Grupo 9

QBQ 1453 - Bioquímica Experimental

Prática 2 - Dosagem das Proteínas presentes no lisado e Determinação da
Atividade Enzimática do lisado
25 de abril de 2023

1. Objetivos
- Dosar colorimétricamente proteínas no lisado de Saccharomyces cerevisiae.
- Determinar a atividade da α-glicosidase no lisado de Saccharomyces
cerevisiae.

2. Procedimento Experimental

Dosagem das Proteínas presentes no lisado

I. Procedimento A – Curva-padrão de proteína

Iniciamos com a diluição da albumina em A10X, portanto, foram transferidos 100 μL

de albumina para o tudo e adicionamos 0,90 mL de água destilada para seguir com
homogeneização em vórtice.

Em seguida, 8 tubos de eppendorf foram separados e adicionados os volumes de

albumina diluída em água conforme tabela 1 abaixo, para ser adicionado o reagente
de Bradford na quantidade de 1,00ml por tubo. Os tubos foram fechados e
homogeneizados em vórtice. Após isso, os tubos foram reservados em temperatura
ambiente durante 5 minutos.
No próximo passo, foram transferidos 200μL da solução branca e das 8 amostras
diferentes para a placa e inseridas no espectrofotômetro para leitura da absorbância
a 595 nm.
Tabela 1. Preparo de soluções com diferentes concentrações da solução preparada
de albumina em 1,0 mL de reagente de Bradford.

Tubos A100X Água Reagente de

(μL) (μL) Bradford
(mL)

Branco - 100 1,0

1 10 90 1,0

2 20 80 1,0

3 30 70 1,0

4 40 60 1,0

5 50 50 1,0

6 60 40 1,0

7 80 20 1,0

8 100 - 1,0

II. Procedimento B – Dosagem de proteínas no lisado de Saccharomyces

cerevisiae

Para iniciar o procedimento, seguimos com a diluição do lisado de Saccharomyces

cerevisiae em 100x. Foram adicionados 0,1mL do lisado para o tubo de ensaio e
adicionados 9,9mL de água destilada, para ser homogeneizado em vórtice.

A amostra diluída do lisado foi dividida através da pipetagem em 4 tubos de eppendorf

com os volumes indicados abaixo de água e lisado em 1,00mL de reagente de
Bradford. Após isso, os tubos foram fechados e homogeneizados em vórtice e
deixados em descanso em temperatura ambiente pelo tempo de 5 minutos.

Em seguida, 200μL do branco e de cada amostra em triplicata foram inseridas na

placa de poços para verificar absorbâncias a 595nm em espectrofotometria.
Tabela 2. Preparo de soluções com diferentes concentrações de lisado em 1,0 mL de
reagente de Bradford.

Tubos L100X Água Reagente de

(μL) (μL) Bradford
(mL)

Branco - 100 1,0

A1 100 - 1,0

A2 50 50 1,0

A3 30 70 1,0

A4 20 80 1,0

Determinação da Atividade Enzimática do lisado

I. Procedimento A – Curva-padrão de para-nitrofenolato (já feito pelas técnicas)
Em tubos de ensaio, foram adicionados os volumes indicados na tabela 3 de para-
nitroferol 2mM e em seguida a solução tampão bicarbonato em pH 11,00 para serem
homogeneizadas em vórtice. Depois, 200μL de branco e de cada amostra foram
colocadas na placa de 96 poços para serem analisadas as absorbâncias a 420nm.

Tabela 3. Preparo de soluções com diferentes concentrações da solução preparada

de para-nitrofenol 2mM em 2,0 mL de tampão bicarbonato 250mM (pH 11,0).

Tubos p-nitrofenol Água Tampão

2 mM (μL) Bicarbonato
(μL) (mL)

Branco - 200 2,0

1 5 195 2,0

2 10 190 2,0

3 20 180 2,0

4 30 170 2,0
 5 50 150 2,0

6 75 125 2,0

7 100 100 2,0

8 125 75 2,0

9 150 50 2,0

10 175 25 2,0

11 200 - 2,0

II. Procedimento B – Diluição do lisado de Saccharomyces cerevisiae

Para seguir o procedimento B, os tubos foram mantidos em banho de gelo e foi

necessário diluir a preparação de lisado de Saccharomyces cerevisiae através da
transferência de 0,2mL de lisado no tubo “L10X” e de 1,8ml de água destilada gelada
e homogeneização suave. Após isso, retirou-se 0,4mL da solução do tubo L10X e
inseridas no tubo identificado com L50X, para adicionarmos 1,8mL de água destilada
gelada e homogeneizar a amostra.

