Grupo 9

QBQ 1453 - Bioquímica Experimental

Prática 5 - Purificação de proteínas – SDS-PAGE
Determinação do pH ótimo da alfa-glicosidase
13 de maio de 2023

1. Objetivos
- Analisar a composição de proteínas da fração que contém a-glicosidase eluída
na cromatografia de troca-iônica e compará-la com a composição de proteínas
do lisado total e da fração P2 separada por precipitação com sulfato de amônio.
- Determinar o pH ótimo da alfa-glicosidase.

2. Procedimento Experimental

Purificação de proteínas – SDS-PAGE:

Procedimento A – Preparação do gel de SDS-PAGE

Preparação do gel de separação

Adicionou-se em um tubo os volumes estipulados na Tabela 1 abaixo. A seguir,
homogeneizou-se rapidamente e transferiu-se a mistura, utilizando uma pipeta
Pasteur, para as placas de vidro previamente montadas. Aguardou-se a
polimerização – cerca de 60 minutos - e colocou-se o pente entre as placas de vidro.

Tabela 1. Preparo do gel de separação.

Soluções Volume (ml)

 Água 4,02

SDS 100 g/L 0,100

Solução A: 3,33
29,2 g de acrilamida
0,80 g de N’N’bis metilenoacrilamida 100 ml de
água qsp

Solução B: 2,5
Tris 1,5 M pH 8,8

TEMED 0,005

Persulfato de amônio (APS) 0,050

Preparação do gel de empilhamento

Após a polimerização do gel de separação, adicionou-se em outro tubo os volumes
estipulados na Tabela 2 conforme abaixo. Homogeneizou-se rapidamente e
transferiu-se a mistura, utilizando uma pipeta Pasteur, para as placas de vidro (com o
pente) contendo o gel de separação polimerizado. Aguardou-se a polimerização –
cerca de 40 minutos - e retirou-se cuidadosamente o pente, adicionando-se o tampão
de corrida (3,03 g de Tris, 14,4 g de Glicina, 1,0 g de SDS e 1 litro de água qsp).

Tabela 2. Preparo do gel de empilhamento.

Soluções Volume (ml)

Água 3,05

SDS 100 g/L 0,050

Solução A: 0,65
29,2 g de acrilamida
0,80 g de N’N’bis metilenoacrilamida 100 ml de
água qsp

Solução C: 1,25
Tris 0,5 M pH 6,8

TEMED 0,005

Persulfato de amônio (APS) 0,025

Procedimento B – Preparação das amostras

Diálise das amostras

Transferiu-se para um microtubo (eppendorf) o volume indicado de amostra. Os tubos
foram identificados e a água foi adicionada até completar 600 µL. O tubo foi coberto
com um pedaço de membrana de diálise e prendeu-se a membrana de diálise com
um anel de borracha. Transferiu-se o tubo para um suporte de isopor e um suporte foi
colocado dentro de um béquer contendo água. A agitação foi mantida por pelo menos
16 horas.

Secagem a vácuo
Após a diálise, transferiu-se as amostras para um concentrador a vácuo para
secagem.

Diluição das amostras

Em um tubo eppendorf identificado como P2 50x, adicionou-se 20 µl da fração P2,
completou-se para 1 ml com 980 µl de água e agitou-se levemente para
homogeneização.
Em um tubo eppendorf identificado como L50x, adicionou-se 20 µl de lisado e 980 µl
de água destilada e agitou-se levemente para homogeneização.

Determinação da concentração de proteínas no lisado e na fração P2 pelo

ensaio de Bradford
Em tubos de ensaio de 2,0 mL, foram adicionados volumes de água e amostras
(devidamente diluídas) do lisado conforme a Tabela 3 e em seguida 1,0 mL do
reagente de Bradford em cada tubo para serem homogeneizadas em vórtice. Depois,
200 μL de branco e de cada amostra em triplicata foram colocadas na placa de 96
poços para serem analisadas as absorbâncias a 595 nm.

Tabela 3. Preparação das amostras do lisado e fração P2.

Tubo P2 50x ou L50x (ml) Água (ml) Reagente de

Bradford (ml)

1 0,100 - 1,0

2 0,100 - 1,0

Branco - 0,100 1,0

O experimento foi realizado com outra dupla (apenas uma integrante do grupo
compareceu), portanto o volume das amostras foi determinado a partir da curva
padrão deles, que tem equação igual a y = 0,0239x + 0,0112.
Primeiro, diluiu-se as amostras em L 50x e P2 50x, chegando nos seguintes
resultados:

Tabela 4. Determinação da quantidade de amostras do lisado e fração P2.

