Apostila - Biotecnologia Experimental - 20241

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE TECNOLOGIA E CIÊNCIAS

INSTITUTO DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS BIOQUÍMICOS
BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL
Roteiros das práticas de

Bioquímica
Professores: Fábio Merçon

Daniel Tinôco
Versão 2024
BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL – BIOQUÍMICA

Versão 2024
PRÁTICA 1: ESPECTROFOTOMETRIA
1 – Teoria
A absorção seletiva da radiação por muitas substâncias é utilizada para a sua
determinação quantitativa. Essa é a base das dosagens espectrofotométricas.
A intensidade da radiação transmitida por uma solução amostra pode ser medida (por
comparação com uma solução de referência) em um aparelho que consiste basicamente das
seguintes partes: fonte luminosa, monocromador, cubeta e detector – o espectrofotômetro. A
Figura 1 apresenta um esquema de um espectrofotômetro.
Figura 1: Esquema das partes constituintes de um espectrofotômetro.
Utiliza-se em espectrofotometria uma quantidade denominada Absorbância (Abs),

relacionada à intensidade (I) de radiação absorvida pela solução, que é definida pela relação:
Io
Abs = log = − log T
I
Sendo denominado Transmitância (T).
A absorbância (Abs) de uma solução é proporcional à concentração da solução (c –

mol.L-1) e à distância ou caminho óptico (d - cm) percorrida pelo feixe luminoso através da
solução segundo a Lei de Lambert-Beer:
𝐴𝑏𝑠 = 𝜀𝑐𝑑
Em que 𝛆 é o coeficiente de extinção, absorção ou absortividade molar, e corresponde
à absorbância de uma solução de concentração unitária por unidade de distância
percorrida (L.cm-1.mol-1).
2 – Objetivo
• Determinar o espectro de absorção da solução de azul de metileno nas concentrações de
1 mg/100 mL e 0,5 mg/100 mL;
• Definir o(s) comprimento(s) de onda em que ocorre(m) absorção máxima;
• Construir a curva padrão de azul de metileno
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Versão 2024
3 - Materiais
• Reagentes e soluções
-Solução de azul de metileno 1 mg/100 mL;
• Anotar todo material utilizado.
4 – Procedimento
4.1 Espectro de absorção
➢ Varrer o espetro com a solução de azul de metileno a 1 mg/100 mL e a 0,5 mg/100 mL,
determinando as absorbâncias nos seguintes comprimentos de onda (λ): 470, 500, 530,
570, 600, 630, 660, 690, 710 e 740 nm;
OBS.: Usar os resultados das demais bancadas como réplicas.
4.2 Curva padrão
➢ Construir a curva padrão da solução de azul de metileno conforme protocolo
apresentado no Quadro 1;
Quadro 1: Protocolo para preparo de soluções de azul de metileno a diferentes concentrações.
Azul de metileno Água destilada Concentração Absorbância
Tubo
(mL) (mL) (mg/100 mL) (λ selecionado)
1 1,0 4,0 0,2
2 2,0 3,0 0,4
3 3,0 2,0 0,6
4 4,0 1,0 0,8
5 5,0 0,0 1,0
➢ Ler as absorbâncias de cada tubo (Quadro 1) no valor de λ de melhor absorção,

utilizando água como branco da reação.
➢ Ler a absorbância de uma amostra de azul de metileno de concentração desconhecida.
5 – Relatório
a) Construir um gráfico de “Abs x λ” e determinar o comprimento de onda de máxima
absorção. O que o pico no gráfico significa? Explicar.
b) Construir a curva padrão de “ Abs x concentração de corante (mg/100 mL)” e calcular
o coeficiente de absorção ou absortividade.
Atenção: não esquecer a unidade!
c) Determinar a concentração da solução de azul de metileno de concentração
desconhecida.
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Versão 2024
PRÁTICA 2: PODER REDUTOR DOS GLICÍDIOS
1 – Teoria
Os glicídios que possuem em sua estrutura um grupamento hemiacetal, identificado pela
presença da hidroxila heterosídica ligada ao carbono anomérico, apresentam poder redutor.
Metais como Cu2+, Ag+, Bi3+ e Hg2+ e ainda substâncias orgânicas como o ácido
dinitrossalicílico (DNS) são reduzidos em meio alcalino por glicídios. O poder redutor é uma
propriedade muito utilizada para determinação qualitativa e quantitativa de glicídios.
2 – Objetivo
• Avaliar o poder redutor dos seguintes glicídios: glicose, frutose, sacarose, maltose e
lactose.
3 – Materiais
-Reativos de Benedict, de Fehling e de Tollens;
-Solução de DNS;
-Soluções aquosas de G licose (G) e Frutose (F) a 1,0% ( m / v ) ;
-Soluções aquosas de S acarose (S), M altose (M) e Lactose (L) a 2,0% ( m / v ) ;
• Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
4 – Procedimento
➢ Separar seis tubos de ensaio e identificá-los com a inicial de um dos glicídios a ser
testado e um branco (B). Cada conjunto de seis tubos corresponde à uma série. Preparar
quatro séries;
➢ Adicionar 1,0 mL de reativo de Benedict aos tubos da 1ª série, 1,0 mL de reativo de
Fehling aos tubos da 2ª série, 1,0 mL de reativo de Tollens aos tubos da 3ª série, e 1,0
mL de DNS aos tubos da 4ª série;
➢ Adicionar 1,0 mL da respectiva solução de glicídio em seu tubo correspondente em cada
série. Adicionar 1,0 mL de água destilada aos tubos marcados com B;
➢ Aos tubos contendo o reagente de Tollens, acrescentar uma gota de solução de hidróxido
de amônio (NH4OH);
➢ Aquecer as misturas em banho-maria por 10 min;
➢ Verificar a formação de precipitado, mudança de cor ou formação de espelho prata.
5 – Relatório
a) Elaborar uma tabela indicando os glicídios que apresentam poder redutor frente aos
diferentes reagentes:
+ = reação positiva
- = reação negativa
b) Anotar todas as alterações observadas.
c) Apresentar as reações ocorridas no experimento.
d) Explicar porque nem todos os glicídios avaliados apresentaram poder redutor.
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PRÁTICA 3: DOSAGEM DE GLICÍDIOS REDUTORES (GR) – MÉTODO DE DNS
1 – Teoria
O teste mais amplamente empregado para a determinação de açúcares redutores é o
método colorimétrico utilizando o ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) como agente oxidante. Sob
condições alcalinas e aquecimento, o açúcar redutor reage com o DNS (cor amarelo), que se
reduz a um composto colorido avermelhado denominado ácido 3-amino5-nitrosalicílico, cuja
absorção máxima de luz se dá a 540 nm, enquanto sofre oxidação.
A Figura 1 ilustra as reações envolvidas no método de DNS.
Figura 1: Esquema das reações envolvidas no método de DNS.

