UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
LABORATÓRIO DE ENGENHARIA QUÍMICA III

Atividade da Enzima Invertase livre

Prof: Gisella Maria Zanin

Acadêmicos:
Andressa C. dos Santos RA: 52566
Flávio s. Ramos :52738
Pedro H. F. Rossi :54442
Vinícius Lipori Lemos :54457

Maringá, Abril de 2012

 ÍNDICE (ARRUMAR)
RESUMO................................................................................................................................1
INTRODUÇÃO......................................................................................................................1
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA..........................................................................................1
ENZIMAS...........................................................................................................................1
CINÉTICA ENZIMÁTICA EM FASE HOMOGÊNEA....................................................1
ATIVIDADE ENZIMÁTICA.............................................................................................2
MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................................2
MATERIAIS.......................................................................................................................2
MÉTODOS.........................................................................................................................3
RESULTADOS.......................................................................................................................3
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA INVERTASE LIVRE....................3
DETERMINAÇÃO DA ENERGIA DE ATIVAÇÃO DA ENZIMA INVERTASE
LIVRE.................................................................................................................................6
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS......................................................................................7
CONCLUSÃO........................................................................................................................7
BIBLIOGRAFIA....................................................................................................................7
1. TÍTULO

Atividade da enzima invertase livre.

2. RESUMO

A prática baseia-se na determinação da atividade da enzima invertase na forma

solúvel, através do método das velocidades iniciais.
A atividade da enzima invertase na forma solúvel foi determinada de 45 a 60C, com
intervalo de 5C. Para o estudo, utilizou-se a reação da hidrólise da sacarose pela ação da
enzima invertase livre em reator batelada. As propriedades da enzima invertase foram
determinadas com solução de sacarose 5% p/v e pH 4,5, tendo-se caracterizado a enzima
através da determinação da atividade e da energia de ativação da reação.

3. INTRODUÇÃO

As enzimas estão entre as biomoléculas mais notáveis devido a sua extraordinária

especificidade e poder catalítico, que são muito superiores aos dos catalisadores produzidos
pelo homem. As enzimas são catalisadores cujo objetivo é acelerar as reações químicas que
ocorrem nos organismos. Muitas destas reações não só são aceleradas pelas enzimas, como
não ocorreriam com amplitude apreciável à temperatura do corpo sem a presença delas.
A utilização das enzimas é de grande importância, pois as mesmas auxiliam na
quebra de grandes moléculas de nutrientes, como proteínas, gorduras e carboidratos em
moléculas menores, permitindo a passagem por sua membrana. Também são responsáveis
pela estocagem e liberação de energia.
A enzima invertase é utilizada na hidrólise da sacarose a xarope de glicose e frutose,
que é muito utilizado na indústria alimentícia.
Essa reação enzimática apresenta vantagens em relação aos métodos tradicionais de
hidrólise ácida com ácido sulfúrico, pois o consumo energético é menor, além de o produto
obtido ser de melhor qualidade.

4. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
4.1. ENZIMAS

Enzimas são catalisadores biológicos, formados por proteínas, que participam nas
reações metabólicas de todos os organismos vivos. Atuam de forma a acelerar uma reação
bioquímica, reduzindo a energia de ativação, sem, no entanto alterar a constante de
equilíbrio ou a energia livre da reação. Estão presentes no metabolismo dos organismos
vivos e são responsáveis pela biossíntese de inúmeros compostos, sob condições de
temperatura e pressão semelhantes ao do ambiente.
Algumas reações não só são aceleradas, como também não ocorreriam em
determinadas situações, ou então exigiram uma quantidade de energia inviável para o
organismo. As enzimas, como os catalisadores orgânicos, saem inalteradas após sua
aplicação nos processos. Cada enzima é responsável por um único tipo de reação química,
ou seja, ela tem alta especificidade em se tratando de substrato. Seu uso industrialmente é
muito grande, onde se destacam na preparação de alimentos, remédios e um enorme
número de compostos químicos.
As fontes de enzimas industriais são de origem animal, vegetal, bacteriana e fúngica,
sendo essas duas últimas as quais irão se falar nesse trabalho.
As enzimas, como as outras proteínas, têm peso molecular variando de perto de 12000
até acima de um milhão. Elas são, portanto, muito grandes quando comparadas com os
substratos ou com os grupos funcionais sobre os quais elas agem.
Apesar das várias vantagens das enzimas como catalisadores, o uso das mesmas em
aplicações industriais tem sido limitado, porque a maioria das enzimas é relativamente
instáveis, seu custo é alto e é difícil recuperar a enzima ativa no final do processo. Isso
restringe o uso de enzimas solúveis a processo em batelada, seguido de procedimentos para
separar o produto da mistura reacional, levando à desnaturação da enzima e tornando o
processo, na maioria das vezes, antieconômico.
A sacarose é o dissacarídeo mais importante, tanto pela quantidade e freqüência
com que é encontrado na natureza, como pela sua importância na alimentação humana.
Apesar de suas principais fontes serem a cana-de-açúcar e a beterraba, a sacarose é
encontrada em todas as plantas que sofrem o processo de fotossíntese.
Sendo um dissacarídeo não redutor, a sacarose não reage com solução de Fehling ou
solução amoniacal de íons de prata, nem sofre muta-rotação. É facilmente hidrolisada por
soluções diluídas de ácidos minerais ou por enzimas (invertase) com formação de D-glicose
e D-frutose.
Invertase ou frutofuranosidade é uma enzima que catalisa a hidrólise da sacarose,
produzindo o que comumente se denomina açúcar invertido, que consiste numa mistura
equimolar de glicose e frutose. A enzima possui a capacidade de dividir a molécula de
sacarose em glicose e frutose.

4.2. CINÉTICA ENZIMÁTICA EM FASE HOMOGÊNEA

A funcionalidade biológica das enzimas depende da manutenção de sua estrutura

protéica nativa que contém uma região chamada de centro ativo onde situa-se sua
capacidade catalítica. O centro ativo é uma estrutura formada por aminoácidos residuais
com alta afinidade pelo substrato.
Por cinética enzimática entende-se a análise quantitativa do efeito de cada um dos
fatores que influencia a atividade enzimática, avaliada através do aumento ou redução da
velocidade da reação catalisada. A atividade da enzima, e portanto a cinética enzimática, é
determinada pela concentração da enzima, concentração do substrato e sua disponibilidade,
concentração de cofatores, concentração e tipo de inibidores(quando presentes), e ainda pH
e temperatura.
Convencionalmente, em cinética enzimática o conceito de velocidade de reação está
associado à velocidade inicial, onde a influência de muitos fatores é desprezível.
O avanço de grande parte das reações enzimáticas, a velocidade de reação diminui
com o tempo. Os fatores que podem contribuir para esta diminuição da velocidade de
reação podem ser:
 Produto da reação inibe a enzima;
 O grau de saturação da enzima com o substrato pode diminuir devido ao decréscimo
da concentração de substrato, a medida que avança a reação;
  As reações reversas podem se tornar a medida que a concentração do produto
aumenta;
 A enzima pode sofrer inativação térmica ou pelo PH.
Se estes fatores acima mencionados não tiverem tempo de se manifestar, a
atividade enzimática é determinada a partir da medida da velocidade inicial da reação pois
neste ponto as condições em que a reação se processa são exatamente conhecidos.

