Grupo 9

QBQ 1453 - Bioquímica Experimental

Prática 3 - Precipitação com sulfato de amônio
02 de maio de 2023

1. Objetivos
- Purificar parcialmente a α–glicosidase por salting out.

2. Procedimento Experimental

Procedimento A – Precipitação com sulfato de amônio

Foram adicionados 3mL de lisado de levedura em um tubo de centrífuga. Em seguida,
adicionou-se lentamente sob constante agitação manual 90μL de solução de sulfato
de amônio. Após isso, foram adicionadas nas mesmas condições 3 alíquotas de
300μL de solução de sulfato de amônio, totalizando 1290μL de solução de sulfato de
amônio no tubo, que em seguida foi mantido em temperatura ambiente por 15
minutos.

Na centrífuga, condicionamos o tubo a 7000g durante 10 minutos na temperatura de

4°C. Removeu-se 200μL do sobrenadante para um tubo de 2,0mL identificado como
S1a. O resto do sobrenadante foi transferido de 500μL em 500μL para um novo tubo
de centrífuga identificado como S1b. O material precipitado foi ressuspendido com
1mL de tampão fosfato e transferido para o tubo P1 de 2,0mL.

No tubo S1b, adicionamos lentamente 600μL de solução de sulfato de amônio,

mantendo o tubo sob agitação constante e repetimos este passo 11 vezes,
incorretamente, totalizando 7200μL de solução de sulfato de amônio na solução. Para
isso, a concentração de sulfato de amônio foi corrigida com a adição de 3,5mL de
 água. Antes de ser condicionado à centrifugação a 7000g a 4°C por 10 minutos, o
tubo ficou em temperatura ambiente durante 15 minutos em espera.

O sobrenadante foi transferido de 500μL em 500μL, com o auxílio de uma p1000, para
um tubo de ensaio limpo e identificado como S2. O precipitado foi ressuspendido em
1mL de tampão fosfato e transferido para um tubo de plástico de 2,0mL identificado
como P2.

Procedimento B – Diluição das amostras para análise

Para preparar as amostras a serem analisadas, tivemos 8 amostras preparadas:
L50x, L800x, S1a 20x, S1a 500x, S210x, S2 200x, P2 40x e P2 2000x.

AMOSTRA L50x L800x S1a 20x S1a 500x S210x S2 200x P2 40x P2 2000x

UTILIDADE Dosagem de Dosagem de Dosagem de Dosagem de Dosagem de Dosagem de Dosagem Dosagem de

proteína atividade proteína atividade proteína atividade de proteína atividade
enzimática enzimática enzimática enzimática

QTD LISADO 20μL 75μL 50μL 50μL 200μL 60μL 25μL 25μL

QTD ÁGUA 980μL 1125μL 950μL 1200μL 800μL 1140μL 975μL 1225μL
DESTILADA

As amostras foram preparadas com a adição da quantidade de lisado no tubo de

2,0ml com a ajuda de uma pipeta (conforme valor de lisado) e em seguida com a
adição de água destilada referente para completar a diluição. Após isso, foram
agitados e mantidos em gelo durante a preparação.

Na amostra S210x, foram adicionados o dobro de lisado recomendado (de 100μL

para 200μL) para manter a diluição esperada de 10x no frasco. Para isso, a
quantidade de água destilada necessária para diluição também foi ajustada (de 900μL
para 800μL).

Procedimento C – Dosagem de proteínas

Em tubos de ensaio de 2,0 mL, foram adicionados volumes de água e amostras

(devidamente diluídas) do lisado conforme a Tabela 1 e em seguida 1,0 mL do
reagente de Bradford em cada tubo para serem homogeneizadas em vórtice. Depois,
200μL de branco e de cada amostra em triplicata foram colocadas na placa de 96
poços para serem analisadas as absorbâncias a 595nm.

Tabela 1. Preparo de soluções com diferentes concentrações da solução preparada

de lisado em 1,0 mL de reagente de Bradford.

Tubos Lisado 50x S1a 20x S2 10x P2 40x Água Reagente

(μL) (μL) (μL) (μL) (μL) de
Bradford
(mL)

Branco - - - - 100 1,0

1 30 - - - 70 1,0

2 60 - - - 40 1,0

3 - 30 - - 70 1,0

4 - 60 - - 40 1,0

5 - - 30 - 70 1,0

6 - - 60 - 40 1,0

7 - - - 30 70 1,0

8 - - - 60 40 1,0

Procedimento D – Determinação da Atividade Enzimática

Com os 20 tubos de ensaio em banho de gelo, o seguinte procedimento foi feito

para as diluições de lisado preparadas a partir da inicial adição do substrato e
seguinte adição das diluições de lisado. Foram adicionados em cada tudo o volume
descrito na tabela 2 para cada diluição, e em seguida, o lisado com devida diluição.