Do tubo L50X, retirou-se 0,5mL da amostra e inseridos no tudo L200X com adição de
1,5ml de água destilada gelada, e por fim, homogeneização com cautela.

Na sequência, também foram retirados 0,4mL do tubo L200X para homogeneização

com 1,6mL de água destilada gelada no tubo L1000X. Todos os tubos foram mantidos
em gelo durante o procedimento.

III. Procedimento C – Determinação da atividade da α-glicosidase

Com os 16 tubos de ensaio em banho de gelo, o seguinte procedimento foi feito

para as diluições de lisado preparadas a partir da inicial adição do substrato e
seguinte adição das diluições de lisado. Foram adicionados em cada tudo o volume
descrito na tabela 4 para cada diluição, e em seguida, o lisado com devida diluição.
Após isso, os tubos foram transferidos juntos para o banho-maria a 30oC e
colocados em incubação pelo tempo necessário para cada amostra conforme
tabela. A cada remoção da incubação, foram adicionados 2mL de solução-tampão
de carbonato-bicarbonato em pH 11,00 para interromper a reação enzimática no
tubo, que em seguida, foi agitado manualmente.

No final do tempo de incubação de cada tubo, foram adicionados na placa de 96

poços a quantidade de 200uL de cada branco, de cada amostra e também da
mesma quantidade de água destilada para termos uma referência de branco no
espectrofotômetro, onde as absorbâncias foram lidas a 420nm.

Tabela 4. Preparo de soluções com diferentes concentrações de lisado em 0,2 mL de

p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) 4mM.

Tubos NPαGlc 4 mM Água Lisado Tempo de

(mL) (mL) diluído incubação a
(mL) 30°C
(min)

L50x 1 0,2 - 0,2 5

L50x 2 0,2 - 0,2 10

L50x 3 0,2 - 0,2 15

L50x 4 0,2 - 0,2 20

L200x 1 0,2 - 0,2 5

L200x 2 0,2 - 0,2 10

L200x 3 0,2 - 0,2 15

L200x 4 0,2 - 0,2 20

L1000x 1 0,2 - 0,2 5

L1000x 2 0,2 - 0,2 10

L1000x 3 0,2 - 0,2 15

L1000x 4 0,2 - 0,2 20

Branco de - 0,2 0,2 20

Enzima L50x
 Branco de - 0,2 0,2 20
Enzima L200x

Branco de - 0,2 0,2 20

Enzima L100x

Branco de 0,2 0,2 - 20

Substrato

3. Resultados e Discussão
A curva padrão da absorbância a 595 nm em função da massa de proteína (albumina)
pode ser obtida através dos dados a seguir:

Tabela 5. Medidas das absorbâncias das soluções de proteína (albumina).

Amostras Solução Água Reagente Massa A595 A595 -

albumina (mL) de albumina branco
A10X Bradford (μg)
(mL) (mL)

Branco - 0,10 1,0 0 0,228 -

1 0,01 0,09 1,0 1 0,237 0,009

2 0,02 0,08 1,0 2 0,252 0,024

3 0,03 0,07 1,0 3 0,267 0,039

4 0,04 0,06 1,0 4 0,311 0,083

5 0,05 0,05 1,0 5 0,327 0,099

6 0,06 0,04 1,0 6 0,372 0,144

7 0,08 0,02 1,0 8 0,396 0,168

8 0,10 - 1,0 10 0,442 0,214

Equação da reta: y = ax + b

Coeficiente angular = a 0,02384

Intercepto no eixo y = b -0,0187

Gráfico 1. Valores de absorbância em função da massa de proteína (albumina).

As médias dos valores de absorbância, descontando o valor do branco, para as
soluções do lisado também estão na tabela a seguir:

Tabela 6. Medidas das absorbâncias das soluções de lisado.

Tubos Amostras Água Reagente A595 Média A595 -

(mL) (mL) de branco
Bradford
(mL)

Branco - 0,10 1,0 0,218 -

A1 0,10 - 1,0 0,616 0,398

A2 0,05 0,05 1,0 0,463 0,245

A3 0,03 0,07 1,0 0,387 0,169

A4 0,02 0,08 1,0 0,328 0,110

Analisando a tabela anterior, percebe-se que as absorbâncias dos tubos de maior
volume de lisado (A1 e A2) estão fora da curva padrão de proteína (albumina). Logo,
foram calculadas as concentrações de proteína no lisado a partir dos tubos A3 e A4.

Tabela 7. Tabela para o cálculo da concentração de proteínas no lisado de

Saccharomyces cerevisiae.

