Universidade do Vale do Itajaí

Escola do Mar, Ciência e Tecnologia.

Curso de Engenharia Química

ALLAN SATURNINO DA SILVA

RAFAEL MELO DO NASCIMENTO

PRÁTRICA: CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS POR MEIO DE

REAÇÕES DE COLORAÇÃO E PRECIPITAÇÃO

Itajaí – SC
2018
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ALLAN SATURNINO DA SILVA

RAFAEL MELO DO NASCIMENTO

PRÁTRICA: CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS POR MEIO DE

REAÇÕES DE COLORAÇÃO E PRECIPITAÇÃO

Elaboração de relatório como requisito parcial para

a obtenção de nota para a M1 da disciplina de
Engenharia Bioquímica, do curso de Engenharia
Química da Universidade do Vale do Itajaí, Escola
do Mar, Ciência e Tecnologia.

Professor: Pablo Angel Sanchez Podlech

Itajaí – SC
2018
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RESUMO

O relatório apresenta pontos importantes da prática realizada no dia

23/08/2018 no laboratório química. Nesta prática realizou-se a caracterização de
proteínas por meio de reações de coloração e precipitação. As reações envolvidas
na prática são: Coloração com ninhidrina e com biureto, precipitação por ação do
calor, reagentes para alcaloides, sais de metais pesados, ação por solventes
orgânicos e efeito de adição de sais. Todos os resultados atingiram as
características pré-estabelecidas pelos conceitos teóricos. Desta forma, o relatório
apresenta toda fundamentação teórica para um melhor entendimento da prática,
bem como a metodologia, discussão dos resultados obtidos e conclusão.

Palavras-chave: Proteínas. Caracterização. Coloração. Precipitação.

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 5

2. OBJETIVO .............................................................................................................. 6

2.1 Objetivo geral .............................................................................................. 6

2.1.1 Objetivos específicos ............................................................................. 6

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .............................................................................. 7

3.1. Reação de Coloração com Ninhidrina .......................................................... 7

3.2. Reação de Coloração com Biureto................................................................ 7
3.3. Reação de Precipitação por Ação do Calor .................................................. 7
3.4. Reação de Precipitação com os Reagentes para Alcaloides ...................... 8
3.5. Reações de Precipitação com Sais de Metais Pesados .............................. 8
3.6. Reações de Precipitação por Ação de Solventes Orgânicos ..................... 8
3.7. Reação de Precipitação com Efeito de Adição de Sais ............................... 8

4. MATERIAIS E MÉTODOLOGIA ........................................................................... 10

4.1 Materiais e Reagentes ................................................................................... 10

4.2 Procedimento Experimental ......................................................................... 11
4.2.1 Reação de Coloração com Ninhidrina ....................................................... 11
4.2.2 Reação de Coloração com Biureto............................................................ 11
4.2.3 Reações de Precipitação por Ação do Calor ............................................. 11
4.2.4 Reações de Precipitação com Reagentes para Alcaloides ....................... 11
4.2.5 Reação de Precipitação com Sais de Metais Pesados ............................. 11
4.2.6 Reação de Precipitação com Solventes Orgânicos .................................. 12
4.2.7 Reação de Precipitação com Efeito de Adição de Sais............................. 12

