Toxicologia

Trabalho Prático nº4:

- Estudo da inibição pelo chumbo da atividade da tirosinase (ou
catecol oxidase) extraída da banana.

Realizado em: 7 de abril de 2022

Entregue em: 14 de abril de 2022
Por: Bruno Gaifem, Eduardo Araújo e Maria Madeira
Grupo 7, 3CNUTA
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Introdução

Na natureza existem diversos compostos que podem provocar a inibição de certas

atividades enzimáticas. Este bloqueio pode acontecer quando os organismos estão
expostos a elementos metálicos, nomeadamente metais pesados. Relativamente a estes
compostos, é sabido que o chumbo tem capacidade de inibir a atividade da enzima catecol
oxidase, também conhecida como tirosinase (Morais, Marques, & Moreira, 2022).
Quer nas plantas, quer nos Homens, esta enzima apresenta funções importantes
sendo que nas plantas, a catecol oxidase exerce um papel fundamental no escurecimento
de batatas, peras ou bananas descascadas. Tal acontece, pois a catecol oxidase catalisa a
oxidação do catecol (composto incolor) em benzoquinona (composto amarelo), na
presença de oxigénio, que por sua vez é oxidada rapidamente e origina melanina, este que
é um composto que confere aos frutos uma coloração escura (Morais, Marques, &
Moreira, 2022). A inibição da catecol oxidase reflete um benefício no que diz respeito à
preservação dos alimentos pois o escurecimento dos mesmos não acontece, no entanto, a
presença de chumbo pode acarretar outros problemas e revelar-se prejudicial
nomeadamente para populações vulneráveis (Food and Drug Administration, 2020). Para
além disso, o chumbo tem também habilidade para influenciar o metabolismo das plantas,
sendo que a sua toxicidade pode bloquear a produção de ATP, causar peroxidação dos
lípidos e lesar o material genético o que pode resultar numa inibição do crescimento das
sementes, dos caules e das raízes e comprometer as normais funções de transpiração e de
produção de clorofila (Queiroz, Lopes, Fialho, & Valente-Mesquita, 2008).
Já no caso dos Homens, a melanina é um pigmento responsável pela cor do cabelo,
pele e olhos, ou seja, uma mutação no gene da catecol oxidase vai impedir que as reações
para formar melanina aconteçam, gerando uma doença hereditária conhecida como
albinismo (Morais, Marques, & Moreira, 2022).
Desta forma, o presente trabalho, através da utilização de banana para extrair a
enzima catecol oxidase, procurou perceber o potencial efeito inibidor do chumbo sobre
esta enzima. Para tal, foram preparadas cinco diferentes amostras com diferentes
quantidades de chumbo a fim de perceber a partir de qual concentração de chumbo a
enzima é inibida esperando-se que a solução sem chumbo seja a mais escura, ao passo
que a solução que mais concentração de chumbo tem presente, seja a mais clara pois
haverá inibição da catecol oxidase e a melanina não se formará e, desta forma, não haverá
formação de pigmentos castanhos. Por fim, com recurso a um espetrofotómetro, mediu-

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se a absorvância a 440 nm de cada solução onde se relacionou a intensidade da cor das

diversas soluções com a concentração de chumbo presente sendo de esperar que a solução
mais escura apresente uma absorvância maior, e que a solução mais clara tenha um valor
de absorvância menor (Morais, Marques, & Moreira, 2022).

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Métodos
Para a execução deste trabalho laboratorial seguiram-se uma série de passos abaixo
representados num diagrama

Passo 1 – Extração da enzima

Revestir a parte interna do almofariz com Introduzir no almofariz a banana,

areia e 25,0 mL de água de
duas camadas do tecido (muslin) e pesar
desionizada e homogeneizar tudo
aproximadamente 8 gramas da banana
muito bem.
(c/1 cm de espessura) e registar o valor.

Colocar o líquido extraído, que contém a Com cuidado, juntar as extremidades do

catecol oxidase, num frasco de vidro. Em caso
de turvação, transferir o líquido para tubos de
centrifuga e realizar a sua centrifugação
durante 5 minutos a 200 rpm (calibrar os
tubos de centrifuga).
tecido (muslin) colocado no almofariz de
forma a formar um saco e espremer o
mesmo de forma a obter cerca de 10mL
de líquido/extrato.

Passo 2 – Estudar a inibição da enzima causada pelo chumbo

Proceder à preparação das 5 amostras

a serem estudadas (A, B, C, D e E).
Adicionar a cada tudo os valores
respetivos descritos na tabela 1, para
o volume total de 20,0 mL.

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Tabela 1- Quantidades de reagentes a adicionar aos tubos

Tudo ensaio A B C D E

Solução tampão pH 7 (mL) 10 10 10 10 10

Solução de acetato de -- (sem 2 2 5 8

chumbo 5% (mL) chumbo)
Água desionizada (mL) 8 7 6 3 ----

Solução de catecol 1% 1 1 1 1 1
(mL)
Extrato enzimático (mL) 1 1 1 1 1

Total (mL) 20 20 20 20 20

Agitar, de forma vigorosa, os tubos, Filtrar o conteúdo de cada tubo para tubos
previamente selados com parafilm, de ensaio, mexendo com uma vareta para
no vortéx. auxiliar a filtração.

