose em ligação glicosídica 1-4, com ramificação onde a ligação é 1-6. Vale lembrar que a quantidade ligação 1-6 é mais presente no glicogênio, o que confere o alto grau de ramificação da molécula. Esse é metabolizável por dois tipos de enzimas: a fosforilase (produzindo glucose-1-fosfato) e as amilases (alfa, beta, amiloglucosidase, isoamilase, etc.), estas produzindo glucose ou oligômeros. Pode ser isolado dos tecidos por meio de digestão a quente , com solução concentrada de álcalis fortes ou a frio com solução de cloreto de mercúrio. Em ambos os métodos são preservadas as ligações de glicosídicas não redutoras alfa 1-4 e alfa 1-6. O glicogênio é susceptível à hidrólise enzimática pelas alfa amilases, como por exemplo, a salivar. A exemplo da amilose, ele também se complexa com o iodo, embora o faça com menor intensidade que os dois componentes do amido. Como a reatividade do iodo depende dos segmentos lineares com ligações alfa 1-4 cada passo de hélice com 6 resíduos glucosil oclue um átomo de I 2 e há formação de cor. A intensidade da reação com iodo dá-se na seguinte ordem decrescente: amilose, amilopectina, glicogênio; e as cores formadas são respectivamente: azul intenso, violáceo avinhado e castanho. O tratamento desses polissacarídeos com alfa amilases, específicas para a hidrólise das ligações glicosídicas alfa 1-4, suprime então esta reatividade frente ao iodo.
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2. OBJETIVO a) Demonstrar a extração e caracterização de polissacarídeos de materiais biológicos: amido de batata e glicogênio de fígado; b) identificar o amido e o glicogênio como carboidratos; c) evidenciar o amido e o glicogênio através de reações de coloração e precipitação. 3. MATERIAIS 3.1. Reações de caracterização do amido a) Solução de amido recém-preparada; b) ácido sulfúrico concentrado; c) solução de fenol 5%; d) solução de lugol; e) solução saturada de sulfato de amônio; f) álcool etílico absoluto. g) béquer 250mL; h) erlernmeyer de 125mL; i) filtro de papel. 3.2.Extração do glicogênio hepático Além dos materiais já citados, necessita-se de: a) 5g de fígado fresco de boi; b) solução de KOH 5M; c) etanol gelado; d) centrífuga com frequência de pelo menos 3000 r.p.m; e) saliva (mistura de 2 ou 3 doadores) diluida 1:10 com solução de NaCl 5mM. f) reativo do iodo.

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4. METODOLOGIA 4.1. Extração e caracterização do amido da batata 4.1.1. Extração do amido Raspar um pedaço de batata, transferir a raspa para um béquer de 250mL. Adicionar 100mL de água destilada e agitar com um bastão de vidro. Filtrar e recolher o líquido num erlernmeyer de 125mL. Deixar o amido depositar no fundo do enlernmeyer durante 10 minutos e, a segui, remover cuidadosamente o líquido sobrenadante para descartá-lo. O que sobra no erlernmeyer é um depósito de amido. 4.1.2. Preparo de uma solução de amido Manter aproximadamente 150mL de água fervendo em um béquer de 250mL. Acrescentar aproximadamente 50mL de água fria ao depósito de grãos de amido obtido anteriormente e adicionar esta suspensão de amido lentamente e com constante agitação, à água fervente. Continuar o aquecimento até que se forme uma solução leitosa e azulada. 4.1.3. Caracterização do amido por reação de fenol ácido sulfúrico Em um tubo de ensaio pipetar 0,5 ml de solução de amido (diluída previamente de 1:10), ou seja, adicionar 4,5ml de água destilada. Desta solução coletar 0,5ml e colocar num segundo tubo, juntar a este 0,5ml de solução de fenol 5% e adicionar 2,5ml de ácido sulfúrico concentrado, nun único jato. Observar a cor laranja característica da reação. 4.1.4. Caracterização do amido por reação com iodo Em um tubo de ensaio pipetar 2ml de solução de amido e adicionar 2 gotas de lugol. Notar o aparecimento de cor azul intensa. Aquecer. Observar. Resfriar o tubo em água corrente. Observar. 4.1.5. Precipitação do amido por solução saturada de sulfato de amônio A 5ml de solução de amido adicionar 5ml de solução saturada de sulfato de amônio. Agitar fortemente e deixar em repouso por 10minutos. Filtrar. Pesquisar, separadamente, no filtrado e no precipitado, a presença de amido pelo teste do iodo, adicionando 2 gotas de lugol ao precipitado e também no sobrenadante. 4.1.6. Precipitação do amido por álcool etílico A 2ml de solução de amido adicionar 5ml de álcool etílico. Agitar. Filtrar e pesquisar amido
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como na experiencia anterior, tanto no filtrado, como no precipitado. 4.2. Extração e caracterização do glicogênio hepático 4.2.1. Extração do glicogênio hepático com KOH a quente Colocar 5g de fígado em um tubo de ensaio com 15mL de KOH 5M. Aquecer em banho maria, agitando até a dissolução do tecido, aproximadamente 15 minutos. Ao esfriar a mistura, deve-se despejá-la lentamente em um erlernmeyer com 40 mL de etanol gelado. 4.2.2. Caracterização Colorimétrica e Hidrólise Enzimática do Glicogênio Inicialmente são numerados seis tubos de ensaio. No tubo 1 há somente 0,4mL de água destilada; o tubo 2 contém 0,3mL de água destilada e 0,1mL de saliva diluída 1:10 com NaCl 5mM; o tubo 3 apresenta 0,3mL de água destilada e 0,1mg/mL de glicogênio enquanto que o tubo 4 contém 0,1mL daquela e 0,3mg/mL deste. Já no tubo 5 foi adicionado 0,2mL de água destilada, 0,1mg/mL de glicogênio e 0,1mL de saliva diluída 1:10 com NaCl 5mM. Por fim, no tubo 6, encontra-se apenas 0,3mg/mL de glicogênio e 0,1mL da saliva. Os tubos de ensaio, então, ficam incubados à temperatura ambiente por aproximadamente 10minutos, com agitação dos tubos 5 e 6 ocasionalmente. E, após o tempo de incubação, é adicionado 1,6mL de reativo de iodo – a começar pelos tubos 5 e 6 – seguido da agitação dos tubos.