2 – Objetivo
• Elaborar uma curva padrão para determinação da concentração de glicídios redutores
presentes em uma amostra desconhecida.
3 – Materiais
➢ Reagentes e soluções
-Solução de DNS;
-Solução padrão de glicose (0,9 g/L).
➢ Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
4 – Procedimento
➢ Adicionar 0,0 (branco); 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 mL da solução padrão de glicose (0,9
g/L) a 6 tubos de Folin-Wu identificados e completá-los com água destilada até 1,0 mL;
➢ Adicionar 1,0 mL de solução da amostra desconhecida a um tubo de Folin-Wu
(identificar como amostra desconhecida);
➢ Adicione 1,0 mL do reagente do DNS a todos os tubos de Folin-Wu;
➢ Aquecer os tubos em banho-maria em ebulição por 5 min;
➢ Resfriar os tubos em água corrente;
➢ Completar o volume para 12,5 mL com água destilada (usar a marcação do tubo) e
homogeneizar;
➢ Determinar as absorbâncias das soluções em espectrofotômetro a 540 nm, zerando o
aparelho com o branco (B).
4 – Relatório
a) Elaborar uma tabela com as concentrações de glicose e as respectivas absorbâncias.
b) Construir a curva padrão: absorbância versus concentração de glicose, incluindo a
equação da curva e o coeficiente de determinação (R2).
c) Calcular a concentração de glicídios redutores na amostra desconhecida.
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PRÁTICA 4: DOSAGEM DE GLICÍDIOS REDUTORES (GR) E GLICÍDIOS

REDUTORES TOTAIS (GRT) EM AMOSTRA DE CALDO DE CANA-DE- AÇÚCAR
1 – Teoria
O principal componente do caldo de cana-de-açúcar é a sacarose, glicídio que não possui
poder redutor.
Na determinação dos glicídios redutores totais (GRT) presentes no caldo de cana,
inicialmente a sacarose deve ser hidrolisada, conforme equação química representada na Figura
1.
Figura 1: Reação de hidrólise de sacarose.
Como glicose e frutose são glicídios redutores, é possível determinar a concentração de

