Grupo 9

QBQ 1453 - Bioquímica Experimental

Prática 4 - Purificação de proteínas – Cromatografia de troca iônica
30 de maio de 2023

1. Objetivos
- Melhorar a purificação da alfa-glicosidase utilizando resina de troca iônica.

2. Procedimento Experimental

Procedimento A – Hidratação da DEAE-Sephadex

(Executado pelas técnicas)
Foram pesados 0,5 g de DEAE-Sephadex em um béquer. Em seguida, adicionou-se
100 mL de tampão fosfato 10 mM (pH 7,0) e homogeneizou-se utilizando um bastão
de vidro. Após isso, a solução preparada foi armazenada para decantação de um dia
para o outro.

Procedimento B – Montagem da coluna de troca iônica

(Executado pelas técnicas)

Para a montagem da coluna, utilizou-se o barril de uma seringa (~ 5 mL) como

suporte, o qual foi preso em um suporte. Em seguida, adicionou-se um pouco de lã
de vidro em seu interior e compactou-se na base utilizando um bastão de vidro. O
material foi lavado com água destilada e adaptou-se uma mangueira de
aproximadamente 6 cm na saída da seringa, que foi fechada com uma presilha.
Para o empacotamento da resina, utilizou-se um bastão de vidro para homogeneizar
a suspensão contendo a resina (procedimento A). A presilha foi fechada e a resina foi
adicionada até a marca de 1,0 mL, deixando-a decantar. Essa operação foi repetida
até a resina sedimentada ocupar o interior da seringa até 3,0 mL. Após a lavagem, a
presilha foi fechada, deixando 3 mm de tampão no topo da resina.

Procedimento C – Cromatografia de troca iônica

A fração P2 previamente dialisada contra tampão fosfato 10 mM (pH 7,0) foi

descongelada e mantida no gelo. A fração P2 foi homogeneizada e retirou-se uma
alíquota de 100μL, a qual foi diluída 10x adicionando-se 900μL de tampão fosfato 10
mM (H 7,0), identificada como P2 10x e mantida no gelo. Abriu-se a presilha e deixou-
se escoar todo o líquido com cuidado para não deixar a resina secar, deixando
aproximadamente 3 mm de tampão acima do nível da resina. O eluato foi descartado.
Em seguida, aplicou-se 1,0 ml de P2 10x de forma que a resina não fosse
ressuspendida e coletou-se o eluato no eppendorf 1, armazenado em gelo.

As amostras das proteínas não retidas pela coluna (eppendorf’s 2 a 8) foram

preparadas com a adição inicial de 2,0 ml de tampão sem NaCl e colhidas em
volumes de 1,0 ml, com a adição de 1,0 ml de tampão entre as coletas. A coleta nos
eppendorf’s 9 e 10 foram realizadas sem a adição de tampão. Todos os eppendorf’s
foram agitados e mantidos em gelo durante a preparação.

As amostras das proteínas retidas pela coluna (eppendorf’s 11 a 18) foram

preparadas com a adição inicial de 2,0 ml de tampão com 400 mM de NaCl e colhidas
em volumes de 1,0 ml, com a adição de 1,0 ml de tampão entre as coletas. A coleta
nos eppendorf’s 19 e 20 foram realizadas sem a adição de tampão. Todos os
eppendorf’s foram agitados e mantidos em gelo durante a preparação.

Procedimento D – Identificação das frações que contêm a a-glicosidase

Com os 20 tubos de eppendorf em banho de gelo, preparou-se um conjunto de tubos

de ensaio e foram adicionados em cada tubo 0,2 ml de substrato NPαGlc 4 mM e 0,2
ml das frações coletadas durante a cromatografia.
Após isso, os tubos foram transferidos juntos para o banho-maria a 30ºC e colocados
em incubação pelo tempo necessário para cada amostra conforme tabela a seguir:

Tabela 1. Preparo de soluções com frações de lisado em 0,2 mL de p-nitrofenil-α-

glicosídeo (NPαGlc) 4mM.

Tubos NPαGlc 4 mM Fração de Tempo de

(mL) lisado coletado incubação a 30°C
(mL) (min)

1 0,2 0,2 5

2 0,2 0,2 10

3 0,2 0,2 15

4 0,2 0,2 20

5 0,2 0,2 5

6 0,2 0,2 10

7 0,2 0,2 15

8 0,2 0,2 20

9 0,2 0,2 5

10 0,2 0,2 10

11 0,2 0,2 15

12 0,2 0,2 20

13 0,2 0,2 5

14 0,2 0,2 10

15 0,2 0,2 15

16 0,2 0,2 20

17 0,2 0,2 5

18 0,2 0,2 10

19 0,2 0,2 15

20 0,2 0,2 20
A cada remoção da incubação, foram adicionados 2,0mL de solução-tampão de
carbonato-bicarbonato em pH 11,00 para interromper a reação enzimática no tubo,
que em seguida, foi agitado manualmente.

