Aula prática – Propriedades das proteínas

INTRODUÇÃO
A solubilidade das proteínas em meio aquoso deve-se, em grande parte, à
distribuição das cargas elétricas ao longo da molécula. Nesse sentido, se a interação
proteína-proteína é grande e a interação proteína - água é pequena, a proteína tenderá a
ser insolúvel. Uma das maneiras de promover a precipitação de uma proteína é atingir
seu ponto isoelétrico. Porém, existem outros fatores que influem de maneira importante
nessa propriedade física das proteínas, como a ação de ácidos, bases, sais e solventes
orgânicos. Além disso, podemos incluir a temperatura como um agente que pode ser
utilizado para diminuir a solubilidade de uma proteína. 
As proteínas reagem com uma variedade de compostos, formando produtos
coloridos. A maioria das reações de caracterização de proteínas ou aminoácidos se deve
à presença de ligações ou grupos químicos específicos. Existem reações de coloração
que são específicas para certos grupos funcionais de aminoácidos encontrados nas
proteínas, enquanto outras reações, chamadas de gerais, caracterizam grupamentos
comuns a todas as proteínas. Entre as reações consideradas gerais estão a reação da
ninidrina e a reação de biureto, as quais caracterizam grupos amino e ligações
peptídicas, respectivamente.

Reação da ninidrina
A ninidrina (2,2-diidroxi-hidrindeno-1,3-diona) é um produto químico utilizado
para a detecção de aminas primárias, particularmente de aminoácidos. Ao reagir com
essas aminas livres, uma cor azul escura ou roxa, conhecida como púrpura de
Ruhemann é produzida (Figura 1). 

Figura 1. Reação de aminoácidos com ninidrina.

Reação com biureto

O sulfato de cobre em meio alcalino reage com as substâncias que contêm duas
ou mais ligações peptídicas dando um complexo de coloração característica (púrpura).
O íon fornecido por uma solução diluída e alcalina de CuSO se complexa com os
4

grupos (-NH) das ligações peptídicas (Figura 2). A intensidade da cor obtida é
proporcional ao número de ligações peptídicas. O reagente é comumente utilizado em
ensaios colorimétricos para a determinação de concentração de proteínas—tal como a
espectroscopia UV/visível no comprimento de onda de 540 nm (para a detecção do íon
Cu ).
2
+
 Figura 2. Reação de ligações peptídicas com o reagente de Biureto. 

OBJETIVO

Familiarizar-se com as propriedades físico-químicas das proteínas, bem como

com as reações de identificação das mesmas e procedimento para quantificação. 

PROCEDIMENTOS 

PARTE 1 - REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS COM

DESNATURAÇÃO

a) Preparar um tubo com 1 mL de clara de ovo acrescidos de 9 mL de solução salina

(NaCl 0,9%) 🡪 “SOLUÇÃO DE PROTEÍNA DILUÍDA" (Será utilizada em vários
momentos nesta aula prática).

b) Preparar os tubos de acordo com a tabela a seguir:

Tubo Adicionar Procedimento

2 mL Solução de proteína
1 Aquecer em banho-maria 100ºC.
diluída
1 mL Solução de proteína Adicionar 1 mL de ácido tricloroacético
2
diluída 10%
1 mL Solução de proteína
3 Adicionar 3 mL ou mais de álcool etílico
diluída

RESULTADOS:

Tubo Resultado observado Explicação

1

PARTE 2 - REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO SEM DESNATURAÇÃO

a) Pipetar 3 ml de clara de ovo in natura em um pequeno béquer. Diluir com água
destilada, mexendo com um bastão de vidro, até notar o aparecimento do precipitado de
globulinas. Juntar em seguida a solução de NaCl 1N, gota a gota, até a redissolução do
precipitado anterior de proteína não desnaturada. Esta redissolução se deve à
restauração da força iônica original e corresponde ao fenômeno da “salting in”.

b) Da solução da clara de ovo na experiência anterior de “salting in”, pipetar 2 mL em

um novo tubo de ensaio. Juntar a seguir 2 mL de solução saturada de sulfato de amônio
e observar o “salting out”.

QUESTÕES:

1) Qual a explicação bioquímica para os fenômenos de salting in e salting out em

soluções de proteínas?

2) Quais as aplicações do salting in e do salting out nas áreas de bioprocessos e

biotecnologia?

PARTE 3 - REAÇÃO COM NINIDRINA

a) Preparar os tubos de acordo com a tabela a seguir:

Tubo Amostra Volume (mL)
1 Água destilada 1,0
2 Glicina 0,05M 1,0
3 Solução de proteína diluída 1,0

b) Em cada tubo adicionar 2 mL de solução de ninidrina

c) Aquecer os tubos de ensaio em banho-maria 100 ºC por 3-5 minutos. 

RESULTADOS:

Tubo Resultado observado Explicação

1

PARTE 4 - REAÇÃO COM BIURETO

 a) Preparar os tubos de acordo com a tabela a seguir:
Tubos Amostra Volume (mL)
1 Água destilada 1,0
2 Glicina 0,05M 1,0
Solução de proteína
3 1,0
diluída

b) Em cada tubo adicionar 1 mL do reagente de biureto e agitar os tubos.