5.3. ATIVIDADE ENZIMÁTICA

A determinação da atividade da enzima envolve a medida da velocidade da reação,

portanto, as seguintes definições devem ser conhecidas:

 Atividade: uma unidade “U” de atividade é a quantidade de enzima que catalisa a

transformação de 1mol de produto por minuto, nas condições de ensaio
(temperatura, pH, concentração de substrato, etc.)(U = moles de produto/minuto).
 Atividade específica: é expressa em termos da atividade por miligrama de proteína
(U/mg).
A atividade catalítica das enzimas depende da temperatura, e como no caso dos
catalisadores convencionais, à medida que se aumenta a temperatura a taxa da reação
aumenta, porém, a estabilidade da proteína descreve a desativação térmica.
A atividade catalítica das enzimas é altamente dependente da temperatura, como no
caso dos catalisadores convencionais, porém, à medida que se eleva a temperatura dois
efeitos ocorrem simultaneamente: (i) a taxa de reação aumenta, como se observa na maioria
das reações químicas; (ii) a estabilidade da proteína decresce devido à desativação térmica.
A influência da temperatura sobre a atividade da enzima livre ou imobilizada é,
geralmente, representada em termos de atividade ou velocidade de reação em função da
temperatura.
Para o cálculo da atividade enzimática (A) utilizou-se a seguinte equação:

µmols de glicose +frutose

A=b . (U ) ( 1 )
min

E a atividade específica (Ae) da enzima:

A μmoles de gli cos e

Ae= .
mg de proteína utilizadas min .mg (2)

Onde:
y = a  b.t é dada nos gráficos de µmols de glicose + frutose versus tempo.
a = coeficiente linear da reta ajustada.
b = coeficiente angular da reta ajustada.
t = tempo de reação (min).
y = µmoles de glicose + frutose.
 Para o calculo da energia de ativação (Ea), utiliza-se o gráfico de ln da atividade
versus o inverso da temperatura, a equação para a determinação é:

−Ea
=b
R
Ea =−b . R( J ) ( 3 )

Onde:
y = a  b.t é dada nos gráficos de ln da atividade versus o inverso da temperatura.
a = coeficiente linear da reta ajustada.
b = coeficiente angular da reta ajustada.
1/T = inverso da temperatura (1/K).
y = ln da atividade.
R= constante universal dos gases perfeitos.

6. MATERIAIS E MÉTODOS

6.1. MATERIAIS

 Solução de sacarose 5% p/v, pH 4,5 tamponada com tampão acetato de sódio;

 Solução de invertase solubilizada na concentração de 1g/L;
 Banho termostático;
 Reator batelada encamisado, com agitação (CSTR);
 Banho contendo água em ebulição;
 Tubos de ensaio;
 Reagente DNS;
 Água destilada;
 Cronômetro;
 Espectrofotômetro;
 Termômetro;
 Proveta 50 ml;
 Balão volumétrico;
 Pipetas automáticas;
 Agitador “vortex”;

6.2. MÉTODOS

Primeiramente regulou-se a temperatura de 45º C no banho termostático, e diluiu-se

a enzima livre em 1:20 (0,5mL de solução de enzima + 9,5mL de água).
Após alcançada a estabilidade da temperatura, adicionou-se 50 ml de solução de
sacarose no reator e com a agitação ligada, aguardou-se até a temperatura desejada.
Foi retirada o branco para a leitura da absorbância contendo 0,5mL de sacarose +
2,0 mL de água.
 Depois, no reator, foi adicionado 1 mL da solução de enzima com uma
concentração de 0,05 mg/mL, e imediatamente acionou-se o cronômetro. Após 10s,
retirou-se uma amostra de 0,5mL e colocou-se a mesma em um tubo de ensaio contendo
2,0 mL de água. Com o tubo devidamente fechado para uma menor evaporação, levou-se
ao banho contendo água em ebulição por 10 minutos. As amostra de 0,5mL foram retiradas
do reator, com o auxílio da pipeta automática, em tempos de 3 em 3 minutos até atingir um
total de 21 minutos, sendo que todas foram levadas a fervura durante um período de 10
minutos.
Alcançado o tempo de fervura necessário para a inativação da enzima, as amostras
foram levadas a uma bacia com banho frio até que alcançasse a temperatura próxima a
ambiente.
Então, depois disso, feito a análise dos açúcares redutores transferindo-se 0,5mL de
cada amostra para outro tubo de ensaio, devidamente agitados para evitar soluções nas
paredes do tubo, adicionando-se 2,5mL de DNS. Os tubo foram então agitados e
devidamente fechados para evitar evaporação, e então levados em banho fervente por 10
minutos. Esfriou-se novamente em banho frio para atingir a temperatura ambiente, e
adicionou-se 3mL de água destilada. Agitou-se novamente os tubos e fez-se a leitura de
absorbância de cada amostra em um comprimento de onda de 600 nm.
Esta sequencia foi refeita para as temperaturas de 50ºC, 55ºC e 60ºC.