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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Extração e caracterização do amido da batata 5.1.1. Extração do amido Ao raspar a batata com uma faca há o rompimento das células que a compõem, dentro dessas células há presença de amiloplastos, onde estão contidos os grânulos de amido (amilopectina e amilose). Com o rompimento das células os amiloplastos são liberados para o meio, que no caso do experimento é composto por 100ml de água, solubilizando-se. A agitação com o bastão de vidro é feita para influenciar ainda mais a liberação dos amiloplastos das células da batata. Filtra a solução obtida e espera o amido precipitar para retirar o sobrenadante e obter uma maior concentração de amido na solução. 5.1.2. Preparo de uma solução de amido No preparo da solução de amido adicionou-se agua fria ao depósito de amido obtido na reação anterior para que depois essa solução resultante pudesse ser adicionada à água quente fazendo com que os amiloplastos se rompessem, liberando a amilose e a amino-pectina para o meio. A amostra obtida é uma solução esbranquiçada onde há a presença dos amidos citados anteriormente permite a realização de reações de caracterização desse polissacarídio. 5.1.3. Caracterização do amido por reação de fenol ácido sulfúrico Após misturar as soluções de amido diluída, a solução de fenol 5% e do ácido sulfúrico, forma-se no tubo uma solução de cor laranja, caracterizando assim a presença de amido na amostra. Isso ocorre pelo fato de um ácido forte, no caso o ácido sulfúrico, agir sobre a hexose, amido, hidrolisando-o e liberando moléculas de glucose que forma um composto chamado hidroximetilfurfural. Esse ultimo composto reage com o fenol formando o produto de coloração laranja citado acima. 5.1.4. Caracterização do amido por reação com iodo Após a adição de lugol na solução de amido é bem visível a coloração azul-escuro que se forma no tubo, porém quando este é aquecido essa solução passa a ter uma coloração amarelada translucida. A solução de amido fica azul-escura na presença de lugol, devido aquela formar um complexo colorido com o iodo presente neste. Sendo que a amilose dá origem a uma coloração negro-azulada, enquanto a amilopectina dá origem a uma coloração vermelho-violácea, o que não nos deixa concluir que a amilose encontrava-se em maior quantidade na solução do que a
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amilopectina devido ao predomínio da coloração azul-escuro. Já que aquela, devido as suas cadeias lineares apresenta uma conformação helicoidal capaz de ocluir o iodo, o que não ocorre com a amilopectina onde a formação de hélice fica em parte dificultada pelos pontos de ramificação da molécula. Ao aquecer a solução de amido e lugol esse complexo se dissocia, formando uma solução amarelo-laranjada devido a presença de iodo dissociado que proporciona essa cor característica. 5.1.5. Precipitação do amido por solução saturada de sulfato de amônio Depois de 10 minutos de repouso, observa-se a formação de um precipitado no fundo do tubo, sendo este de coloração branca e aspecto viscoso. Ele ocorre devido a adição de sulfato de amônio na solução de amido. Pois assim como as proteínas, o amido se solubiliza na água devido a presença de pontes de hidrogênio, o sulfato de amônio, sendo um sal muito solúvel, aumenta a força iônica desidratando o amido sendo que este precipita. Porém, após filtrar o precipitado e adicionar o lugol neste e na solução filtrada observa-se que a cor do tubo que a possui é azul translucida, mostrando que há a possibilidade de nem todo o amido ter se precipitado, levando-se em consideração a reação de caracterização com iodo, citada acima. O precipitado, como esperado, apresenta um coloração azul-preta, por ser composto essencialmente de amido. 5.1.6. Precipitação do amido por álcool etílico Neste experimento também forma-se um precipitado com as mesmas características do precipitado descrito acima. Só que neste caso, a precipitação ocorre devido a adição de álcool etílico na solução de amido. O etanol é um solvente orgânico, possui grande solubilidade na água, assim, quando adicionado à solução de amido ele se solubiliza rompendo as interações amido-água fazendo com que este se precipite. Após filtrar-se a amostra, adiciona-se lugol tanto ao precipitado quanto a solução filtrada. Observa-se nesse ponto, uma diferença entre a solução filtrada desse experimento com a do anterior, a coloração do tubo fica amarelo-laranjado devido ao iodo do lugol, pressupondo-se assim, que não há presença de amido nela, o que não ocorreu no filtrado anterior. O precipitado, como esperado, adquiri cor azul-preta, por ser formado essencialmente de amido. 5.2. Extração e caracterização do glicogênio hepático 5.2.1. Extração do Glicogênio Hepático Após a dissolução do tecido animal e com a adição de etanol gelado – evitando assim, sua vaporização, já que tal composto é volátil à temperatura ambiente – ocorre a precipitação do tecido
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na forma de flocos, isto porque o álcool etílico forma pontes de hidrogênio com a água, impedindo a ligação desta com o glicogênio, o qual precipita-se. Com a centrifugação dos seis tubos de ensaio, obtém-se um líquido sobrenadante e uma pequena porção marrom escuro de precipitado. Após a retirada de tal líquido e a adição de água destilada (no total, 3mL), foi possível notar a formação de espuma. A formação de espuma ocorre devido à presença de KOH, lipídios e proteínas de membrana. Finalmente, depois de centrifugar e, em seguida, dissolver novamente (10mL de água destilada) o precipitado, obtém-se uma solução opalescente e que contém glicogênio. 5.2.2. Caracterização Colorimétrica e Hidrólise Enzimática do Glicogênio Os tubos 1 e 2, ambos contendo água destilada, e a saliva no segundo, adquirem coloração amarelada devido à presença do iodo. Já os tubos 3 e 4, contendo apenas água destilada e glicogênio, apresentam coloração levemente castanho, sendo que esta dá-se mais intensamente no tubo 4, visto que há maior concentração de glicogênio, comprovando assim que esta técnica colorimétrica pode ser aplicada quantitativamente, isto é, existe correspondência linear entre a concentração de glicogênio e a densidade ótica. Os tubos 5 e 6 são os únicos que contém saliva (amilase salivar) e glicogênio simultaneamente. Além disso, há água no tubo 5, daí a hidrólise do glicogênio neste ser um pouco maior em relação ao tubo 6, pelo qual iniciou-se a adição de reativo de iodo. Comparando os tubos 3 e 5, os quais contêm a mesma quantidade de glicogênio (0,1mg/mL), pode-se notar que o primeiro apresenta coloração castanho mais intensa, devido à ausência da amilase salivar, a qual auxilia o processo de degradação do glicogênio. A partir da análise dos tubos 4 e 6 – ambos contendo 0,3mg/mL de glicogênio – verifica-se diferenças na coloração de suas amostras. No tubo 4, ocorre a hidrólise total do glicogênio, enquanto que no tubo 6, sem água destilada, há hidrólise parcial do glicogênio pela ação da amilase salivar. É importante destacar que a diluição da saliva apenas com cloreto de sódio justifica-se por ser o ânion Clˉ um excelente ativador da amilase salivar. A presença de tampão é dispensável, pois a amilase salivar apresenta ampla faixa de pH ótimo (de 5 até 8) e a inclusão do habitual tampão fosfato pH 7,0 geraria uma incompatibilidade com a presença de cor (CaCl2).