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 13

6. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 16

7. QUESTÕES RESOLVIDAS .................................................................................. 17

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 19

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1. INTRODUÇÃO

As proteínas são as moléculas orgânicas mais abundantes e importantes nas

células. São encontrados em todas as partes de todas as células, uma vez que são
fundamentais sob todos os aspectos da estrutura e função celulares. Existem muitas
espécies diferentes de proteínas, cada uma para uma função biológica diversa. Além
disso, a maior parte da formação genética é expressa pelas proteínas. Os
aminoácidos encontrados nas proteínas possuem em comum a presença de um
grupo amino (-NH2), um grupo carboxila (-COOH), um átomo de hidrogênio (H) e um
radical R diferenciado (cadeia lateral), ligados a um átomo de carbono (C). O estudo
de aspectos importantes da bioquímica nos leva ao estudo de proteínas. Sendo
assim, torna-se importante a existência de métodos adequados de purificação e
quantificação destes compostos.
Devido às ligações peptídicas e à presença de diferentes aminoácidos, as
proteínas reagem com uma variedade de reagentes, formando produtos coloridos.
Algumas reações de coloração são especificas para aminoácidos encontrados em
proteínas e essas reações são importantes tanto na detecção como na dosagem de
aminoácidos e proteínas. Outras reações, mais importantes, são aquelas chamadas
de gerais, porque irão caracterizar grupamentos comuns a todas as proteínas, ou
seja, grupo amino e ligações peptídicas.
A importância das proteínas, entretanto, está relacionada com suas funções
no organismo, e não com sua quantidade. Todas as enzimas conhecidas, por
exemplo, são proteínas; muitas vezes, as enzimas existem em porções muito
pequenas. Mesmo assim, estas substâncias catalisam todas as reações metabólicas
e capacitam aos organismos a construção de outras moléculas - proteínas, ácidos
nucléicos, carboidratos e lipídios - que são necessárias para a vida.
Todas contêm carbono, hidrogênio, nitrogênio e oxigênio, e quase todas
contêm enxofre. Algumas proteínas contêm elementos adicionais, particularmente
fósforo, ferro, zinco e cobre. Seu peso molecular é extremamente elevado.
Todas as proteínas, independentemente de sua função ou espécie de origem, são
construídas a partir de um conjunto básico de vinte aminoácidos, arranjados em
várias sequências específicas.
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2. OBJETIVO
O tópico está dividido em objetivo geral e os objetivos específicos.

2.1 Objetivo geral

Tem-se como objetivo geral a caracterização de proteínas por meio de reações de
coloração e precipitação.

2.1.1 Objetivos específicos

 Caracterização da proteína por reação de coloração com Ninhidrina;
 Caracterização da proteína por reação de coloração com Biureto;
 Caracterização da proteína por meio da reação de precipitação com
reagentes para alcaloides;
 Caracterização da proteína por meio da reação de precipitação com sais de
metais pesados;
 Caracterização da proteína por meio da reação de precipitação com
solventes orgânicos;
 Caracterização da proteína por meio da reação de precipitação com efeito de
adição de sais;
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3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
A seguir estão descritas algumas definições pertinentes para servir de
base para o seguinte trabalho.

3.1. Reação de Coloração com Ninhidrina

A reação da ninhidrina é usada na detecção de aminoácidos por ser
característica da função amina primária. A ninhidrina é um poderoso agente oxidante
que reage com aminoácidos, entre pH 4 e 8, originando um composto de cor
púrpura, que não apresenta sempre a mesma intensidade de coloração. Os
aminoácidos prolina e hidroxiprolina são exceções, pois apresentam coloração
amarela (OLIVEIRA, 2010).

3.2. Reação de Coloração com Biureto

A reação do Biureto é devida às ligações peptídicas, dando positiva para
proteínas e peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácidos. A reação é
também positiva para as substâncias que contém 2 grupos carbamínicos (-CO-NH2)
ligados diretamente ou através de um único átomo de carbono ou nitrogênio. Este é
o caso do Biureto que dá reação positiva e de onde provém o nome da mesma. As
proteínas ou peptídeos, quando tratados por uma solução de sulfato de cobre, em
meio alcalino, formam uma coloração violeta característica (OLIVEIRA, 2010).

3.3. Reação de Precipitação por Ação do Calor

A estrutura terciária de uma proteína é mantida por interações hidrofóbicas
entre os radicais apolares que se abrigam no meio aquoso, procurando se
agruparem no interior do glóbulo proteico, pelas atrações iônicas entre os radicais
carregados com cargas opostas, pelas pontes dissulfeto, pontes de hidrogênio,
interações hidrofóbicas ou ainda pelas forças de Van der Waals. Ao fornecer energia
a um meio aquoso contendo proteínas, atrações entre os radicais são desfeitas e a
proteína é "desenrolada", expondo, ao meio aquoso seus radicais apolares que
estavam contidos no seu interior, isto é que leva à desnaturação (OLIVEIRA, 2010).
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3.4. Reação de Precipitação com os Reagentes para Alcaloides

Determinados agentes, como os reagentes para alcaloides podem ser usados
na precipitação de proteínas, o que é útil na desproteinização de materiais
biológicos, como o sangue: ânions de ácidos complexos (tricloroacético, tânico,
fosfotúngstico) formam sais insolúveis onde a proteína funciona como cátion
(OLIVEIRA, 2010).

