Grupo 9

QBQ 1453 - Bioquímica Experimental

Prática 1 - Lise de Células de Levedura e Dosagem de Açúcares Redutores no
Lisado Obtido
28 de março de 2023

1. Objetivos
- Preparar lisado de Saccharomyces cerevisiae, com lise das células pelo
método de vórtex.
- Dosar colorimetricamente açúcares redutores solúveis no lisado de
Saccharomyces cerevisiae.

2. Procedimento Experimental
I. Preparação do lisado de Saccharomyces cerevisiae
O peso úmido de 1 g de células de leveduras crescidas foi homogeneizado em vórtice
com uma solução tampão de 40 mL PMSF e depois foi submetido a 8 mL de pérolas
de vidro. A mistura foi agitada em vórtice por 1 min e resfriada em banho de gelo cinco
vezes (para garantir a lise das células de levedura). A mistura, então, foi centrifugada
a 900 xg por 2 minutos a 4 °C e o sobrenadante foi separado em outro tubo de ensaio,
identificado como lisado. Esse processo todo foi repetido mais duas vezes. Os lisados
resgatados de todas as repetições foram juntados em um tubo e centrifugado a 17000
xg por 10 min a 4 °C, obtendo-se o lisado clarificado. Ele foi separado em 3 alíquotas
de volumes aproximadamente iguais, que foram identificadas e reservadas em freezer
a -20° C.
II. Dosagem dos açúcares redutores no lisado de Saccharomyces cerevisiae
preparado
Para a realização da curva padrão de glicose com o colorante DNS, foram preparadas
as seguintes amostras conforme a tabela a seguir, e suas absorbâncias foram
medidas a 540 nm, descontando o valor do branco. Elas foram devidamente
homogeneizadas e submetidas a banho maria por 10 min. Todas as amostras contém
10 mL totais.

Tabela 1. Preparo de soluções com diferentes concentrações de glicose em 1,0 mL

de DNS

Amostras Solução glicose Água (mL) DNS (mL)

(mL)

Branco 0,0 1,0 1,0

1 0,1 0,9 1,0

2 0,2 0,8 1,0

3 0,3 0,7 1,0

4 0,4 0,6 1,0

5 0,5 0,5 1,0

6 0,6 0,4 1,0

7 0,7 0,3 1,0

8 0,8 0,2 1,0

9 0,9 0,1 1,0

10 1,0 0,0 1,0

0,4 mL do lisado, preparado na Prática 1, foi diluído cinco vezes (L5x), obtendo-se 2,0
mL de solução, e 0,5 mL da solução de L5x foram diluídos em 0,5 mL de água,
obtendo 3,0 mL de solução dez vezes mais diluída que o lisado original (L10x), e 0,25
mL todas as soluções foram misturadas com mais 0,75 mL de água e 1,00 mL de
DNS, em triplicata conforme a tabela a seguir, e suas absorbâncias foram medidas a
540 nm.

Tabela 2. Preparo de soluções com diferentes concentrações de lisado em 1,0 mL de

DNS

Tubos Amostras (mL) Água (mL) DNS (mL)

 L1 0,25 0,75 1,0

L2 0,25 0,75 1,0

L3 0,25 0,75 1,0

L5x 1 0,25 0,75 1,0

L5x 2 0,25 0,75 1,0

L5x 3 0,25 0,75 1,0

L10x 1 0,25 0,75 1,0

L10x 2 0,25 0,75 1,0

L10x 3 0,25 0,75 1,0

Figura 1. Preparo das amostras na placa de 96 poços para determinação por

espectrofotometria.

3. Resultados e Discussão
Com os valores das absorbâncias descontando o branco e as massas de glicose,
exibidas na tabela X, foi possível encontrar uma curva padrão da absorbância em
função da massa de glicose.
Tabela 3. Medidas das absorbâncias das soluções de glicose

Amostras Solução Água DNS Massa A540 A540 -

glicose (mL) (mL) glicose branco
(mL) (mg)

Branco 0,0 1,0 1,0 0,00 0,0493 0,000

1 0,1 0,9 1,0 0,09 0,0850 0,0357

2 0,2 0,8 1,0 0,18 0,1273 0,0780

3 0,3 0,7 1,0 0,27 0,1733 0,1240

4 0,4 0,6 1,0 0,36 0,2103 0,1610

5 0,5 0,5 1,0 0,45 0,2533 0,2040

6 0,6 0,4 1,0 0,54 0,2957 0,2464

7 0,7 0,3 1,0 0,63 0,3393 0,2900

8 0,8 0,2 1,0 0,72 0,3793 0,3300

9 0,9 0,1 1,0 0,81 0,4273 0,3780

10 1,0 0,0 1,0 0,90 0,4703 0,4210

Gráfico 1. Valores de absorbância em função da massa de glicose

As médias dos valores de absorbância, descontando o valor do branco, para as
soluções do lisado também estão na tabela a seguir:

Tabela 4. Médias das medidas das absorbâncias das soluções de lisado.

Tubos Amostras Água (mL) DNS (mL) A540 - branco

(mL)

L 0,25 0,75 1,0 0,2070

L5x 0,25 0,75 1,0 0,0360

L10x 0,25 0,75 1,0 0,0204

Para a determinação da quantidade, em mg, de glicose no lisado, foi utilizada a

absorbância medida no Tubo L, já que está dentro da curva de padrão. A absorbância
do Tubo L5x também se encontra na curva padrão, mas está quase no limite mínimo
e, portanto, a medida do Tubo L é a mais adequada.
Seguindo a equação da reta y = 0,4732 x - 0,0074, e substituindo o y por 0,2070,
encontra-se a massa de glicose, em mg:

𝑥 =
0,2070 + 0,0074 ⇒ 𝑥 = 0,453 𝑚𝑔 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒
0,4732
Entretanto, é interessante que se encontre a concentração de glicose no lisado. Para
isso, deve-se considerar que essa massa corresponde ao conteúdo de 0,25 mL do
lisado (Tubo L):

0,453 𝑚𝑔 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒
Cglicose = ≃ 1,812 𝑚𝑔 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒/𝑚𝐿 𝑙𝑖𝑠𝑎𝑑𝑜
0,25 𝑚𝐿 𝑙𝑖𝑠𝑎𝑑𝑜

1,812 𝑔 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 1 𝑚𝑜𝑙 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒

Mglicose = ⋅ ≃ 0,010 𝑚𝑜𝑙 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒/𝐿 𝑙𝑖𝑠𝑎𝑑𝑜
1 𝐿 𝑙𝑖𝑠𝑎𝑑𝑜 180,156 𝑔 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒

4. Conclusão
A partir do ensaio de dosagem de açúcares redutores solúveis pela reação entre DNS
e o lisado preparado previamente, as amostras obtidas evidenciam que a
quantificação de glicose é considerada satisfatória quando relacionada à curva
padrão construída. Essa medida é importante por ser uma evidência de que ocorreu
a lise da massa das células, garantindo que a determinação do conteúdo do lisado
seja possível nas práticas seguintes.