UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

INSTITUTO DE QUÍMICA E BIOTECNOLOGIA

LABORATÓRIO DE BIOQUIMICA
PROF. DRA. SÔNIA SALGUEIRO MACHADO

JOSÉ RONALDO DE ARAUJO

PRATICA 03: QUANTIFICAÇÃO DE AÇUCARES REDUTORES PELO DNS

Maceió/AL
2021
 JOSÉ RONALDO DE ARAUJO

PRATICA 03: QUANTIFICAÇÃO DE AÇUCARES REDUTORES PELO DNS

Relatório de aula prática apresentando ao

Curso de graduação em Química
Tecnológica e Industrial, da Universidade
Federal de Alagoas, como requisito para
obtenção de nota da disciplina de
Laboratório de Bioquímica.

Maceió/AL
2021
1. Introdução
Açúcares redutores são carboidratos que possuem seu grupo carbonílico livre, capazes
de se oxidar na presença de agentes oxidantes em solução alcalina. Essa oxidação ocorre
apenas com o monossacarídeo em sua forma linear – que está em equilíbrio com sua
estrutura cíclica. Assim, o carbono carbonílico, denominado anomérico quando na
estrutura cíclica, é oxidado a um grupo carboxílico. Por outro lado, os carboidratos cujos
carbonos anoméricos estão envolvidos em ligações glicosídicas, sendo incapazes de
assumirem a sua forma linear e, portanto, de se oxidarem em solução alcalina, são
denominados açúcares não redutores, como exemplo, a sacarose (SILVA et al., 2003;
NELSON; COX, 2014).
Dentre os açúcares redutores, duas hexoses particularmente importantes para a
indústria, especialmente a de alimentos, são a glicose e a frutose. Esses carboidratos são
dois dos principais monossacarídeos presentes em processos fermentativos, dentre os
quais se destacam a produção de vinho, cachaça e etanol combustível (BASSO et al.,
2008; STAMBUK et al., 2008; TRONCHONI et al., 2009; BADOTTI et al., 2010;
CORTÉS et al., 2010; SANTOS et al., 2011; DÁRIO, 2012; DELLA-BIANCA et al.,
2013). A glicose e a frutose são monossacarídeos de seis carbonos (hexoses)
que se diferenciam pela forma cíclica e pela posição do grupo carbonila presente em suas
estruturas. A primeira é classificada como piranose, por apresentar anel com seis carbonos
em sua forma cíclica, e como aldose, por seu grupo carbonila apresentar-se como aldeído.
A segunda classifica-se como furanose, pois assume a forma cíclica
em um anel com cinco carbonos, e como cetose, pois seu grupo carbonila apresenta-se
como uma cetona (MORRISON; BOYD, 2011).
O método de DNS foi inicialmente empregado para medir açúcares no sangue e
na urina (SUMNER, 1921; SUMNER; SISLER, 1944; GONÇALVES et al.,
2010;TEIXEIRA et al., 2012). Mais tarde, Miller (1959) aperfeiçoou o ensaio, de modo
que seu protocolo foi o mais empregado por muitos anos, com diversos fins, e o mais
citado na literatura. O ácido 3,5-dinitrosalicílico (agente oxidante presente no reativo
DNS), sob condições alcalinas, reage com o carbono carbonílico de açúcares redutores e
se reduz a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, um composto corado cuja absorção máxima
de luz se dá a 540 nm(GONÇALVES et al., 2010; NEGRULESCU et al., 2012).
2. Objetivo do Experimento

Quantificar açucares redutores em amostras de alimentos, sucos e produtos

fermentados. Além disso, construir uma curva-padrão para determinação de açucares
redutores pelo método do DNS, usando a glicose como padrão.

3. Reagentes, vidrarias e material usado

3.1. Balão volumétrico de 250 mL;

3.2. Bequer de 10, 50 e 100 mL;
3.3. Tubos de ensaio com tampa de rosca;
3.4. Bastão de vidro;
3.5. Pipetas automáticas de 1000 e 5000µL;
3.6. Ponteiras;
3.7. Água MiliQ
3.8. Espectrofotômetro UV-VIS;
3.9. Cuvetas;
3.10. Termômetro;
3.11. Banho-maria;
3.12. Glicose para preparo da solução;
3.13. Tampão de Acetato de Sódio 100 mM;
3.14. Solução de Carboximetilcelulose a 2% (m/V)
3.15. Reagente de DNS
3.15.1. Solução A: Solução de Ácido 3,5-Dinitrosalicilico em meio básico (1g
ácido em 200 mL de NaOH 2N);
3.15.2. Solução B: Tartarato de Sódio e Potássio (300g de tartarato em 500 mL de
H2O).
OBS: Reunir as soluções A e B dos reagentes de DNS.
Considerações 1: Tartarato duplo de sódio e potássio, normalmente presente no reagente
ácido dinitrosalicílico pela redução de açúcar, interfere na ação protetora do
metabissulfito de sódio, mas também é essencial para a estabilidade da cor.
Considerações 2: O reagente ácido dinitrosalicílico, desenvolvido por Sumner para a
determinação da redução de açúcar, é composta de ácido dinitrosalicílico, tartarato duplo
de sódio e potássio, fenol, metabissulfito de sódio e hidróxido de sódio. Segundo os
autores do ensaio, Tartarato duplo de sódio e potássio é introduzido para prevenir a
dissolução do oxigênio no reagente; fenol, para aumentar a quantidade de cores
produzidas; e metabissulfito de sódio e potássio, para estabilizar a cor obtida na presença
do fenol. A base é necessária para reduzir a ação da glicose no ácido dinitrosalicílico.