Após isso, os tubos foram transferidos juntos para o banho-maria a 30oC e

colocados em incubação pelo tempo necessário para cada amostra conforme
tabela. A cada remoção da incubação, foram adicionados 2,0mL de solução-tampão
de carbonato-bicarbonato em pH 11,00 para interromper a reação enzimática no
tubo, que em seguida, foi agitado manualmente.
No final do tempo de incubação de cada tubo, foram adicionados na placa de 96
poços a quantidade de 200μL de cada amostra e também da mesma quantidade de
água destilada para termos uma referência de branco no espectrofotômetro, onde
as absorbâncias foram lidas a 420nm.

Tabela 2. Preparo de soluções com diferentes concentrações de lisado em 0,2 mL de

p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) 4mM.

Tubos NPαGlc 4 mM Água Lisado Tempo de

(mL) (mL) diluído incubação a 30°C
(mL) (min)

L800x 1 0,2 - 0,2 5

L800x 2 0,2 - 0,2 10

L800x 3 0,2 - 0,2 15

L800x 4 0,2 - 0,2 20

S1a 500x 1 0,2 - 0,2 5

S1a 500x 2 0,2 - 0,2 10

S1a 500x 3 0,2 - 0,2 15

S1a 500x 4 0,2 - 0,2 20

S2 200x 1 0,2 - 0,2 5

S2 200x 2 0,2 - 0,2 10

S2 200x 3 0,2 - 0,2 15

S2 200x 4 0,2 - 0,2 20

P2 2000x 1 0,2 - 0,2 5

P2 2000x 2 0,2 - 0,2 10

P2 2000x 3 0,2 - 0,2 15

P2 2000x 4 0,2 - 0,2 20

Branco de Enzima - 0,2 0,2 20

L800x

Branco de Enzima - 0,2 0,2 20

S1a 500x
 Branco de Enzima - 0,2 0,2 20
S2 200x

Branco de Enzima - 0,2 0,2 20

P2 2000x

Branco de 0,2 0,2 - 20

Substrato

Procedimento E – Diálise da amostra purificada

Foi escolhida a fração de P2, em tubo de 2,0mL. Adicionou-se 80μL de PMSF e o

tubo foi coberto com um pedaço de membrana de diálise e preso com anel de
borracha. O tubo foi colocado num suporte de isopor e colocado num béquer com
tampão fosfato 10mM pH 7.0 Foi mantido em agitação constante por 16h.

3. Resultados e Discussão
A curva padrão da absorbância a 595 nm em função da massa de proteína (albumina)
obtida na prática anterior resultou nos seguintes valores:

Equação da reta: y = ax + b

Coeficiente angular = a 0,02384

Intercepto no eixo y = b -0,0187

Gráfico 1. Valores de absorbância em função da massa de proteína (albumina).

As médias dos valores de absorbância, descontando o valor do branco, para as

soluções do lisado também estão na tabela a seguir:

Tabela 3. Medidas das absorbâncias das soluções de lisado.

Tubos Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3 A595 Média

(A595) (A595) (A595)

1 0,359 0,376 0,388 0,374

2 0,505 0,512 0,519 0,512

3 0,300 0,322 0,330 0,304

4 0,343 0,311 0,291 0,315

5 0,104 0,115 0,089 0,102

6 0,196 0,282 0,206 0,228

7 0,164 0,175 0,179 0,172

 8 0,258 0,278 0,266 0,267

Tabela 4. Tabela para o cálculo da concentração de proteínas no lisado de

Saccharomyces cerevisiae.