sacarose no caldo de cana a partir de sua quantificação no caldo hidrolisado.
2 – Objetivo
• Determinar a concentração de sacarose em amostra de caldo de cana.
3 – Materiais
-Solução do DNS;
-Solução HCl (2 M);
-Solução NaOH (1 M);
-Solução padrão de sacarose 20% (m/v).
• Matéria-prima
-Caldo de cana in natura.
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4 – Procedimento
4.1 Hidrólise ácida do caldo de cana-de-açúcar in natura e do padrão de sacarose
➢ Adicionar 1,0 mL de caldo de cana in natura em um tubo de ensaio e 1,0 mL do padrão
de sacarose (20 % m/v) em outro tubo de ensaio, ambos devidamente identificados;
➢ Adicionar 1,0 mL de HCl (2M) em cada tubo e homogeneizar;
➢ Aquecer os tubos em banho-maria à 65 ºC por 10 min;
➢ Adicionar 3,0 mL de NaOH (1M) em cada tubo e homogeneizar;
➢ Transferir 1,0 mL do hidrolisado de caldo de cana para um balão de 100 mL e completar
o volume;
➢ Transferir 1,0 mL do hidrolisado da solução padrão de sacarose para um balão de 100
mL e completar o volume;
➢ Transferir 1,0 mL da solução diluída de caldo de cana hidrolisado para um tubo de
Folin-Wu;
➢ Transferir 1,0 mL da solução diluída de hidrolisado da solução padrão de sacarose para
um tubo de Folin-Wu.
4.2 Dosagem de glicídios redutores totais (GRT)
➢ Adicionar 1,0 mL de água destilada em um tubo de Folin-Wu (BRANCO);
➢ Adicionar 1,0 mL do reagente do DNS nos tubos de Folin-Wu contendo o branco, a
solução diluída de caldo de cana hidrolisado e a solução diluída de hidrolisado da
solução padrão de sacarose;
➢ Aquecer os tubos em banho-maria em ebulição por 5 min;
homogeneizar;
➢ Determinar as absorbâncias das soluções em espectrofotômetro a 540 nm, zerando o
aparelho com o branco.
4.3– Dosagem de glicídios redutores (GR) no caldo de cana-de-açúcar in natura
➢ Diluir o caldo de cana na proporção 1:100 usando água destilada;
➢ Adicionar 1,0 mL do caldo de cana diluído (1:100) a um tubo de Folin-Wu;
➢ Adicionar 1,0 mL de água destilada em um segundo tubo de Folin-Wu (BRANCO);
➢ Adicionar 1,0 mL do reagente do DNS nos dois tubos de Folin-Wu;
➢ Aquecer em banho-maria em ebulição por 5 min;
homogeneizar;
➢ Determinar a absorbância da solução em espectrofotômetro a 540 nm, zerando o
aparelho com o branco.
5 – Relatório
a) Calcular a concentração de glicídios redutores totais (GRT), em g/L, no hidrolisado da
solução padrão de sacarose. A partir deste dado, calcular a eficiência da hidrólise.
b) Calcular a concentração de glicídios redutores totais (GRT), em g/L, no hidrolisado de
caldo de cana;
c) Calcular a concentração de glicídios redutores (GR), em g/L, no caldo de cana in natura.
d) Calcular a concentração de sacarose presente no caldo de cana.
OBS.: Usar a curva padrão da Aula 3.
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Versão 2024
PRÁTICA 5: CURVA DE TITULAÇÃO DE AMINOÁCIDOS
1 – Teoria
Os aminoácidos apresentam-se na forma dipolar iônica, com propriedades anfotéricas
em função dos seus grupamentos amino –NH2 (–NH3+) e carboxila –COOH (–COO-).
A adição de quantidade equivalente de um ácido forte (HCl) ao aminoácido fará com
que ele se apresente na forma protonada. A titulação potenciométrica utilizando uma base forte
(NaOH) permite determinar os pKs dos grupamentos COOH e NH2 e o ponto isoelétrico (P.I.).
A Figura 1 ilustra uma curva característica da titulação de um aminoácido (glicina).
Figura 1: Curva de titulação do aminoácido glicina.

2 – Objetivo
• Construir a curva de titulação do aminoácido alanina.
• Determinar os pKs dos grupamentos COOH e NH2, e o ponto isoelétrico (P.I.) da
alanina.
3 – Materiais
-Alanina;
-Solução de NaOH 0,1 M;
-Solução de HCl 0,1 M.
4 – Procedimento
➢ Pesar 2 mmol de alanina em um béquer de forma alta de 100 mL;
➢ Adicionar uma quantidade equivalente de HCl 0,1 M;
➢ Proceder à titulação potenciométrica da alanina utilizando 40 mL NaOH 0,1 M;
➢ Adicionar 1 mL de NaOH 0,1 M de cada vez e anotar o pH após estabilizar a leitura.
5 – Relatório
a) Elaborar uma tabela com os resultados da titulação (volume de base adicionado, número
de mmols equivalente e valor de pH).
b) Construir a curva de titulação da alanina (mmol de base x pH).
c) Determinar graficamente os valores de pK1 e pK2 e calcular o ponto isoelétrico (P.I.).
d) Comparar os valores dos pKs e P.I. obtidos nos itens anteriores com os valores indicados
na literatura: pK1 = 2,35 e pK2 = 9,87.
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Versão 2024
PRÁTICA 6: CURVA DE SOLUBILIDADE DA CASEÍNA EM FUNÇÃO DO pH
1 – Teoria
As proteínas têm sua solubilidade altamente influenciada pelo pH. Isso se deve ao
caráter anfotérico desses compostos, apresentando em sua estrutura resíduos de aminoácidos
com cargas elétricas distintas.
O pH de menor solubilidade de uma proteína localiza-se no seu ponto isoelétrico (P.I.),
uma vez que a força de repulsão entre as moléculas é menor.
A solubilidade aumenta quando o pH se desloca para valores inferiores ou superiores ao
P.I. da proteína.
2 – Objetivo
• Verificar a influência do pH sobre a solubilidade de uma proteína.
3 – Materiais
-Solução de caseína 0,3g/100 mL em acetato de sódio 0,1 M;
-Ácido acético 0,1 M;
-Ácido acético 1,0 M.
4 – Procedimento
➢ Numerar 8 tubos de ensaio e proceder seu preenchimento de acordo com o Quadro 1;
Quadro 1: Preparo das amostras para determinação da curva de solubilidade da caseína em
função do pH.
Tubo B 1 2 3 4 5 6 7
Água (mL) 5,0 4,4 4,3 4,0 3,5 2,5 0,5 3,9
Ac. Acético 0,1 M (mL) - 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 4,0 -
Ac. Acético 1,0 M (mL) - - - - - - - 0,6
Sol. Caseína (mL) - 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
➢ Determinar a absorbância em cada tubo a 570 nm.
5 – Relatório
a) Deduzir a equação de Henderson-Hasselbach e calcular o pH teórico de cada tubo
usando essa equação.
b) Construir um gráfico do inverso da absorbância (1/Abs) x pH.
c) Analisar o gráfico obtido indicando a faixa onde se situa o P.I. da caseína. Justificar a
resposta.
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Versão 2024
PRÁTICA 7: ANÁLISE DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO
1 – Teoria
O biureto é o composto formado pelo aquecimento da ureia à 180 ºC. Quando o biureto
é colocado em presença de CuSO4, em meio alcalino, obtém-se um complexo de coloração azul.
Este mesmo tipo de reação colorida ocorre entre substâncias com duas carbonilas ligadas
diretamente, através de um átomo de nitrogênio ou carbono, peptídeos (mínimo 2 ligações
peptídicas) e proteínas com o CuSO4, conservando o nome de reação do biureto.
A reação do biureto é muito utilizada na dosagem de proteínas em materiais biológicos,
uma vez que a intensidade da cor depende exclusivamente da concentração da proteína, já que
as ligações peptídicas aparecem com a mesma frequência por grama do material a ser analisado.
2 – Objetivo
• Determinar a concentração de proteína em amostra de produto comercial.
3 – Materiais
-Reagente do biureto (CuSO4 em solução alcalina);
-Solução padrão de caseína 10 mg/mL em NaOH 0,1 M;
-Soluções de produtos comerciais na concentração de 10 mg/mL em NaOH 0,1 M:
extrato de levedura, proteína de soja e gelatina.
4 – Procedimento
➢ Seguir o protocolo apresentado no Quadro 1, utilizando a solução padrão de caseína;
Quadro 1: Preparo das amostras para construção de curva padrão de caseína.
Tubo Solução de caseína (mL) H2O (mL) Reagente biureto (mL)
Branco 0,0 1,0 5,0
1 0,2 0,8 5,0
2 0,4 0,6 5,0
3 0,6 0,4 5,0
4 0,8 0,2 5,0
5 1,0 0,0 5,0
➢ Para cada amostra de produto comercial, adicionar 1,0 mL da solução padrão de caseína
e 5,0 mL do reagente biureto em um tubo de ensaio.
➢ Agitar e aguardar 30 min à temperatura ambiente em ausência de luz.
➢ Determinar as absorbâncias a 550 nm.
5 – Relatório
a) Elaborar uma tabela com as concentrações de proteína (g/L) e as respectivas
absorbâncias.
b) Construir a curva padrão “absorbância x concentração de proteína (g/L)”, incluindo a
equação da curva e o coeficiente de determinação (R2).
c) Determinar a concentração de proteína nas amostras analisadas.
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Versão 2024
PRÁTICA 8: ATIVIDADE ENZIMÁTICA
1 – Teoria
A Figura 1 ilustra o mecanismo de interação entre uma enzima e seu substrato
específico.
Figura 1: Mecanismo representativo da atividade enzimática.
A influência do tempo sobre a velocidade de uma reação enzimática será verificada com
a utilização da enzima invertase, que catalisa a conversão (hidrólise) da sacarose (glicídio não
redutor) em quantidades idênticas de glicose e frutose (glicídios com poder redutor).
Por meio do método de dosagem de glicídios redutores usando DNS (ácido 3,5 dinitro
salicílico) é possível quantificar os açúcares formados no hidrolisado.
2 – Objetivo
• Determinar a velocidade de reação;
• Calcular a atividade da preparação enzimática.
3 – Materiais
-Solução de sacarose 0,5 M em solução tampão de acetato 0,05 M (pH 4,7);
-Solução de enzima obtida por extração com NaCl de fermento biológico;
-Reagente do DNS (em meio alcalino);
-Solução padrão de glicose 5,0 µmol/mL em solução tampão de acetato 0,05 M.
4 – Procedimento
4.1 – Obtenção da enzima invertase

