80 Manual de Aulas Práticas de Bioquímica (Braguini, 2023)

TEMA 14
DOSAGEM DE AÇÚCAR REDUTOR NO SANGUE
*OBS: Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras biológicas como sangue, urina e
saliva, não transmite infecções, todas elas devem ser consideradas como potencialmente infectantes.
Portanto, ao manuseá-las, devem-se seguir as normas estabelecidas para biossegurança. Use luvas,
jaleco e óculos.

Objetivo

Determinar a concentração de açúcares redutores em material biológico.

Relação teórico-prática

Química e metabolismo de carboidratos

Reativos

Sulfato de zinco a 5% Reativo de Nelson

Hidróxido de bário 0,3 M Solução-Padrão de glucose a 100mg%
Reativo de Somogyi

1. Sulfato de zinco a 5%: pesar 50 g de ZnSO4.7H2O e dissolver em água destilada completando o

volume para 1000 mL.
2. Hidróxido de bário 0,3 M: pesar 45 g de Ba(OH)2.8H2O e dissolver em água destilada para um
volume final de 1000 mL.
As soluções de sulfato de zinco a 5% e de hidróxido de bário 0,3 M são tituladas uma contra a
outra, utilizando fenolftaleína como indicador. Devem corresponder volume a volume.
3. Reativo de Somogyi: Pesar 24 g de carbonato de sódio (Na2CO3) e 12 g de tartarato duplo de
sódio e potássio (NaKC4H4O6.4H2O). Dissolver os sais em 250 mL de água destilada.
Separadamente, dissolver 4 g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) em 50 mL de água destilada e
adicionar gota a gota à solução de tartarato. Juntar 16 g de bicarbonato de sódio (NaHCO3).
Dissolver em 500 mL de água destilada fervente 180 g de sulfato de sódio (Na2SO4), esfriar,
misturar à solução alcalina de cobre e completar o volume para 1000 mL com água destilada.
Deixar repousar 5 dias, filtrar e conservar em frasco escuro a 20-30°C.
4. Reativo de Nelson: pesar 50 g de molibdato de amônio [NH42MoO4.4H2O] e dissolver em 500 mL
de água destilada. Adicionar 42 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado. Dissolver 12 g de
arseniato de sódio (NaHAsO4.7H2O) em 50 mL de água destilada e juntar à solução de molibdato.
Misturar e completar o volume para 1000 mL. Conservar em frasco escuro a 37°C.
5. Solução padrão de glucose a 100mg%: pesar 100 mg de glucose, previamente dessecada a
vácuo por 24 horas. Dissolver em 100 mL de solução de ácido benzóico a 0,1%. Conservar a 4°C.
No momento de uso diluir 1:10 com água destilada de tal maneira que 1 mL contenha 100 µg.

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PARTE I: CURVA DE CALIBRAÇÃO

Técnica

1. Curva de calibração
a. Numerar 6 tubos de ensaio e adicionar os reagentes como indicado na tabela a seguir:

Tubo 1
Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6
branco
Padrão de glucose diluído 1:10 (mL) - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Água destilada (mL) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 -
Reativo de Somogyi (mL) 1 1 1 1 1 1
b. Misturar e levar ao BM fervente por 10 minutos.
c. Resfriar e adicionar a todos os tubos 1 mL do reativo de Nelson.
d. Completar o volume para 10 mL com água destilada e ler a absorbância dos tubos contra
o tubo branco (tubo 1), em 540 nm.
e. Traçar o gráfico ABS x Concentração de glucose.
f. Determinar a concentração de glucose presente na amostra de sangue.

PARTE II: DETERMINAÇÃO DE AÇÚCAR REDUTOR NO SANGUE

2. Desproteinização e reação de coloração:

a. Num tubo de centrífuga colocar 3,5 mL de água destilada e 0,1 mL de sangue total.
Misturar até completa hemólise.
b. Adicionar 0,2 mL de solução de hidróxido de bário 0,3 M, misturar e esperar 5 minutos.
c. Adicionar 0,2 mL de sulfato de zinco 5%, misturar e centrifugar por 10 min a 2500 rpm.
Utilizar o sobrenadante para a determinação.
d. Marcar dois tubos de ensaio, A (amostra) e B (branco) e adicionar, respectivamente, 1
mL do sobrenadante e 1 mL de água destilada.
e. Adicionar aos tubos A e B, 1 mL do reativo de Somogyi. Misturar e colocar no BM fervente
por 10 minutos (cobrir os tubos com bola de vidro para evitar evaporação).
f. Resfriar e adicionar aos dois tubos, 1 mL do reativo de Nelson. Misturar.
g. Completar o volume para 10 mL com água destilada e misturar.
h. Calibrar o espectrofotômetro com o conteúdo do tubo B e determinar a absorbância do
tubo A em 540 nm.
i. Verificar a concentração na curva de calibração e proceder o cálculo expressando em mg
de glucose para 100 mL de sangue.

Interpretação dos resultados

Perguntas e exercícios

1. Explique o fundamento da técnica de dosagem de glucose com o reagente de Somogyi-Nelson.

2. Que agentes desproteinizante são utilizados no experimento?
3. Se a concentração de glucose exceder 100 µg, que procedimento deve ser adotado?

Fundamentação

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Para dosagem de glucose, o sangue é desproteinizado com soluções de hidróxido de bário e

sulfato de zinco. Essas soluções precipitam proteínas como também outros compostos redutores como
ésteres fosfóricos de carboidratos, ácido úrico, creatinina e glutationa. O filtrado, livre de proteínas, é
tratado com o reativo cupro-alcalino de Somogyi, a quente. O grupo aldeído do açúcar reduz o íon cúprico
a cuproso e o óxido cuproso resultante é reoxidado pelo reativo de arseno-fosfomolibdico de Nelson a
óxido de molibdênio de cor azul. A cor desenvolvida é comparada com aquela de padrões de teor
conhecido submetidos a mesma técnica (N. Nelson 1944; Somogyi 1945).

As principais reações, considerando o açúcar redutor como a glucose são descritas a seguir.

GLUCOSE + Cu++  Ácido glucônico + Cu+

Cu++ + Arseno-fosfomolibdíco  Cu++ + Oxido de molibdênio

A intensidade da coloração azul do oxido de molibdênio (Mo2O3) formado é medida a 540 nm. A
sensibilidade da técnica espectrofotométrica quantitativa com o reagente de Somogyi-Nelson oscila de
10 a 100 µg. Os valores normais correspondem a 70 – 100 mg de glucose por 100 mL de sangue.

Figura 1: Reação de Somogyi e Nelson para determinação de açúcares redutores.

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