Tubo A595 Massa de proteína Volume da Concentração Diluição Concentração

s Média calculada a partir da solução (mg/mL) prévia do lisado
curva-padrão (mL) (x) original
(mg) (sem diluição)
(mg/mL)

1 0,374* 0,01600 0,03 0,5333 50x 26,67

2 0,512* 0,02226 0,06 0,3710 50x 18,55

3 0,304* 0,01354 0,03 0,4513 20x 9,03

4 0,315* 0,01400 0,06 0,2333 20x 4,67

5 0,102 0,00506 0,03 0,1687 10x 1,687

6 0,228* 0,01035 0,06 0,1725 10x 1,725

7 0,172 0,00800 0,03 0,2667 40x 10,67

8 0,267* 0,01198 0,06 0,1997 40x 7,99

*Medidas de absorbância fora da curva padrão de dosagem de proteínas (0,009-

0,214). Sabemos que não é ideal calcular as massas de proteína com as medidas de
absorbância dessa forma, entretanto o experimento foi feito com outro grupo (e a
curva padrão deles possui o valor máximo de absorbância em 0,230, não muito
diferente do nosso) e, assim, não tivemos total controle disso. Optamos por deixar as
concentrações dessa forma para que seja possível concluirmos o relatório, mesmo
com valores equivocados. Vale lembrar também que esse lisado não é o do nosso
grupo.
Para os cálculos posteriores, utilizaremos as médias das concentrações de proteínas
de cada amostra:
L = 22,61 mg/mL
S1a = 6,85 mg/mL
S2 = 1,706 mg/mL
P2 = 9,33 mg/mL

A curva padrão da absorbância a 420 nm em função do para-nitrofenol obtida na

prática anterior resultou nos seguintes valores:

Equação da reta: y = ax + b

Coeficiente angular = a 0,0036

Intercepto no eixo y = b 0,0215

Gráfico 2. Valores de absorbância em função da quantidade de mols de p-

nitrofenolato.
Tabela 5. Medidas das absorbâncias médias das diferentes concentrações de lisado
em 0,2 mL de p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) 4mM.

Tubos L800x S1a 500x S2 200x P2 2000x

A420 A420 A420 A420

1 0,344 0,190 0,170 0,037

2 0,593 0,329 0,311 0,068

3 0,821 0,481 0,438 0,100

4 1,076 0,651 0,559 0,155

Branco de 0,014 0,001 0,005 0,004

Enzima

Branco de 0,003
Substrato

Gráfico 3. Valores de absorbância em função do tempo de reação nas 4 diluições.

Tabela 6. Tabelas para o cálculo da atividade enzimática.

L800x

Tubos Tempo A420 - branco Produto

(min) (nmol)

1 5 0,327 84,861

2 10 0,576 154,028

3 15 0,804 217,361

4 20 1,059 288,194

S1a 500x

Tubos Tempo A420 - branco Produto

(min) (nmol)

1 5 0,186 45,139

2 10 0,325 84,306

3 15 0,477 126,528

4 20 0,647 173,750

S2 200x

Tubos Tempo A420 - branco Produto

(min) (nmol)

1 5 0,162 39,028

2 10 0,303 78,194

3 15 0,430 113,472

4 20 0,551 147,083
 P2 2000x

Tubos Tempo A420 - branco Produto

(min) (nmol)

1 5 0,030* -

2 10 0,061 10,972

3 15 0,093 19,861

4 20 0,148 35,139

*Valor encontra-se fora do intervalo de pontos de curva padrão (0,052-1,493).

Gráfico 4. Valores do ensaio de atividade da α-glicosidase (nmols de produto x

tempo) nas 4 diluições

Assim, calcula-se a atividade enzimática sabendo que a unidade (U) corresponde ao

valor da inclinação da reta (a) e considerando que U equivale a μmol/min, tem-se os
valores de atividade enzimática, concentração da atividade enzimática e a atividade
enzimática específica (considerando as diluições prévias e os volumes iniciais das
amostras originais), enriquecimento e recuperação na tabela abaixo:
Tabela 7. Valores da concentração da atividade enzimática, atividade enzimática
específica, enriquecimento e recuperação.

Procedi Volume Conc. Atividade Conc. Atividade Recupera Enrique

mento inicial da proteína enzimática atividade específica ção cimento
amostra total total (mU) enzimática (U/mg)
(mL) (mg/mL) (U/mL)

Lisado 0,020 22,61 10774 538,70 23,83 - -

original

S1 0,020 6,850 4281 214,05 31,25 39,56% 1,31x

S2 0,020 1,706 1438 71,90 42,15 13,35% 1,77x

P2 0,020 9,330 4833 241,65 25,90 44,85% 1,09x

4. Conclusão

A partir da purificação por salting out foi possível determinar a quantidade de proteínas
totais (Bradford) e a atividade enzimática. Mesmo com as alterações e ajustes de
concentração feitos durante o experimento, foi possível se aproximar da curva-padrão
ideal.