Observar atentamente as cores obtidas em cada

Proceder à identificação dos tubos indicando o
ensaio e medir a absorvância de todas as
tipo de amostra, nº do grupo, curso, turma, data
soluções a a λ = 440 nm, em duplicado.
e hora e esperar pelo aparecimento de uma
Utilizar uma solução tampão com pH 7,0 como
coloração amarelada. Esta coloração é
branco.
indicativo de que a tirosinase está a converter
Registar os valores das leituras obtidos.
o catecol em bezoquinona.
Com cuidado, colocar as células no
espectrofotómetro.

Realizar o procedimento pela seguinte ordem:

- Leitura do branco (fazer zero);
- Leitura das amostras tendo em conta a ordem crescente da concentração de chumbo
- Usar sempre células novas
- Repetir as leituras (duplicado), seguindo o mesmo
5 procedimento
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Resultados

Dado por concluída a filtração do conteúdo de cada tubo, figura 1, efetuou-se a leitura,
em duplicado da absorvância das amostras, obtendo assim os valores apresentados na

Figura 1- Amostras A,B,C,D e E (direita para a esquerda) após a filtração.

Tabela 2- Resultados obtido referentes a Absorvância com o respetivo desvio padrão.

Tubo Concentração de Acetato de chumbo Absorvância 1 Absorvância 2 Absorvância Media Desvio Padrão
A 0 1,073 1,077 1,075 0,002
B 0,0065 1,044 1,046 1,045 0,001
C 0,013 1,031 1,035 1,033 0,002
D 0,0325 0,711 0,71 0,7105 0,0005
E 0,052 0,37 0,369 0,3695 0,0005

De seguida procedeu-se a representação gráfica destes mesmos resultados, Gráfico 1,

onde se observou que a absorvância é inversamente proporcional a concentração de
acetato de chumbo presente na amostra.

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1,2
1,1
A B C
Absorvância Media (λ=440 nm)
1
0,9
0,8
0,7 D
0,6
0,5
0,4
E
0,3
0,2
0,1
0
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
Concentração de Acetato de Chumbo (M)

Gráfico 1- Representação gráfica da absorvância em função da concentração de acetato

de chumbo.

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Discussão dos resultados

O trabalho realizado teve como finalidade avaliar o efeito inibitório que o metal
chumbo detém sobre a atividade da enzima tirosinase (ou catecol oxidase) extraída da
banana).
Posto isto, e observando os resultados obtidos, é possível verificar que, à medida
que a solução de acetato de chumbo vai aumentando a sua concentração, a intensidade
das cores vai diminuindo. Este fenómeno vai de encontro ao objetivo desta experiência
laboratorial, ou seja, uma vez que o chumbo é responsável pela inibição da tirosinase
(enzima que tem um papel fundamental na produção de melanina, que por sua vez reage
com o oxigénio, permitindo o escurecimento da banana), quanto maior for a sua
concentração, maior será o seu potencial de inibição sobre esta enzima, isto é, menor
produção de melanina e consequentemente uma maior preservação da cor original da
banana. (Morais, Marques, & Moreira, 2022)
Analisando em mais pormenor os resultados verificados na absorvância, na
solução A, como não continha o acetato de chumbo, foi a solução que apresentou um
valor de absorvância maior, ou seja, não tinha nenhum composto a inibir a sua reação, o
que permitiu o escurecimento da solução para uma cor mais acastanhada, devido à
produção de melanina. Já nas soluções B, C, D e E, verificou-se um decréscimo gradual
nos valores obtidos na absorvância, facto que se deve a estas apresentarem níveis de
concentração diferentes do metal chumbo, ou seja, à medida que se observa o clarear das
soluções, os valores da absorvância vão diminuindo ao mesmo tempo que a concentração
é maior. Na solução E, que é a solução que contem uma maior quantidade deste metal, é
bem percetível a sua cor amarelada, quase incolor, devido a este fenómeno de maior
inibição.
Assim sendo, com este trabalho laboratorial, foi possível entender melhor o
fenómeno que faz com que a maioria dos vegetais e da fruta comecem a ficar castanhos
com o tempo e com a exposição ao oxigénio, e a importância que alguns metais (neste
caso, o chumbo), podem apresentar na preservação dos alimentos através do seu potencial
inibidor. Desta forma, foi possível concluir que a existência de chumbo nas soluções

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preparadas causa a inibição da catecol oxidase de forma diretamente proporcional

relativamente à concentração de chumbo presente.
Referências

Food and Drug Administration. (27 de Fevereiro de 2020). Lead in Food, Foodwares, and
Dietary Supplements. Metals and your Food.
Morais, R., Marques, A., & Moreira, I. (2022). Trabalho prático nº 4: Estudo da inibição pelo
chumbo da actividade da tirosinase (ou catecol oxidase) extraída da banana. TP4.
Queiroz, C., Lopes, M., Fialho, E., & Valente-Mesquita, V. (2008). Polyphenol Oxidase:
Characteristics and Mechanisms of Browning Control. Food Reviews International.