7. RESULTADOS

7.1. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA INVERTASE

LIVRE.

Para determinação da quantidade de glicose+frutose contida em cada amostra (mg/mL)

a partir dos dados de absorbância, é necessário a curva padrão do reagente utilizado, o
DNS, que foi fornecida pelo laboratório. A curva padrão para este experimento foi:

y = 0,4584x – 0,0152 (4)

O cálculo de moles de glicose+frutose foi obtido pela equação abaixo:

moles de glicose = Gr*Vr/PM (5)

Sendo:
Gr = glicose+frutose formada
Vr = Volume de reação
PM = peso molecular da glicose+frutose (0,360 mg/mol)

Os resultados obtidos para as diferentes temperaturas e o gráfico para determinação

da atividade são apresentados abaixo:
 Tabela 1- Atividade enzimática no ensaio à temperatura de 45C.
T (°C) 45
Pont Tempo (min) ABS Concentração (mg/mL) Volume (mL)
o µmol/mg
1 0,1667 0,022 0,405759162 50,0 1127108,784
2 3 0,049 0,294502618 49,5 809882,199
3 6 0,084 0,676265271 49,0 1840944,347
4 9 0,103 0,883507853 48,5 2380562,827
5 12 0,143 1,319808028 48,0 3519488,074
6 15 0,16 1,505235602 47,5 3972149,506
7 18 0,185 1,777923211 47,0 4642355,051
8 21 0,218 2,137870855 46,5 5522833,042

45 ºC
µmols de glicose + frutose

6000000
5000000 f(x) = 253967.39 x + 193564.92
4000000 R² = 0.99
3000000
2000000
1000000
0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
t (min)

Gráfico 1- Atividade enzimática para temperatura de 45C.

Tabela 2- Atividade enzimática no ensaio à temperatura de 50C.

T (°C) 50
Pont Tempo (min) ABS Concentração (mg/mL) Volume (mL)
o µmol/mg
1 0,1667 0,033 0,52574171 50,0 1460393,64
2 3 0,05 0,185427574 49,5 509925,829
3 6 0,097 0,698080279 49,0 1900329,649
4 9 0,128 1,036212914 48,5 2792018,131
5 12 0,15 1,27617801 48,0 3403141,361
6 15 0,2022 1,845549738 47,5 4870200,698
7 18 0,223 2,072425829 47,0 5411334,109
8 21 0,255 2,421465969 46,5 6255453,752
 50 ºC

µmols de glicose + frutose

7000000
6000000 f(x) = 313533.04 x − 170624.53
5000000 R² = 0.99
4000000
3000000
2000000
1000000
0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
t (min)

Gráfico 2- Atividade enzimática para temperatura de 50C.

Tabela 3- Atividade enzimática no ensaio à temperatura de 55C.

T (°C) 55
Pont Tempo (min) ABS Concentração (mg/mL) Volume (mL)
o µmol/mg
1 3 0,08 1,038394415 50,0 2884428,932
2 6 0,109 1,354712042 49,5 3725458,115
3 9 0,139 1,681937173 49,0 4578606,748
4 12 0,19 2,238219895 48,5 6030759,162
5 15 0,227 2,641797557 48,0 7044793,485
6 18 0,254 2,936300175 47,5 7748569,905
7 21 0,281 3,230802792 47,0 8435985,069

55 ºC
µmols de glicose + frutose

10000000
8000000 f(x) = 323417.6 x + 1897360.38
6000000 R² = 0.99

4000000
2000000
0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
t (min)

Gráfico 3- Atividade enzimática para temperatura de 55C.