➢ Pesar 15 g de fermento biológico e 15 g de NaCl;
➢ Misturar os dois sólidos por 10 min;
➢ Centrifugar a mistura por 20 min (2500 x g);
➢ Recolher o sobrenadante e diluir na proporção de 1:250 com água destilada.
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Versão 2024
4.2 – Curva padrão de glicose

➢ Adicionar 0,0 (branco); 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 mL da solução padrão de glicose 5,0
µmol/mL em tubos de Folin-Wu devidamente identificados e completar para 1,0 mL
com água destilada;
➢ Adicionar 1,0 mL do reagente do DNS em cada tubo;
➢ Aquecer em banho-maria por 5 min;
homogeneizar;
➢ Ler as absorbâncias das soluções em espectrofotômetro a 540 nm, zerando o aparelho
com o branco (1,0 mL de água destilada).
4.3 – Influência do tempo de reação (T=ambiente).

➢ Marcar 6 tubos de Folin-Wu com os tempos de reação a serem avaliados: 1, 2, 3, 5, 10
e 15 min;
➢ Adicionar 0,5 mL da solução de sacarose 0,5 M em cada tubo;
➢ Adicionar 0,5 mL da solução da enzima obtida no item 4.1 e imediatamente disparar o
cronômetro para cada tempo de reação a ser avaliado;
➢ Imediatamente após o fim do tempo de reação, adicionar 1,0 mL do reagente do DNS e
levar a banho-maria em ebulição por 5 min;
homogeneizar;
5 – Relatório
a) Elaborar uma tabela com as concentrações de glicose (µmol/mL) e as respectivas
absorbâncias.
b) Construir a curva padrão “absorbância x concentração de glicose (µmol/mL)”, incluindo
a equação da curva e o coeficiente de determinação (R2).
c) Elaborar uma tabela com os dados de produto formado (µmol/mL) e os respectivos
tempos de reação.
d) Construir um gráfico de “produto formado (µmol/mL) x tempo (min)”.
e) Calcular a velocidade inicial da reação, quando ∆P/∆t é constante. Explicar a
importância da determinação da velocidade inicial da reação.
f) Calcular a atividade da preparação enzimática, apresentando o resultado em unidade
padrão (U)/mL.
OBS.: Unidade padrão (U) de uma enzima é a quantidade de enzima que catalisa a
formação de 1 µmol de produto por minuto sob condição definida. Neste caso considerar
U=1 µmol de glicose/min a T=ambiente em pH= 4,7.
g) Explicar os fatores que levam à interrupção da reação enzimática.
h) Justificar os pontos do gráfico escolhidos para o cálculo da velocidade inicial.
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Versão 2024
PRÁTICA 9: INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA SOBRE A ATIVIDADE