3.5. Reações de Precipitação com Sais de Metais Pesados

A adição de sais de metais pesados, tais como mercúrio, chumbo, cobre e
zinco, levam à formação de sais denominados "quelatos" entre os aminoácidos
ácidos e estes metais. A proteína precipita porque estes sais são insolúveis em água
e também porque, com a quebra das ligações iônicas, os aminoácidos hidrofóbicos
ficam mais expostos ao meio aquoso (OLIVEIRA, 2010).

3.6. Reações de Precipitação por Ação de Solventes Orgânicos

A adição de solventes orgânicos, como o etanol, éter etílico e acetona, às
soluções aquosas de proteínas pode levar à precipitação das mesmas. Isto pode ser
explicado pelo fato destes solventes apresentarem uma constante dielétrica inferior
à da água. Solventes orgânicos em baixas temperaturas (0º C ou menos) são úteis
para a separação de misturas proteicas, porque as proteínas podem ser precipitadas
sem sofrerem desnaturação. Entretanto, a temperatura mais elevada, os solventes
orgânicos podem levar à desnaturação por romperem pontes de hidrogênio e
interações apolares, importantes na manutenção da conformação proteica. A água
tem uma alta constante dielétrica, assim a força de atração entre moléculas
proteicas contendo radicais com cargas opostas é baixa, predominando a interação
proteína-água em vez da interação proteína-proteína. A adição de solventes, pode
inverter esta situação, levando à agregação e precipitação das moléculas proteicas
(OLIVEIRA, 2010).

3.7. Reação de Precipitação com Efeito de Adição de Sais

A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade das proteínas, é
uma função de sua força iônica, que tanto depende de sua concentração como na
valência de cátions e ânions que formam o sal. Em concentração reduzida, os sais
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aumentam a solubilidade de muitas proteínas, um fenômeno denominado “salting-

in”, provavelmente devido à interação da proteína com os sais causando diminuição
da interação proteína-proteína e, portanto, aumentando a solubilidade.
As proteínas podem ser precipitadas sem sofrer desnaturação por ação de
solventes orgânicos, como foi explicado anteriormente, variação do pH e por
alterações da força iônica do meio. A variação do pH pode ser usada para precipitar
proteínas no seu ponto isoelétrico, pH no qual a repulsão eletrostática entre as
moléculas é mínima. Este efeito é denominado de “salting-out”. As proteínas podem
ser ressolubilizadas mantendo as suas características estruturais nativas por uma
variação de pH acima ou abaixo do ponto isoelétrico. (OLIVEIRA, 2010).
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4. MATERIAIS E MÉTODOLOGIA

Neste capítulo são apresentados os materiais, equipamento e todo

procedimento experimental envolvido na prática.

4.1 Materiais e Reagentes

Os materiais e reagentes utilizados na prática estão listados abaixo:

 Tubos de vidro;
 Estante de arame para tubos de ensaios;
 Agitador magnético com aquecimento;
 Béquer de 50 e 500 mL;
 Bastão de Vidro;
 Pedras de Ebulição (porcelana);
 Pipeta volumétrica de 1,0 e 2,0mL;
 Pêra pipetadora 3 vias;
 Micropipeta;
 Água destilada;
 Solução de Ninhidrina;
 Solução de Proteína 10,0%;
 Solução de Hidróxido de Sódio 2,5 mols/L;
 Solução de Sulfato de Cobre 1,0%;
 Solução de Ácido Tricloroacético 10,0%;
 Solução de Acetato de Chumbo 5,0%;
 Solução de Álcool Etílico;
 Solução de Cloreto de Sódio 1,0 mol/L;
 Solução de Sulfato de Amónio;
 Clara in Natura.
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4.2 Procedimento Experimental

4.2.1 Reação de Coloração com Ninhidrina

Em um tubo de ensaio (tubo 1) adicionou-se 2,0mL de solução de ninhidrina e

5 gotas de solução de proteína 10%. Posteriormente o tubo foi aquecido em banho
maria no agitador magnético por cinco minutos, anotou-se os resultados observado.

