Caracterização de Biomoléculas

Relatório 02 - Preparo do Reagente Bradford e Cálculo de

Curva Padrão com a Proteína Albumina

- Professor: Edson Júnior

- Aluno: Diego Pereira Guimarães Matrícula: 21601637

22 / 03 / 2018
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO..................................................................................................2
2. OBJETIVO.........................................................................................................2
3. MATERIAIS.......................................................................................................2
4. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS..........................................................3
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................6
6. CONCLUSÃO...................................................................................................6
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..........................................................................7

1
1. INTRODUÇÃO

Para as atividades de pesquisas e produção que necessita de purificação e

caracterização de biomoléculas, se faz necessário um método rápido e sensível para a
quantificação de proteínas. E um dos métodos usados que atende essa necessidade é o de
Bradford que baseia na adsorção de reagente de Coomassie Brilliant Blue G-250. Esse reagente
interage com as macromoléculas de proteínas que contém cadeias aminoácidos básicas ou
aromáticas, ocorrendo o deslocamento do reagente para a forma aniônica que absorve o
comprimento de luz de 595nm.
O método de Bradford é mais sensível que o método de Lowry e cols, utilizado para
determinar proteínas totais em diversos meios, tecidos vegetais, saliva, leite, plasma ou soro
sanguíneo.
Apesar de haver vantagens nesse método como ser altamente sensível e rápido, existe
algumas desvantagens, tais com DIMAS, A. relaciona, como a variação da absortividade
específica para diferentes proteínas, devido à baixa solubilidade, ou baixo peso molecular das
mesmas, e fornecimento de resultados nem sempre reprodutíveis devido ao grau de pureza do
corante BG-250 que varia conforme a procedência, sendo recomendável a padronização das
condições de reação para cada lote de corante adquirido.

2. OBJETIVO

Preparação de reagente de Bradford, para ensaio com a proteína Albumina obtendo o a

curva padrão..

3. MATERIAIS

- Funil de vidro;
- Brilnate azul G;
- Etanol absolute;
- Ácido fosfórico 85%;
- Papel filtro;

2
 - Eppendorfs;
- Pipetas;
- Ponteiras;
- Luvas;
- Balança de precisão;
- Beker’s;
- Proveta;
- Água destilada;
- Amostras variadas;
- Espectrofotômetro.

4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

4.1 Preparação do Reagente de Bradford

Foi dissolvido 20 mg do corante brilhante azul Blue G em 10 mL de etanol absoluto, em

seguida foi acrescentado 20 mL de ácido fosfórico, completou-se o volume para 1000 mL, após
isso o volume total foi filtrado em papel.

Fonte: Fotos da prática realizada no laboratório de aulas práticas do ICB.

4.1 Ensaio com o Reagente

Foram utilizadas 6 amostras de solução proteica, às seguintes concentrações: 0, 5, 20,

50, 100, 200. Foi adicionado com micropipeta 100 µL da cada amostra em microtubo tipo
eppendorf, em seguida acrescentou-se 1mL da solução reagente, para cada amostra foi
realizada em triplicata, após isso os tubos eppendorfs foram lidos em 595 nm no
espectrofotômetro. Para o branco foi adicionado 100 µL de H2O em um eppendorf e
acrescentou-se 1mL da solução reagente Bradford.

3
Fonte: Fotos da prática realizada no laboratório de aulas práticas do ICB.

Medidas de Absorbância

Tabela 01

4
Abs x Quantitativo de Proteína

Gráfico 01

Cálculo da Equação da Reta

5
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Conforme os dados obtidos no espectrofotômetro (tabela 01), e melhor visualizado no

gráfico 01 que foi plotado na ferramenta EXCEL, foi realizado o cálculo da equação da reta
conforme imagem 01, e obtido a curva padrão Y=0,00048x+0,660, sendo usado os valores de
absorbancia obtidos das amostras de concentração 20mg e 200mg.
Foram descartados os valores de absorbancia das amostras 0 mg e 5 mg, pois os
mesmos mostraram valores incompatíveis com uma curva padrão pois ao diminuir a
concentração de uma proteína em uma solução o valor da absorbancia lido no
espectrofotômetro diminui, ou seja, aumenta a transmissão de luz.
Essa enorme variação valores de absorbância pode ter ocorrido devido a contaminantes
nas soluções, ou devido as cubetas não terem sido limpas adequadamente, bem como as cubetas
já estarem com suas paredes danificadas, interferindo nas leituras.

6. CONCLUSÃO

Para quantificação de proteínas foi demonstrado que o método de Bradford é rápido e

sensível a quantidades pequenas de concentração de biomoléculas, podendo quantificar
qualquer tipo de proteínas. Porém há a necessidade de uma boa e apurada medição em
espectrofotometria diminuindo a variação de medição.

6
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Nelson, David L.; COX, Michael M. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 2011. 6. ed.
Porto Alegre: Artmed, 2014.

Dimas A. M. Zaia* et al. Determinação de Proteínas Totais Via Espectrofometria: Vantagens E Desvantagens Dos
Métodos Existentes. Instituto de Química. Universidade de São paulo. São paulo. 1998