ENZIMÁTICA
1 – Teoria
A temperatura altera a velocidade de uma reação enzimática exercendo influência sobre
a constante de velocidade (Figura 1).
Figura 1: Efeito da temperatura sobre (a) velocidade reacional; e (b) constante de velocidade
segundo Equação de Arrhenius.
Entretanto, como a enzima é uma proteína, a elevação da temperatura tende a provocar

sua desnaturação, resultando em perda de atividade (Figura 2).
Figura 2: Desnaturação proteica.
2 – Objetivo
• Verificar a influência da temperatura sobre a atividade da enzima.
3 – Materiais
-Solução de sacarose 0,5 M em tampão de acetato 0,05 M (pH 4,7);
-Reagente do DNS (em meio alcalino).
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Versão 2024
4 – Procedimento
➢ Marcar 5 tubos de Folin-Wu com as temperaturas a serem avaliadas (0 ºC, T ambiente,
50 ºC e 100 ºC) e o branco (B);
➢ Adicionar 0,5 mL da solução de sacarose 0,5 M em cada tubo e 1,0 mL de água destilada
no branco;
➢ Adicionar 0,5 mL da solução de enzima em cada tubo, exceto no branco, e
imediatamente colocar os tubos nos respectivos banhos: 0 ºC – banho de gelo,
temperatura ambiente – medir a temperatura, 50 ºC – banho térmico a 50 ºC e 100 ºC –
água fervente;
➢ Após exatamente 10 min, retirar os tubos dos respectivos banhos e adicionar 1,0 mL do
reagente do DNS em cada tubo, inclusive no branco;
➢ Completar o volume para 12,5 mL com água destilada e homogeneizar;
5 – Relatório
a) Elaborar uma tabela com os dados de temperatura (ºC), absorbância a 540 nm,
concentração de produto formado (µmol/mL) e velocidade da reação (µmol/mL.min.).
b) Construir um gráfico de “velocidade de reação (µmol/mL.min) x temperatura (ºC)”.
OBS.: O cálculo do produto formado em µmol/mL deve ser feito utilizando a curva
padrão obtida na prática 8.
c) Determinar a temperatura na qual a enzima apresenta maior atividade. Justifique.
d) Explicar os fatores que levam à interrupção da reação enzimática realizada.
e) Explicar como a temperatura afeta a velocidade de uma reação enzimática.
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Versão 2024
PRÁTICA 10: MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN
1 – Teoria
O modelo cinético de Michaelis-Menten descreve matematicamente a relação existente
entre a velocidade enzimática inicial e a concentração de substrato limitante que interage com
uma enzima.
O modelo de Michaelis-Menten é representado por uma equação hiperbólica (Figura 1),
cujos parâmetros são a velocidade enzimática máxima (Vmáx) e a constante de saturação (Km
– constante de Michaelis-Menten).
A constante Km expressa a afinidade da enzima pelo substrato em uma relação
inversamente proporcional, enquanto corresponde matematicamente à Vmáx/2.
Figura 1: Equação e curva do modelo cinético de Michaelis-Menten.
Se a concentração do substrato ([S]) for aumentada de modo que [S]>[Sn-

1]...>[S3]>[S2]>[S1], as velocidades iniciais também aumentarão. No entanto, quanto maior
[S], mais lentamente esse aumento ocorrerá, até que não seja mais observado. Nessas condições,
a [ES] máxima terá sido atingida e a enzima estará totalmente saturada pelo seu substrato.
Portanto, apesar de clássico, o modelo cinético de Michaelis-Menten apresenta como
principal limitação a incapacidade de representar a inibição causada pelo excesso de substrato
(saturação enzimática), sendo aplicado somente para concentrações subinibitórias de substrato
limitante.
2 – Objetivo
• Verificar a influência do fator concentração de substrato [S] sobre a velocidade inicial
(V0) de uma reação enzimática.
3 – Materiais
-Solução de sacarose nas concentrações de 1,0; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05; 0,02 e 0,01 M em
tampão de acetato 0,05 M (pH 4,7);
-Reagente do DNS (em meio alcalino).
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Versão 2024
4 – Procedimento
➢ Marcar 8 tubos de Folin-Wu com as concentrações de sacarose a serem avaliadas (1,0;
0,5; 0,2; 0,1; 0,05; 0,02 e 0,01 mol/L) e o branco (B);
➢ Adicionar 0,5 mL das respectivas soluções de sacarose em cada tubo e 0,5 mL de água
destilada no branco;
➢ Adicionar 0,5 mL da solução da enzima em cada tubo e, imediatamente, disparar o
cronômetro;
➢ Após exatamente 10 min, adicionar 1,0 mL do reagente do DNS em cada tubo, inclusive
no branco;
➢ Completar o volume para 12,5 mL com água destilada e homogeneizar;
5 – Relatório
a) Elaborar uma tabela com os dados de concentração de substrato - [S], absorbância a 540
nm, produto formado (µmol/mL), velocidade da reação -V (µmol/mL.min.), 1/[S] e 1/V.
b) Construir um gráfico de “velocidade de reação V (µmol/mL.min) x concentração de
substrato [S]” e analisar o gráfico.
c) Construir um gráfico de “1/V x 1/[S]” e determinar os parâmetros Km e Vmáx.
OBS.: O cálculo do produto formado em µmol/mL deve ser feito utilizando a curva
padrão obtida na prática 8.
d) Explicar como a concentração de substrato afeta a velocidade de uma reação enzimática.
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Versão 2024
PRÁTICA 11: DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE SAPONIFICAÇÃO