RESULTADOS: 
Tubo Resultado observado Explicação
1

QUESTÕES: 

1) Considerando o princípio de formação de cor na reação com ninidrina, que

proteínas apresentariam resultado positivo para essa reação? Dica: analise a
cadeira lateral dos aminoácidos. 

2) Para qual aminoácido a reação com a ninidrida daria resultado negativo?

Explique.

3) Quais as aplicações das reações com ninidrina e biureto na área da

biotecnologia?

PARTE 5 - QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO

A partir de soluções contendo concentrações conhecidas de proteína, por exemplo albumina,
podemos determinar o valor de absorbância de cada amostra, e obtendo uma curva padrão, determinar
a concentração de proteínas de determinada amostra.
Os seguintes tubos foram preparados para obtenção da curva padrão com concentrações
crescentes de albumina. (NÃO É NECESSÁRIO PREPARAR ESSES TUBOS, USAR OS
VALORES DE ABSORBÂNCIA PARA CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO).

Tubos 1 2 3 4 5 6
Solução de albumina (5mg/ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Água (ml) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0
Biureto (ml) 5 5 5 5 5 5
Concentração de proteína
0 1 2 3 4 5
(mg/mL)
Absorbância (540 nm) Branco 0,037 0,07 0,104 0,142 0,18

Método:
• Preparar um tubo contendo 1 ml da “amostra desconhecida” + 5 ml de Biureto
• Agitar bem
• Transferir para a cubeta
• Medir absorbância (540 nm)
• Anote o resultado, construa a curva-padrão com os dados disponibilizados na tabela acima
(x=concentração de amostra; y=absorbância) e determine a concentração da amostra a partir da
regressão linear.

Figura 2. Curva padrão para quantificação de proteína, obtida conforme descrito na tabela acima.
 Aula prática – Propriedades das enzimas
INTRODUÇÃO 
A urease é uma enzima que catalisa a hidrólise da ureia em amônia e dióxido de
carbono.

Em meio aquoso:

A atividade da enzima pode ser verificada pela formação de carbonato de

amônio, que é um sal de reação básica e cuja presença pode ser revelada por meio de
um indicador ácido básico como o vermelho de fenol (VF), por exemplo (VF em meio
básico = rosa; VF em meio ácido ou neutro = amarelo).

A uréase existe em algumas bactérias e plantas e pode ser extraída com

facilidade de soja.

OBJETIVO
Observar a atividade da enzima urease e a ação dos agentes desnaturantes sobre a
enzima.

PROCEDIMENTO

PARTE 1 – EXTRAÇÃO DA ENZIMA

Pesar cerca de 15 g de farinha de soja e dissolver em 100 mL de água destilada. Deixar
agitando durante 20 minutos. Filtrar com algodão. Desprezar o resíduo. O filtrado
contém a uréase. 

PARTE 2 – CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO ENZIMÁTICO

Tubo 1: 2 mL de água destilada + 10 gotas da solução de uréase + 2 mL do reativo
biureto.
Tubo 2: 2 mL de água destilada + 2 mL do reativo biureto.

Agitar os tubos e comparar a cor nos dois tubos e concluir o resultado.

QUESTÕES:
1) Qual o resultado observado para os tubos 1 e 2?
2) Que característica das enzimas é evidenciado pela reação com o Biureto?
PARTE 3 – ATIVIDADE DA UREASE
Tubo 3: Colocar 3 mL de solução de uréia + 5 gotas de solução de uréase.
Tubo 4: Colocar 3 mL de água destilada + 5 gotas de solução de uréase.
A ambos os tubos adicionar uma gota de solução vermelho de fenol. Agitar e colocar
em banho-maria a 37°C. Observar se há mudança de cor nos próximos 5 minutos.
Concluir o resultado.

QUESTÕES:
1) Qual o resultado observado para os tubos 3 e 4?
2) Explique por que há mudança de coloração no tubo contendo enzima,
relacionando com a função de cada composto adicionado no tubo.

PARTE 4 – EFEITO DO CALOR NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Tubo 5, 6, 7: Colocar 2 mL de água destilada + 5 gotas de solução de uréase. Agitar e
colocar em banho-maria a 100°C por 30 segundos (TUBO 5), 1 minuto (TUBO 6) e 3
minutos (TUBO 7). Em seguida adicionar 3 mL de solução de uréia e 1 gota da solução
de vermelho de fenol. Misturar e aguardar 5 minutos em banho-maria a 37°C. Observar
se houve modificação de cor em relação ao tubo 3. 

QUESTÕES:
1) Qual o resultado observado para os tubos 5, 6 e 7?
2) Por que o tratamento térmico impede a mudança de coloração? Qual o tempo
necessário de tratamento térmico para que ocorra perda total atividade
enzimática?

PARTE 5 – ESPECIFICIDADE ENZIMÁTICA:

Tubo 8: Colocar 3 mL de tiouréia + 5 gotas de solução de uréase.
Ao tubo adicionar 1 gota de solução vermelho de fenol. Agitar e manter em banho-
maria a 37°C. Observar se há mudança de cor nos próximos 5 minutos. Concluir o
resultado. 

QUESTÕES:
1) Qual o resultado observado em comparação com o tubo 3? Explique
comparando a estrutura química da ureia e tioureia.