No final do tempo de incubação de cada tubo, foram adicionados na placa de 96 poços

a quantidade de 200μL em triplicata de cada amostra e também da mesma
quantidade de água destilada para termos uma referência de branco no
espectrofotômetro, onde as absorbâncias foram lidas a 420nm.

Uma vez identificados os tubos que contém atividade enzimática, reuniu-se as frações
(eluídas na cromatografia) correspondentes em um único tubo “Falcon” identificado
como Fração DEAE – Grupo 9.

Procedimento E – Diluição das amostras para a medida da atividade ou da

concentração de proteínas

Para o ensaio de Bradford, foi preparada uma solução contendo 10μL da fração P2 e
490μL de água destilada em um tubo eppendorf de 2,0 ml, identificado como P2 50x.

Para a fração DEAE não foi necessária diluição.

Para medir a atividade da alfa-glicosidase, transferiu-se 200μL da fração P2 50x para

um tubo eppendorf de 2,0 ml e adicionou-se 1800μL de água destilada, identificado
como P2 1000x. Transferiu-se também 200μL da fração DEAE para um tubo
eppendorf de 2,0 ml e adicionou-se 1800μL de água destilada, identificado como
Fração DEAE 10x.

Procedimento F – Determinação de atividade enzimática na fração P2 e na

fração DEAE

Para a determinação da atividade enzimática, foram adicionados em 10 tubos um

volume de substrato NPαGlc 4 mM e das amostras de P2 1000x e DEAE 10x descrito
na tabela 2.
Após isso, os tubos foram transferidos juntos para o banho-maria a 30ºC e colocados
em incubação pelo tempo necessário para cada amostra conforme tabela. A cada
remoção da incubação, foram adicionados 2,0 mL de solução-tampão de carbonato-
bicarbonato em pH 11,00 para interromper a reação enzimática no tubo, que em
seguida, foi agitado manualmente.

No final do tempo de incubação de cada tubo, foram adicionados na placa de 96 poços

a quantidade de 200μL de cada amostra e também da mesma quantidade de água
destilada para termos uma referência de branco no espectrofotômetro, onde as
absorbâncias foram lidas a 420nm.

Tabela 2. Preparo de soluções com diferentes concentrações de amostra em 0,2 mL

de p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) 4mM.

Tubos NPαGlc 4 mM Amostra (P2 Tempo de

(mL) 1000x ou incubação a 30°C
DEAE 10x) (min)
(mL)

P2 1000x 1 0,2 0,2 5

P2 1000x 2 0,2 0,2 10

P2 1000x 3 0,2 0,2 15

P2 1000x 4 0,2 0,2 20

DEAE 10x 1 0,2 0,2 5

DEAE 10x 2 0,2 0,2 10

DEAE 10x 3 0,2 0,2 15

DEAE 10x 4 0,2 0,2 20

Branco de Enzima - 0,2 20

P2 1000x

Branco de Enzima - 0,2 20

DEAE 10x

Procedimento G - Dosagem de proteínas

Em tubos de ensaio de 2,0 mL, foram adicionados volumes de água e amostras
(devidamente diluídas) do lisado conforme a Tabela 3 e em seguida 1,0 mL do
reagente de Bradford em cada tubo para serem homogeneizadas em vórtice. Depois,
200 μL de branco e de cada amostra em triplicata foram colocadas na placa de 96
poços para serem analisadas as absorbâncias a 595 nm.

Tabela 3. Preparo de soluções com diferentes concentrações da solução preparada

de lisado em 1,0 mL de reagente de Bradford.

Tubos Amostra Água Reagente de

(P2 50x ou DEAE 10x) (mL) Bradford
(mL) (mL)

P2 50x 1 0,1 - 1,0

P2 50x 2 0,1 - 1,0

P2 50x 3 0,1 - 1,0

DEAE 1 0,1 - 1,0

DEAE 2 0,1 - 1,0

DEAE 3 0,1 - 1,0

Branco de Enzima - 1,0 1,0

P2 50x

Branco de Enzima - 1,0 1,0

DEAE

3. Resultados e Discussão
Os valores de absorbância, descontando o valor do branco, para as frações de P2
50x e DEAE estão na tabela a seguir:

Tabela 4. Medidas das absorbâncias das frações.

 Tubos A595

P2 50x 1 0,125

P2 50x 2 0,120

P2 50x 3 0,096

DEAE 1 0,043

DEAE 2 0,049

DEAE 3 0,046

Para o cálculo da concentração de proteínas, utilizaremos a curva padrão da

absorbância a 595 nm em função da massa de proteína (albumina) obtida em prática
anterior, que resultou nos seguintes valores:

Equação da reta: y = ax + b

Coeficiente angular = a 0,02384

Intercepto no eixo y = b -0,0187

Gráfico 1. Valores de absorbância em função da massa de proteína (albumina).

Tabela 5. Tabela para o cálculo da concentração de proteínas nas amostras obtidas.