Amostra A595 Massa de Concentração Concentração

proteína (𝜇g) de proteína sem diluição
(mg/mL) (mg/mL)

L 50x 0,541 23,10 0,231 11,55

P2 50x 0,169 7,54 0,0754 3,77

Decidiu-se, então, utilizar as amostras originais, sem diluição. Assim, os volumes

foram determinados para que fossem aplicados 20 𝜇g (0,02 mg) de proteína no gel:
1 𝑚𝐿 𝑙𝑖𝑠𝑎𝑑𝑜
0,02 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 ⋅ = 0,0017 𝑚𝐿 𝑙𝑖𝑠𝑎𝑑𝑜
11,55 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎
= 1,7 𝜇𝐿 𝑙𝑖𝑠𝑎𝑑𝑜
1 𝑚𝐿 𝑃2
0,02 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 ⋅ = 0,0053 𝑚𝐿 𝑃2 = 5,3 𝜇𝐿 𝑃2
3,77 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎

Desnaturação das proteínas presentes nas amostras

Adicionou-se os volumes especificados na Tabela 5 a tubos eppendorfs identificados
(L 50x, P2 50x, DEAE). A amostra da fração DEAE para aplicação no gel foi preparada
a partir da dissolução da alíquota liofilizada em tampão de amostra preparado
conforme a Tabela 5.
Transferiu-se os microtubos para um banho fervente, os quais foram incubados por 5
minutos e posteriormente transferidos para o gelo pelo mesmo período. Um spin foi
dado nestes tubos por no máximo 1 minuto, em seguida foram homogeneizados e as
amostras foram aplicadas nos devidos poços de um gel de eletroforese com o auxílio
de micropipetas.
Tabela 5. Determinação da quantidade de amostras do lisado e fração P2.

Tubos de Amostra Amostra Tampão de Amostra Água (𝜇L)

(𝜇L) (𝜇L)

Lisado 1,7 5 13,3

Fração P2 5,3 5 9,7

DEAE - 5 15,0

Obs.: O tampão de amostra foi preparado com 3,55 ml de Água, 1,25 ml de Solução
C (Tris 0,5 M pH 6,8), 2,50 ml de Glicerol, 2,00 ml de SDS 100 g/L, 0,20 ml de Azul
de bromofenol 5 g/L e 0,05 ml de b-mercaptoetanol.

Procedimento C – Eletroforese, coloração e descoloração

Correu-se a eletroforese a 200V durante aproximadamente 60 minutos. A fonte foi

desligada quando o corante marcador e a linha de frente atingiram a base do gel.
Após isso, os cabos foram desconectados, o gel foi retirado e colocado no frasco
contendo a solução de coloração, permanecendo por 10 minutos. Retirou-se o gel do
frasco de coloração e colocou-se no frasco contendo a solução de descoloração.
O gel foi descorado e as bandas de proteínas foram visualizadas e fotografadas.

Obs.: Solução de coloração: Solução de descoloração:

Comassie blue R 0,1 g Metanol 40 ml
Metanol 40 ml Ácido acético 10 ml
Ácido acético 10 ml Água qsp 50 ml
Água qsp 50 ml

Procedimento D – Desidratação do gel

Em um frasco contendo água, colocou-se o gel e trocou-se tantas vezes quanto foi
necessário a água do frasco até a remoção completa do ácido acético. Retirou-se o
gel hidratado do frasco com água, o qual foi colocado num frasco contendo solução
de glicerol 50 g/L. Molhou-se com a solução de glicerol lâminas de celofane natural,
dispondo-as sobre placas limpas de vidro. Colocou-se os géis sobre as lâminas de
celofane devidamente hidratadas e limpas e colocou-se outra folha de celofane
previamente hidratada sobre o gel, formando assim um sanduíche. As bolhas de
foram retiradas delicadamente e foram esticadas e presas, deixadas à temperatura
ambiente para secagem.

Determinação do pH ótimo da alfa-glicosidase:

Ensaio de atividade enzimática em três pHs diferentes

O volume de 10 ml de cada tampão (pH 4 / pH5 / pH6) foram transferidos para um
tubo Falcon de 15 ml identificado com o valor de pH correspondente. Os tubos
foram separados de acordo com a Tabela 6, mantidos no gelo. Em cada tubo uma
alíquota do substrato foi adicionada conforme especificado na tabela abaixo. Em
seguida adicionou-se o tampão de pH desejado e adicionou-se em cada tubo a
alíquota da fração L200x purificada na prática 4, agitando-os manualmente para
homogeneização. Transferiu-se todos os tubos simultaneamente para o banho a
30˚C, os quais foram incubados pelos intervalos de tempo indicados na tabela.
Ao retirar cada tubo do banho, a reação enzimática foi interrompida pela adição de 2
ml de tampão carbonato-bicarbonato pH 11, em seguida os tubos foram agitados
manualmente e deixados à temperatura ambiente. Uma vez que todos os tubos
foram retirados, leu-se as absorbâncias a 420 nm, utilizando água para calibrar
(zerar) o espectrofotômetro.