1 – Teoria
Óleos e gorduras vegetais são produtos constituídos principalmente de glicerídeos de
ácidos graxos, além de outros lipídeos como fosfolipídios, constituintes insaponificáveis e
ácidos graxos livres naturalmente presentes no meio.
Ao serem aquecidos de forma prolongada, os óleos e gorduras são degradados, o que
modifica suas propriedades físico-químicas. Para garantir um adequado controle de qualidade,
diversos índices podem ser determinados. Dentre eles, o índice de saponificação é capaz de
indicar qualitativamente os ácidos graxos de baixo ou alto peso molecular ligados nos
triacilgliceróis.
Quimicamente, o índice de saponificação corresponde à massa, em miligramas, de
hidróxido de potássio (KOH) necessária para neutralizar os ácidos graxos resultantes da
hidrólise de 1 grama de gordura ou óleo. Desprezando-se a matéria insaponificável, esse índice
é inversamente proporcional à massa molar média dos grupamentos acila (resíduos de ácidos
graxos) presentes na molécula de triacilglicerol.
2 – Objetivo
• Determinar o índice de saponificação de amostras de óleos ou gorduras comerciais.
3 – Materiais
-Solução alcoólica de KOH a 4,0% (m/v);
-Solução alcoólica de fenolftaleína a 1,0% (m/v);
-Ácido clorídrico 0,5 M.
4 – Procedimento
➢ Pesar 2 g de amostra em um frasco Erlenmeyer de 250 mL;
➢ Adicionar 20 mL de solução alcoólica de KOH a 4,0% (m/v);
➢ Adaptar o Erlenmeyer a um condensador de refluxo;
➢ Aquecer o Erlenmeyer até ebulição branda por 30 min;
➢ Resfriar o Erlenmeyer e adicionar 2 gotas de fenolftaleína para titulação com HCl 0,5
M até desaparecimento da coloração rósea;
➢ Realizar um ensaio em branco em outro frasco Erlenmeyer sem amostra (repetir os
passos anteriores).
5 – Relatório
a) Elaborar uma tabela com os resultados da titulação.
b) Calcular o índice de saponificação para as amostras.
I.S. = (Vb - Va) MHCl x MMKOH

m
Em que:
I.S. = Índice de saponificação (mg KOH/g)
Vb = volume da solução de HCl gasto na titulação do branco (L);
Va = volume da solução de HCl gasto na titulação da amostra (L);
MHCl = concentração em quantidade de matéria da solução de HCl (mol/L);
MMKOH = massa molar do KOH (56000 mg/mol);
m = massa da amostra (g).
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Versão 2024
PRÁTICA 12 - DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE ACIDEZ
1 – Teoria
Outro índice usado como parâmetro de qualidade físico-química de óleos e gorduras é
o índice de acidez. Esse índice é um fator qualitativo capaz de influenciar o maior ou menor
custo da industrialização de produtos à base de óleos e gorduras, além de indicar seu estado de
conservação.
O índice de acidez pode ser expresso em função do teor de ácido oleico. De acordo com
a ANVISA, o índice de acidez de óleo de soja refinado e de vegetais como canola, milho,
girassol, amendoim, é de no máximo 0,3% (m/m) de ácido oléico/g da amostra, enquanto o teor
limite de acidez aceitável de óleos não refinados como azeites de dendê, gergelim, oliva e
babaçu corresponde a 1,0% (m/m).
Outra forma de expressar o índice de acidez é em termos de hidróxido de potássio. Neste
caso, o índice de acidez corresponde à massa, em miligramas, de KOH necessária para
neutralizar os ácidos graxos livres presentes em 1 grama de óleo ou gordura.
2 – Objetivo
• Determinar o índice de acidez em amostras de óleos comerciais.
3 – Materiais
-Solução de éter etílico-álcool etílico (2:1) neutra;
-Solução alcoólica de fenolftaleína a 1,0% (m/v);
-Solução de NaOH 0,05 M.
4 – Procedimento
➢ Pesar 2 g de amostra em um frasco Erlenmeyer de 250 mL;
➢ Adicionar 25 mL de solução de éter etílico-álcool etílico neutra e homogeneizar;
➢ Adicionar 2 gotas de fenolftaleína e titular com NaOH 0,05 M até coloração rósea.
5 – Relatório
a) Elaborar uma tabela com os resultados da titulação.
b) Calcular o índice de acidez para as amostras.
I.A. = Va x MNaOH x MMKOH