4.2.2 Reação de Coloração com Biureto

Em um tubo de ensaio (tubo 2) colocou-se 1,0mL de solução de proteínas, 5

gotas de solução de NaOH 2,5M e 3 gotas de solução de sulfato de cobre 1,0%. Em
outro tubo de ensaio (tubo 3), adicionou-se 1,0mL de água destilada, 5 gotas de
solução de NaOH 2,5M e 3 gotas de solução de sulfato de cobre 1,0%.
Posteriormente anotou-se os resultados observado.

4.2.3 Reações de Precipitação por Ação do Calor

Em um tubo de ensaio (tubo 4) colocou-se 2,0mL de solução de proteínas

10%, o tubo foi aquecido em banho maria no agitador magnético por três minutos,
anotou-se os resultados observado.

4.2.4 Reações de Precipitação com Reagentes para Alcaloides

Em um tubo de ensaio (tubo 5) colocou-se 1,0mL de solução de proteínas

10% e 1,0mL de ácido tricloroacético 10%, agitou-se o tubo e posteriormente
anotou-se os resultados observado.

4.2.5 Reação de Precipitação com Sais de Metais Pesados

Em um tubo de ensaio (tubo 6), colocou-se 1mL de solução de proteínas 10%

e 1,0mL de solução de acetado de chumbo 5,0%, agitou-se o tubo e posteriormente
anotou-se os resultados observado.
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4.2.6 Reação de Precipitação com Solventes Orgânicos

Em um tubo de ensaio (tubo 7), colocou-se 1,0mL de solução de proteínas

10% e 3mL de solução de álcool etílico, agitou-se o tubo e posteriormente anotou-se
os resultados.

4.2.7 Reação de Precipitação com Efeito de Adição de Sais

Em um béquer (número 8) de 50 mL, colocou-se 3mL de clara in natura

juntamente com 3mL de água destilada, agitou-se a solução com auxílio de um
bastão de vidro até o aparecimento de precipitado. Em seguida gotejou-se no
béquer a solução de cloreto de sódio 1,0 mol/L, foram gotejadas cerca de 25 gotas
até redissolução do precipitado.
Com o auxílio de uma pipeta adicionou-se 2mL da solução do béquer 8 em
outro béquer (número 9), posteriormente acrescentou-se 4mL de solução saturada
de sulfato de amônio. Observou-se a anotou-se os resultados. Por fim, adicionou-se
ao béquer de 4 a 6mL de água destilada e anotou-se os resultados obtidos.
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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na reação da ninhidrina, o aquecimento da solução de proteínas (tubo 1)

desestabiliza a estrutura tridimensional do peptídeo. A ninhidrina reage com o
grupamento amina presente nos aminoácidos, formando como produto final um
complexo de coloração azul-violeta.
Na reação do biureto, o NaOH, presente em solução, conduz a cadeia
peptídica a um desarranjo em sua estrutura tridimensional. Os íons Cu 2+ presentes
em solução, originados do sulfato de cobre, formam um complexo com os
aminoácidos, estabelecendo interações com os átomos de nitrogênio da cadeia
peptídica. Esse complexo formado confere uma coloração púrpura característica a
solução. Esta reação é positiva para proteínas e peptídeos com três ou mais
resíduos de aminoácidos. A reação também é positiva para substâncias que
contenham dois grupos carbamínicos (-OC-NH2-) ligados diretamente ou através de
um único átomo de carbono ou nitrogênio. A solução com proteína (tubo 2), quando
submetida à reação do biureto, apresentou coloração púrpura, indicando a provável
presença de peptídeos em solução. A solução de água destilada (tubo 3) submetida
ao mesmo procedimento apresentou coloração azul clara, provavelmente devido à
alcalinização do sulfato de cobre.
No procedimento de precipitação de proteínas por ação do calor, o calor
fornecido a proteína provoca desestabilização das interações fracas acarretando em
um desarranjo da conformação tridimensional desta estrutura. Esse fenômeno
recebe o nome de desnaturação e altera as estruturas secundária, terciária e
quaternária das proteínas, não afetando suas estruturas primárias (pontes dissulfeto
e ligações covalentes não são afetadas). A desnaturação promove alterações na
solubilidade da proteína, levando à sua precipitação. Com o aquecimento da solução
de proteínas (tubo 4), verificou-se precipitação.
No procedimento de precipitação por sais de metais pesados (tubo 6), deve-
se verificar o efeito destas substâncias sobre a solubilidade da proteína. Os cátions
de metais pesados formam precipitados insolúveis de proteínas, denominados de
acordo com o elemento formador. Essa precipitação é mais intensa quando o pH
está acima do ponto isoelétrico. Isso porque, acima do ponto isoelétrico, a carga
líquida sobre a proteína é negativa, favorecendo a interação com os cátions
provenientes do sal. Quando a proteína está abaixo do seu ponto isoelétrico, a carga
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líquida total da molécula é positiva. O precipitado pode ser ressolubilizado através