Tubo A595 - Massa de proteína Volume da Concentração Diluição Concentração

s branco calculada a partir da amostra (mg/mL) prévia do lisado
curva-padrão (mL) (x) original
(mg) (sem diluição)
(mg/mL)

A3 0,169 0,00787 0,03 0,262 10 2,62

A4 0,110 0,00540 0,02 0,270 10 2,70

Fazendo-se uma média das concentrações encontradas, para efeitos de cálculos

posteriores considera-se uma concentração de 2,66 mg de proteínas por mL de
lisado.

As médias dos valores de absorbância, descontando o valor do branco, para as

soluções do para-nitrofenol também estão na tabela a seguir:

Tabela 8. Medidas das absorbâncias das soluções de p-nitrofenol.

Amostras p-nitrofenol Água Tampão p-nitrofenolato A420 -

2 mM (mL) Bicarbonato (nmol) branco
(mL) (mL)

1 0,005 0,195 2,0 10 0,052

2 0,010 0,190 2,0 20 0,091

3 0,020 0,180 2,0 40 0,167

4 0,030 0,170 2,0 60 0,253

5 0,050 0,150 2,0 100 0,397

6 0,075 0,125 2,0 150 0,568

 7 0,100 0,100 2,0 200 0,737

8 0,125 0,075 2,0 250 0,917

9 0,150 0,050 2,0 300 1,109

10 0,175 0,025 2,0 350 1,287

11 0,200 - 2,0 400 1,493

Equação da reta: y = ax + b

Coeficiente angular = a 0,0036

Intercepto no eixo y = b 0,0215

Gráfico 2. Valores de absorbância em função da quantidade de mols de p-

nitrofenolato.

Tabela 9. Medidas das absorbâncias das soluções de lisado, com os valores dos
brancos já descontados.
 L50x L200x L1000x
Tubos
A420 A420 A420

1 2,946 0,951 0,160

2 3,054 1,862 0,405

3 4,318 2,468 0,519

4 4,558 2,583 0,634

Branco de 0,072 0,075 0,077

Enzima

Branco de 0,072
Substrato

Branco Água 0,061

Gráfico 3. Valores de absorbância em função do tempo de reação nas três diluições.

A diluição mais adequada para a determinação da atividade enzimática é a de 1000x,

indicada pela coloração marrom. Isso se deve ao fato dela possuir um comportamento
mais similar à linearidade, que é esperado para uma curva de determinação de
atividade enzimática, em que sua velocidade pode ser descrita por: v = k [E] [S]. Como
no início de uma reação se tem baixo consumo de substrato, sua concentração é
praticamente constante, fazendo com que a velocidade dependa essencialmente da
concentração de enzima, [E], apresentando então uma equação de reta do tipo linear.
Entretanto, para dar mais precisão aos resultados, pode-se considerar os três
primeiros pontos da curva da diluição de 200x (verde), que possui um R2 mais próximo
de 1. Qualitativamente, pode-se observar que, apenas considerando os três primeiros
pontos, a curva se aproxima de um comportamento linear, o que indica que essa
curva corresponde à velocidade inicial da reação.

Tabela 10. Tabela para o cálculo da atividade enzimática.

L200x

Tubos Tempo A420 - branco Produto

(min) (nmol)

1 5 0,951 258,19

2 10 1,862 511,25

3 15 2,468 679,58

Gráfico 4. Valores do ensaio de atividade da α-glicosidase (nmols de produto x

tempo) em diluição de 200x.
Assim, sabendo que a unidade da atividade enzimática corresponde ao valor da
inclinação da reta (a) e considerando que U equivale a μmol/min, tem-se que a
atividade enzimática vale 0,042139 U nessas condições de reação, e 8,4278 U em
0,2 mL do lisado original (não diluído). Ainda considerando que o volume utilizado do
lisado original foi diluído em 200 vezes e que, como calculado anteriormente, a
concentração de proteínas no lisado vale 2,66 mg/mL, temos os valores da
concentração da atividade enzimática no lisado e da atividade enzimática específica
na tabela a seguir:
Tabela 11. Valores da concentração da atividade enzimática e da atividade
enzimática específica.

Concentração da atividade enzimática Atividade enzimática específica

(U/mL) (U/mg)

42,14 15,84

4. Conclusão

A partir da dosagem de proteínas no lisado de Saccharomyces cerevisiae, foi possível

observar na curva-padrão da albumina que nem todas as amostras estavam em
concordância com a mesma. Apesar disso, observa-se que a velocidade da reação
enzimática se aproxima do comportamento linear esperado e que dessa maneira, foi
possível encontrar os dados de concentração da atividade enzimática e sua atividade
enzimática específica, informações importantes para os próximos experimentos.