m
Em que:
I.A. = Índice de acidez (mg KOH/g)
Va = volume de solução de NaOH gasto na titulação da amostra (L);
MNaOH = concentração em quantidade de matéria da solução de NaOH (mol/L);
MMKOH = massa molar do KOH (56000 mg/mol);
m = massa da amostra (g).
c) Comparar e interpretar os resultados obtidos para as amostras analisadas.
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Versão 2024
PRÁTICA 13: DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE LIPÁSICA
1 – Teoria
Lipases são enzimas classificadas como hidrolases (triacilglicerol hidrolases EC
3.1.1.3), responsáveis pela quebra de ligações éster de triacilgliceróis em meio aquoso, com
formação de mono e diacilglicerídeos, ácidos graxos e glicerol. Em meio não aquoso, as lipases
catalisam reações de transesterificação, aminólise e lactonização. Ambos os tipos de reações
são de grande interesse industrial devido à geração de produtos de alto valor agregado,
aplicados nos segmentos de alimentos, fármacos, cosméticos e química fina.
As lipases podem ser obtidas a partir de fontes animais, vegetais e microbianas. As
lipases microbianas apresentam melhores propriedades físico-químicas como especificidade
com o substrato, estabilidade térmica e de pH. Além dessas vantagens, as lipases microbianas
apresentam um processo de produção de base biológica de fácil controle e alto rendimento,
sendo economicamente interessante à indústria. Os principais micro-organismos produtores de
lipases incluem bactérias, fungos filamentosos e leveduras, com destaque às espécies e gêneros
Penicillium chrysogenum, Rhizopus oligosporus, Aspergillus niger, Pseudomonas, Bacillus e
Burkholderia.
A capacidade catalítica das lipases é representada pela atividade lipásica ou lipolítica,
definida como a quantidade de enzima capaz de produzir 1 μmol de ácidos graxos por minuto
(U - unidade lipolítica ≡ μmol/min), por quantidade de amostra (massa ou volume de extrato
enzimático), sob condições de ensaio padrão. A atividade lipásica ou lipolítica (AL) pode ser
calculada conforme a Equação 1.
(Va − Vb ) x M x 1000
AL = (1)
V xt
Em que:
AL = atividade lipásica ou lipolítica (U/mL);
Va = média dos volumes de solução de NaOH, de fator de correção
conhecido, gastos para titular os ácidos graxos produzidos na reação enzimática
(mL);
Vb = média dos volumes de solução de NaOH, de fator de correção
conhecido, gastos para titular o ensaio em branco;
M = concentração da solução de NaOH (mol/L);
1000 = fator de correção de unidade;
V = volume de amostra (extrato enzimático) (mL);
t = tempo de reação (min).
De modo geral, a atividade enzimática das lipases depende de sua estrutura química
(terciária e quaternária). Condições de processo como temperatura, pH e pressão podem alterar
a conformação dos sítios ativos, o que resulta em perda de funcionalidade. Portanto, para que
uma lipase apresente atividade lipásica ou lipolítica, faixas ótimas de trabalho devem ser
mantidas para evitar a desnaturação proteica.
2 – Objetivo
• Determinar a atividade lipásica de uma emulsão formada por água e azeite de oliva
extravirgem.
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Versão 2024
3 – Materiais
-Água destilada, azeite de oliva extravirgem e goma arábica;
-Tampão citrato de sódio 0,05 mol/L (pH 5);
-Solução enzimática;
-Solução etanol/água (2:1);
-Solução aquosa de NaOH 0,04 mol/L.
4 – Procedimento
4.1 – Preparo de uma emulsão

➢ Adicionar 48 mL de água destilada, 48 mL de azeite de oliva extravirgem e 7 g de goma
arábica em um béquer de 200 mL.
4.2 – Preparo da mistura reacional

➢ Adicionar 5 mL da emulsão e 4 mL de solução tampão citrato de sódio 0,05 mol/L (pH
5) em um Erlenmeyer de 100 mL;
➢ Incubar o Erlenmeyer contendo a mistura em shaker a 30 ºC, por aproximadamente 5
min;
➢ Adicionar 1 mL da solução enzimática e manter a mistura em shaker a 30 ºC, 200 rpm,
por 20 min;
➢ Adicionar 25 mL de uma solução etanol/água na proporção de 2:1.
4.3 – Preparo do branco

➢ Adicionar 5 mL da emulsão e 4 mL de solução tampão citrato de sódio 0,05 mol/L (pH
5) em um Erlenmeyer de 100 mL;
➢ Incubar o Erlenmeyer contendo a mistura em shaker a 30 ºC, por aproximadamente 5
min;
➢ Manter a mistura em shaker a 30 ºC, 200 rpm, por 20 min;
➢ Adicionar 25 mL de uma solução etanol/água na proporção de 2:1.
4.4 – Titulação
➢ Mistura reacional: titular o extrato enzimático com solução de NaOH 0,04 mol/L até pH
final de 11. Anotar o volume gasto;
➢ Branco: adicionar 1 mL da solução enzimática e titular o branco com solução de NaOH
0,04 mol/L até pH final de 11. Anotar o volume gasto.
OBS.: Realizar três titulações para a mistura reacional e para o branco.
5 – Relatório
a) Calcular a AL do extrato enzimático obtido no experimento pelo método titulométrico.
b) Apresentar um exemplo de processo fermentativo de produção de lipase, indicando a
matéria-prima usada, o micro-organismo empregado e o valor de atividade lipásica
calculado pelo método titulométrico.
OBS.: usar como exemplo para pesquisa o trabalho “Produção de lipase de Aspergillus
niger utilizando co-produtos da indústria de refino de óleos” (disponível em:
https://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/934730/1/2012108.pdf).
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Versão 2024
PRÁTICA 14: QUEIJO MINAS FRESCAL
Parte I – Produção de queijo minas frescal
1 – Teoria
A produção de queijo data de aproximadamente 10.000 a.C., resultante do processo
natural de coagulação de leite de cabras e ovelhas.
Naturalmente rico em nutrientes, o queijo contém proteínas, carboidratos, lipídeos, sais
minerais (Ca, P, Zn), vitaminas lipossolúveis e vitaminas do complexo B. Sua produção envolve
as etapas de padronização, pasteurização, coagulação, corte, agitação, enformagem, salga, e
embalagem e armazenamento.
De acordo com a Associação Brasileira das Indústrias de Queijo (ABIQ), existem
atualmente no país pouco mais de 20 tipos diferentes de queijos, incluindo o queijo Minas
frescal. Esse queijo é definido pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento
(MAPA) como sendo o produto da coagulação enzimática do leite com coalho e outras enzimas
coagulantes, complementada ou não com a ação de bactérias láticas específicas.
O queijo Minas frescal é considerado um queijo semi-gordo e de alta umidade, cujo
consumo deve ser realizado a fresco. Suas principais características incluem:
• Consistência: branda e macia;
• Textura: com ou sem olhaduras mecânicas;
• Cor: esbranquiçada;
• Sabor: suave ou levemente ácido;
• Odor: suave e característico;
• Crosta: fina ou ausente;
• Olhaduras: eventualmente algumas olhaduras mecânicas.
2 – Objetivos
• Produzir queijo minas frescal a partir de leite pasteurizado.
3 – Materiais
-1 litro de leite pasteurizado;
-CaCl2 comercial;
-Ácido lático;
-Coalho.
4 – Procedimento
4.1 – Preparo do Leite
➢ Deixar o leite (ainda na embalagem) em banho-maria a 32 °C por 30 min.
4.2 – Coagulação da massa