de alterações do pH. Verifica-se que na adição de sais de metais pesados como de
ácidos orgânicos fortes ocorreram precipitação.
Na reação de precipitação com reagentes para alcaloides foi possível
identificar a formação de um precipitado esbranquiçado e viscoso grudado na
parede do (tubo 5) logo que se adicionou o ácido tricloroacético (TCA). Nesse
experimento, o sal serve como ‘ponte’/interage entre a proteína e o meio, auxiliando
assim, as interações proteína-água. O fato de se adicionar ácido tricloroacético
solução de proteínas, reduz o pH do meio, tornando positiva a carga da proteína, o
que contribui para a formação de um complexo insolúvel – o tricloroacetato de
proteína.
Na reação de precipitação com sais de metais pesados observou-se
pequenos precipitados semelhantes a fios brancos na solução do (tubo 6). O acetato
de chumbo, na solução proteica, dissocia-se liberando seus cátions e torna o meio
alcalino. Essa característica do meio pH situado no lado alcalino do ponto isoelétrico
das proteínas é favorável à combinação de algumas proteínas com os cátions do
sal, formando proteinatos insolúveis.
Na reação de precipitação por ação de solventes orgânicos formou-se uma
mistura esbranquiçada (tubo 7). A interação proteína-água é maior que a interação
proteína-proteína devido à baixa força de atração entre as moléculas proteicas,
fazendo com que a proteína se solubilize na água.
Na Reação de precipitação com efeito de adição de sais, após agitação da
solução de água destilada e clara de ovo (béquer 8), formou-se um precipitado
(globulinas) semelhantes a pontos brancos na solução. Com a adição de 25 gotas
de solução de cloreto de sódio, houve a redissolução desse precipitado. Formou-se
duas fases: a fase inferior era esbranquiçada e superior, transparente. Então, após o
acréscimo de 4 a 6mL de água destilada houve a redissolução desse precipitado
(béquer 9). Tais fenômenos estão relacionados à precipitação da proteína sem que
ocorra a sua desnaturação.
As Figuras 5.1 e 5.2 mostram os tubos e béqueres, respectivamente, com os
produtos formados de cada método utilizado.
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Figura 5.1 – A figura apresenta todos os tubos após as etapas descritas na seção 4.2.1 até 4.2.6.

Figura 5.2 – A figura apresenta os béqueres após as etapas descritas na seção 4.2.7.
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6. CONCLUSÕES

As reações de coloração e precipitação de proteínas permitem a

caracterização dessas pela análise de suas propriedades químicas e físicas, entre
elas, a presença de ligações peptídicas, estrutura molecular, solubilidade, força
iônica e concentração molar. As reações de coloração não alteram a estrutura
tridimensional da proteína, ao contrário das reações de precipitação que podem
alterar as estruturas.
Todos os resultados atingiram as características pré-estabelecidas pelos
conceitos teóricos, desta forma visualizou-se fisicamente o conteúdo que foram
abordados em sala de aula.
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7. QUESTÕES RESOLVIDAS

1. Em que se fundamenta a reação da ninhidrina e que classes de substâncias

reagem positivamente?
R: Usando a ninhidrina conseguimos identificar a presença de aminas na solução,
dando positivo para proteínas, peptídeos, aminoácidos, aminas primárias e amônia.
É usada esta reação para detectar qualitativamente e quantitativamente os
aminoácidos. A ninhidrina reage com aminoácidos produzindo uma coloração roxa.
É uma reação inespecífica quanto à identidade do aminoácido, sendo a reação
dependente da presença de grupos amina livres.