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6.CONCLUSÃO Durante os experimentos trabalhou-se com dois tipos diferentes de polissacarídio, um de origem vegetal, o amido, e outro de origem animal, o glicogênio. Na extração destes das suas respectivas células, pode-se notar uma grande diferença: a complexidade para extrair glicogênio das células do fígado comparado à extração do amido das células da batata. Isso ocorre devido a diferença de estrutura molecular entres esses carboidratos, sendo aquele altamente ramificado. Na execução das reações de coloração para a caracterização dos carboidratos percebe-se que os compostos contendo iodo, são convenientes à identificação, tanto a do amido, composto por amilose e amilopectina, quanto a do glicogênio. Na precipitação dos dois diferentes carboidratos percebe-se uma maior complexidade para trabalhar com o polissacarídeo glicogênio. Sendo necessário leva-lo a uma centrifugadora para que se pudesse precipita-lo com o auxílio de um método físico, o mesmo não ocorre com o amido que é precipitado apenas com a adição de determinadas substância, destacando-se o álcool etílico, utilizado na precipitação dos dois. Essa diferença ocorre pelo mesmo motivo da complexidade de extração do glicogênio comparado com o amido, já que aquele contem uma estrutura molecular muito mais complexa que este.

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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS LEHNINGER, ALBERT LESTER. Princípios de bioquímica. 4ª edição. São Paulo: SARVIER, 2006. MARZZOCO, ANITA & TORRES, BAYARDO B. Bioquímica Básica. 3ª edição. Rio de Janeiro: GUANABARA KOOGAN, 2007. Teste do amido. <www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticasch/testeamido.html>. Acessado em: 05 de abril de 2010.

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