 Tubos A420 Massa de Volume da Concentração Diluição Concentração
Média proteína solução (μg/mL) prévia do lisado
calculada a partir (mL) (x) original
da curva-padrão (sem diluição)
(μg) (mg/mL)

P2 50x 1 0,125 6,028 0,1 60,28 50 3,014

P2 50x 2 0,120 5,818 0,1 58,18 50 2,909

P2 50x 3 0,096 4,811 0,1 48,11 50 2,405

DEAE 1 0,043 2,588 0,1 25,88 - 0,026

DEAE 2 0,049 2,840 0,1 28,40 - 0,028

DEAE 3 0,046 2,714 0,1 27,14 - 0,027

Os valores de absorbância, descontando o valor do branco, para as frações obtidas

pela cromatografia de troca iônica estão na tabela a seguir:

Tabela 6. Medidas das absorbâncias das frações.

Tubos A420

1 0,011

2 0,016

3 0,020

4 0,028

5 0,040

6 0,045

7 0,058

8 0,072

9 0,084
 10 0,094

11 1,812

12 1,598

13 1,006

14 0,603

15 0,370

16 0,198

17 0,085

18 0,041

19 0,026

20 0,013

Como observado nos valores de absorbância acima apresentados, os tubos 11 a 15

apresentaram atividade enzimática, portanto foram escolhidos para compor a fração
DEAE.
A curva padrão da absorbância a 420 nm em função do para-nitrofenol obtida em
prática anterior resultou nos seguintes valores:

Equação da reta: y = ax + b

Coeficiente angular = a 0,0036

Intercepto no eixo y = b 0,0215

Gráfico 2. Valores de absorbância em função da quantidade de mols de p-

nitrofenolato.
Os valores de absorbância, descontando o valor do branco, para as frações obtidas
pela reação com o substrato de estão dispostas na tabela a seguir:

Tabela 7. Medidas das absorbâncias das diferentes frações obtidas pela

cromatografia de troca iônica em 0,2 mL de p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) 4mM.

Tubos P2 1000x DEAE 10x

A420 A420

1 0,041 0,022

2 0,052 0,023

3 0,084 0,024

4 0,131 0,026

Gráfico 3. Valores de absorbância em função do tempo de reação nas 2 amostras.

Tabela 8. Tabelas para o cálculo da atividade enzimática.

P2 1000x

Tubos Tempo A420 Produto

(min) (nmol)

1 5 0,041* 5,417

2 10 0,052 8,472

3 15 0,084 17,361

4 20 0,131 30,417

DEAE 10x

Tubos Tempo A420 Produto

(min) (nmol)

1 5 0,022* 0,139

2 10 0,023* 0,417

3 15 0,024* 0,694
 DEAE 10x

Tubos Tempo A420 Produto

(min) (nmol)

1 5 0,022* 0,139

2 10 0,023* 0,417

4 20 0,026* 1,250

*Valores fora da curva padrão (0,052-1,493)

(Sabemos que não é correto inserir valores que estão fora da curva padrão, mas todos
os valores na amostra de DEAE 10x estão. Mesmo equivocadamente, fizemos dessa
forma para que seja possível concluir o relatório.

Gráfico 4 e 5. Valores do ensaio de atividade da α-glicosidase (nmols de produto x

tempo) nas amostras.
Assim, calcula-se a atividade enzimática sabendo que a unidade (U) corresponde ao
valor da inclinação da reta (a) e considerando que U equivale a μmol/min, tem-se os
valores de atividade enzimática, concentração da atividade enzimática e a atividade
enzimática específica (considerando as diluições prévias e os volumes iniciais das
amostras originais), enriquecimento e recuperação na tabela abaixo:

Tabela 9. Valores da concentração da atividade enzimática, atividade enzimática

específica, enriquecimento e recuperação.

Procedi Volume Conc. Atividade Conc. Atividade Recupera Enrique

mento inicial da proteína enzimática atividade específica ção cimento
amostra total total (mU) enzimática (mU/mg)
(mL) (mg/mL) (mU/mL)

P2 0,2 2,776 2194 10970 3952 - -

DEAE 0,2 0,027 0,722 3,61 144 0,97% 0,04x

Comparando com os resultados obtidos na prática 3, nota-se que houve um

decrescimento na taxa de recuperação e enriquecimento se comparado aos dados
encontrados após precipitação com sulfato de amônio para a amostra de P2.
4. Conclusão

Nesta prática, encontramos diversos valores fora da curva-padrão esperada para o

experimento. Entretanto, conseguimos observar, apesar dos resultados
inconsistentes, a especificidade da alfa-glicosidase através das comparações com
resultados da prática 3, onde obtivemos os parâmetros para as proteínas totais da
amostra. Para prevenir novos resultados incoerentes com a curva-padrão, é
recomendada a análise contínua dos resultados durante a prática para observar e
corrigir possíveis desvios durante o experimento, gerando resultados fidedignos e
previsíveis conforme o procedimento correto.