2. Em que se fundamenta a reação do Biureto e que grupo nas proteínas são

responsáveis por esta reação? Qual a importância da reação do Biureto?
R: A reação do Biureto é importante para demonstrar a presença de proteínas em
materiais biológicos, como também para quantificá-las.

3. Qual é a importância das reações de precipitação de proteínas por

reagentes dos alcaloides e por sais de metais pesados? Explique os
mecanismos das precipitações.
R: Os cátions de metais pesados como Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+ e Zn2+
formam precipitados insolúveis de proteínas, denominados de acordo com o
elemento formador (exemplo: 9 proteinatos de mercúrio, proteinatos de chumbo,
etc.). Essa precipitação é mais intensa quando o pH está acima do ponto isoelétrico
(pI). Isso porque, acima do pI, a carga líquida sobre a proteína é negativa,
favorecendo a interação com os cátions provenientes do sal. Quando a proteína está
abaixo do seu pI, a carga líquida total da molécula é positiva. Isso facilita a interação
da molécula com os ânions provenientes de ácidos como o tunguístico, o
fosfotúngstico e pícrico. Nas duas situações o precipitado pode ser ressolubilizado
através de alterações do pH. Verifica-se que na adição de sais de metais pesados
como de ácidos orgânicos fortes ocorreram precipitação.

4. Explique os mecanismos que levam uma proteína a se dissolver quando há

um pequeno aumento na forca iônica da solução e os mecanismos que
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levam uma proteína a precipitar quando há um grande aumento na forca

iônica da solução.
R: Quando sais neutros são adicionados ao sistema ocorre um aumento da força
iônica do sistema. Os íons carregados provenientes da dissociação dos sais passam
a interagir com as moléculas proteicas, diminuindo a interação entre as próprias
moléculas da proteína. Deste modo, temos um aumento na solubilidade da proteína
em meio aquoso. A esse fenômeno dá-se o nome de salting-in. Este efeito, porém,
não se estende infinitamente. Em condições de elevada força iônica, as moléculas
de água apresentam maior tendência de solvatação de partículas (nesse caso, os
íons). As moléculas de água, desse modo, interagem mais com os íons, desfazendo
suas interações com a estrutura proteica. Como consequência, temos: maiores
interações proteína-proteína, resultando na diminuição da solubilidade em meio
aquoso. A esse fenômeno dá-se o nome de salting-out.

5. Que mudanças ocorrem com uma proteína quando em contato com o

etanol?
R: Para os solventes orgânicos, a constante dielétrica é bem inferior à da água e,
assim, a interação proteína-proteína se sobressai e, consequentemente, a proteína
precipita.

6. As solubilidades de duas proteínas em função da concentração de sulfato

de amônio estão mostradas no diagrama abaixo. Como esta observação
pode ser usada para separar as proteínas A e B?

R: A adição de sais neutros, principalmente sulfato de amônio a elevadas

concentrações reduz a disponibilidade da água devido à hidratação dos íons criando
condições para a precipitação, a qual ocorre principalmente por interação das zonas
hidrófobas. O sal e outros precipitantes não provocam a precipitação de todas as
proteínas do meio, pois o seu efeito é o de reduzir a solubilidade. Com isso, a
concentração de sal ou solvente que provoca a precipitação varia com a
concentração da proteína e a presença de outras proteínas contaminantes.
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8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

OLIVEIRA, Gabriela Bitto. PROTEINAS: REAÇÕES DE COLORAÇÃO E

PRECIPITAÇÃO. Disponível em: < https://pt.scribd.com/doc/29031871/PROTEINAS-
Reacoes-de-coloracao-e-precipitacao/>. Acesso em: 29 ago. 2018

PODLECH, Pablo Angel Sanchez. ROTEIRO DA AULA PRÁTICA: Reações de

Caracterização das Proteínas. Universidade do Vale do Itajaí. Itajaí, 2018.

SOLOMONS, T.W.G. Fundamentals of Organic Chemistry. 4ª edição.