3. Resultados e Discussão

SDS PAGE
Analisando o padrão de massas e observando a distância percorrida
experimentalmente, é possível relacionar essas duas medidas:
Tabela x. Distância percorrida no gel com base nas massas molares.

Distância percorrida (cm) Massa molar (kDa)

0,8 245

1,2 180

1,7 135

2,5 100

3,2 75

4,3 63

5,2 48

7,3 35

9,5 25

10,3 20

11,7 17

13,8 11
*As distâncias foram medidas diretamente com uma régua na tela do computador

Assim, é possível montar uma curva padrão onde relaciona-se a migração relativa
com o logaritmo das massas molares. A migração relativa pode ser calculada por:
𝑉𝑥 − 𝑉𝑒𝑥𝑐𝑙𝑢𝑠ã𝑜 𝑉𝑥 − 0,8 𝑐𝑚
𝑉𝑟𝑒𝑙 = ⇒ 𝑉𝑟𝑒𝑙 = 13,8 𝑐𝑚 − 0,8 𝑐𝑚
𝑉𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 − 𝑉𝑒𝑥𝑐𝑙𝑢𝑠ã𝑜

𝑉𝑥 − 0,8 𝑐𝑚
𝑉𝑟𝑒𝑙 =
13 𝑐𝑚
Com a curva padrão, pode-se determinar a massa molar das enzimas mais
expressivas que apareceram na eletroforese da DEAE:

Tabela x+1. Massas molares das enzimas de interesse através de suas distâncias
percorridas

Distância percorrida (cm) Massa molar (kDa)

 3,9 76,66

5,8 51,94

7,1 39,79

7,8 34,48

Determinação do pH ótimo da alfa-glicosidase

Tabela 2. Absorbâncias a 420 nm das amostras em diferentes pHs, ao longo do tempo

Tubos pH 4 pH 5 pH 6

1 0,062 0,073 0,137

2 0,059 0,092 0,164

3 0,055 0,096 0,195

4 0,059 0,090 0,223

Branco de enzima 0,056 0,065 0,076

Assim, é possível determinar a quantidade de mols da alfa-glicosidase e partir da

curva padrão de para-nitrofenol.
A curva padrão da absorbância a 420 nm em função do para-nitrofenol obtida em
prática anterior resultou nos seguintes valores:

Equação da reta: y = ax + b

Coeficiente angular = a 0,0036

Intercepto no eixo y = b 0,0215

Gráfico 2. Valores de absorbância em função da quantidade de mols de p-

nitrofenolato.
 pH 4

Tubos Tempo Produto

(min) (nmol)

1 5 -4,30556

2 10 -5,13889

3 15 -6,25

4 20 -5,13889
 pH 5

Tubos Tempo Produto

(min) (nmol)

1 5 -3,75

2 10 1,527778

3 15 2,638889

4 20 0,972222

pH 6

Tubos Tempo Produto

(min) (nmol)

1 5 10,97222

2 10 18,47222

3 15 27,08333

4 20 34,86111

Determinação da atividade na fração L 200x e da atividade enzimática relativa.

Para o cálculo da atividade enzimática em pH = 5, considerou-se apenas os três
primeiros pontos, gerando a equação y = 0,6389x - 6,25, com R2 = 0,8758.
Tabela. Valores de atividade enzimática para o L 200x em diferentes pHs.

Atividade pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9
enzimática

total (mU) -0,0722 0,6389 1,6056 2,91 1,26 -0,934

na fração -3,61 31,94 80,28 145,5 63 -46,7
(mU/mL)

Relativa -2,48 21,95 55,18 100 43,30 -32,1

(%)

*Os dados para os pHs 7, 8 e 9 foram retirados de outro grupo

As quantidades de mols para o pH = 4 e pH = 9 deram, em sua maioria, negativas ao
jogar na equação da reta da curva padrão, assim como os valores de suas atividades
enzimáticas. Supõe-se, então, que não houve nenhuma reação nesses valores de pH
e, portanto, suas atividades enzimáticas relativas podem ser consideradas nulas.

4. Conclusão
Durante o experimento, foi possível observar a atividade da alfa-glicosidase e suas
características. Desse modo, conclui-se que a alfa-glicosidase é mais ativa quando o
pH está em 7. Além disso, é notório que a massa da alfa-glicosidade é entre 70-90
kDa (conforme referência), considerando então a primeira marca de distância
percorrida.

Referências:
NEEDLEMAN, Richard B. et al. Purification and characterization of an α-glucosidase
from Saccharomyces carlsbergensis. Biochemistry, v. 17, n. 22, p. 4657-4661, 1978.