➢ Adicionar ao leite:
a) CaCl2: dispersar previamente o cloreto de cálcio, pipetando 0,4 mL de solução CaCl2
50% (m/v) em béquer de 50 mL e adicionar um pouco de água destilada. Adicionar todo
o conteúdo do béquer em 1 L de leite. Agitar suavemente;
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Versão 2024
b) Ácido lático: dispersar previamente o ácido lático, pipetando 0,25 mL de uma solução
a 85% (m/v) e adicionar cerca de 5 mL de água destilada. Agitar suavemente;
c) Coalho: seguir as instruções do rótulo. Dispersar previamente o coalho no béquer,
adicionando um pouco de água. Homogeneizar o leite.
4.3 – Incubação
➢ Tampar o recipiente com um vidro de relógio e colocar em banho-maria a 32 ºC;
➢ Não mexer no recipiente;
➢ Após 40-50 min, verificar se a coalhada está no ponto.
4.4 – Corte da massa

➢ Com a massa no banho-maria, iniciar o corte usando uma faca. Cortar a massa no
sentido longitudinal e vertical;
➢ Deixar a coalhada no banho-maria por mais 10 min;
➢ Agitar a massa suavemente para liberação do soro por 5 min;
OBS.: Caso não haja interesse em aproveitar o soro, pode-se, nesta etapa, fazer a salga.
4.5 – Dessoragem
➢ Transferir a massa coagulada para uma peneira específica para queijo e retirar o soro
com cuidado.
4.6 – Salga
➢ Colocar o queijo na salmoura (solução de CaCl2 20% m/v) por 4 h na geladeira.
OBS.: Caso a quantidade de leite seja alta, realizar a viragem do queijo na forma após 10 min,
2 h e 5 h posteriormente à etapa de dessoragem para uniformização da umidade do coágulo.
Parte II - Determinação da força do coalho
1 – Teoria
O coalho ou renina é uma mistura enzimática (quimosina e pepsina) capaz de promover
a coagulação do leite no processo de produção de queijo. Particularmente, a etapa de coagulação
é responsável pela concentração das enzimas do leite e retenção de gordura.
A capacidade de coagulação pode ser medida pelo parâmetro “força do coalho”, que é
obtido mediante rompimento de ligações peptídicas.
Por convenção, um coalho possui força igual a 1000 quando a coagulação do leite ocorre
dentro de 40 min a 35 °C, após adição de 1 mL de coalho em 1 L de leite.
2 – Objetivos
• Avaliar a força do coalho durante a produção de queijo minas frescal.
3 – Materiais
-Coalho;
-Leite Pasteurizado.
• Vidrarias
-Béquer de 50 e 600 mL;
22

Versão 2024
-Vidro de relógio;
-Bastão de vidro;
-Pipeta de 1,0 mL;
-Banho-maria a 35 °C.
• Anotar as demais vidrarias e equipamentos utilizados.
4 – Procedimento
➢ Aquecer 500 mL de leite pasteurizado em banho-maria até 35 °C;
➢ Dispersar 0,5 mL de coalho em béquer de 50 mL, adicionando cerca de 5 mL de água
destilada;
➢ Adicionar, lentamente, o coalho disperso ao leite previamente aquecido a 35 °C;
➢ Agitar a mistura suavemente por meio de um bastão de vidro;
➢ Tampar o béquer com vidro de relógio;
➢ Deixar a mistura no banho, verificando a formação de coalho de tempos em tempos
(usar um bastão de vidro para mexer a massa coagulada);
➢ Anotar o tempo de coagulação (t) em min.
5 – Relatório
a) Calcular a força do coalho utilizando a fórmula abaixo:
F = 40 x 1000/ t
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I.S. = (Vb - Va) MHCl x MMKOH

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PRÁTICA 12 - DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE ACIDEZ

I.A. = Va x MNaOH x MMKOH

c) Comparar e interpretar os resultados obtidos para as amostras analisadas.

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4.1 – Preparo de uma emulsão

4.2 – Preparo da mistura reacional

4.3 – Preparo do branco

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4.2 – Coagulação da massa