Tabela 4- Atividade enzimática no ensaio à temperatura de 60C.

T (°C) 60
Pont Tempo (min) ABS Concentração (mg/mL) Volume (mL) µmol/mg
o
1 3 0,024 0,427574171 50,0 1187706,031
2 6 0,063 0,852966841 49,5 2345658,813
3 9 0,108 1,343804538 49,0 3658134,574
4 12 0,132 1,605584642 48,5 4326158,619
5 15 0,161 1,921902269 48,0 5125072,717
6 18 0,191 2,2491274 47,5 5935197,305
7 21 0,252 2,914485166 47,0 7610044,6

60 ºC
µmols de glicose + frutose

8000000
7000000
f(x) = 332297.99 x + 324991.69
6000000 R² = 0.99
5000000
4000000
3000000
2000000
1000000
0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
t (min)

Gráfico 4- Atividade enzimática para temperatura de 60C.

A atividade enzimática (A) foi calculada pela equação (1):

A = b/ ml de enzima utilizada

b = coeficiente angular da reta ajustada para os gráficos moles de glicose versus

tempo de reação.

Feito para todas as temperaturas.

A atividade específica (Ae) da enzima foi calculada pela equação (2):

Ae = b1/ mg de proteína utilizada

Feito para todas as temperaturas.

A quantidade de mg de proteína utilizada foi fornecida pelo técnico do laboratório,
sendo:
mg de proteína= 185 mg de proteína por g de pó

Abaixo estão demonstrados os resultados:

Tabela 5- Atividades enzimática e específica para cada temperatura:

 T(ºC) b Ai Ae
45 253967 253967 1372,795
50 313533 313533 1694,773
55 323418 323418 1748,205
60 332298 332298 1796,205
7.2.DETERMINAÇÃO DA ENERGIA DE ATIVAÇÃO DA ENZIMA
INVERTASE LIVRE.

A partir dos dados de atividade específica e temperatura, pode ser obtido o valor da
energia de ativação na hidrólise da sacarose em xarope de glicose e frutose, partindo da
equação abaixo:
Ea 1
ln ( A )=ln ( A0 )−
R T() (6)

Logo, construindo o gráfico lnAe versus 1/T, obtemos o coeficiente angular -Ea/R.

Tabela 6- Dados para o gráfico ln A versus 1/T.

Ae (µ ln Ativ 1/T (1/K)
moles/min.mg)
1372,794595 7,22460 0,003144654
4
1694,772973 7,43530 0,003095975
4
1748,205405 7,46634 0,00304878
5
1796,205405 7,49343 0,003003003
2

Ea
7.6
ln atividade específica

7.5 f(x) = − 1785.52 x + 12.89

7.4 R² = 0.79
7.3
7.2
7.1
7
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1/T

Gráfico 6- Gráfico para determinação da energia de ativação.

Logo,
-Ea/R = -1785,5

Sendo:
R=8,314 J.K-1. mol-1

Ea = 14,86 kJ/mol

8. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS.

9. CONCLUSÃO.
Este é um importante experimento para se adquirir uma consciência da cinética de
uma reação enzimática, sua dependência com a temperatura e uma estimativa da energia de
ativação para a reação. Para uma melhor determinação da energia de ativação seriam
necessários mais pontos com um intervalo de temperatura menores.

10. BIBLIOGRAFIA.
Bergamasco, R. “Cinética da hidrólise da sacarose pela invertase”. Dissertação de
mestrado. Universidade estadual de Londrina, 1989.

Zanin, G. M. “Sacarificação de amido em reator de leito fluidizado com enzima

amiloglicosidase imobilizada”. Tese de doutorado. Universidade estadual de Campinas,
1989.