4. Procedimento (Metodologia)

4.1. Prate 1 – Curva Padrão do Método do DNS (Preparo da Solução Padrão de

Glicose: Solução de estoque de 10g/L glicose)
 4.1.1. Em 14 tubos de Eppendorf, preparar os seguintes pontos da curva, em
duplicata com exceção do branco (300µL);
4.1.2. Adicionar 200µL de DNS em cada tubo, agitar e aquecer à 100ºC em
banho-maria durante 5 min;
4.1.3. Resfriar os tubos e acrescentar 500µL de água destilada em cada tubo,
tampar os tubos e homogeneizar;
4.1.4. Proceder a leitura da absorbância em espectrofotômetro no comprimento
de onda igual =540 nm.

4.2. Parte 2 – Hidrólise Enzimática de carboximetilcelulose por endoglucanases

(hidrolisa ligações β1,4 da celulose). Nesta etapa serão preparados um
branco para cada amostra.

4.2.1. BRANCO: Adicionar a um tubo eppendorf 200µL do tampão de acetato

de sódio 100 mM e 100µL da solução de CMC a 2% ;
4.2.2. AMOSTRA: Adicionar a um tubo de eppendorf 190µL do tampão de
acetato de sódio 100 mM e 100µL da solução de CMC a 2% e 10µL de um
filtrato de cultivo de fungo contendo atividade de endoglucanases;
4.2.3. Transferir os tubos para um banho a 50ºC e incubar por 60min para que
ocorra a hidrolise da carboximetilcelulose;
4.2.4. Em seguida resfriar a temperatura ambiente e adicionar 200µL do reagente
de DNS em cada tubo de eppendorf;
4.2.5. Incubar os tubos em banho a 100ºC por 5 min;
4.2.6. Em seguida resfriar em banho de gelo;
4.2.7. Adicionar 50µL de água MiliQ;
4.2.8. Proceder com a leitura no espectrofotômetro em comprimento de onda
=540 nm.
5. Resultados e Discussões
Após a execução da parte 1 do experimento que foi a construção da curva padrão do
método de DNS, obteve-se os seguintes dados, conforme tabela 1:

Tabela 01: Dados para Construção da Curva Padrão do Método de DNS

Tubos Glicose (g/L) ABS (540 nm)
Branco 0 -
1 0,001 0,002
2 0,005 0,004
3 0,01 0,004
4 0,02 0,005
5 0,025 0,006
6 0,05 0,012
7 0,1 0,05
8 0,2 0,147
9 0,3 0,218
10 0,4 0,311
11 0,6 0,483
12 0,8 0,67
13 0,9 0,732
14 1,0 0,793

Com a informação da tabela 01, foi possível a determinação da curva padrão

CURVA PADRÃ GLICOSE À 540 NM

0,9
y = 0,8214x - 0,0124
0,8 R² = 0,998

0,7

0,6

0,5
ABS 540 NM

0,4

0,3

0,2

0,1

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
-0,1
CONCENTRAÇÃO GLICOSE (G/L)

Na parte 2 do experimento foi feito a leitura afim de quantificar a presença de

açucares redutores estão na amostra.
 Os ABS encontrados foram:
ABS1 = 0,342 = Y
ABS1’ = 0,331 = Y

Utilizando a equação obtida na reta da curva, foi possível calcularmos a

concentração da amostra analisada.
𝑌 = 0,8214𝑋 − 0,0124
0,342 = 0,8214𝑋 − 0,0124
0,342 − 0,0124
𝑋=
0,8214
𝑋 = 0,4013 g/L
Ao entrar em contato com o açúcar redutor em meio alcalino o ácido 3,5-
dinitrosalicílico, se reduz ao ácido 3-amino-5-nitrosalícilico formando um composto
acastanhado, conforme reação descrita abaixo (figura 1). Por essa razão, observamos
visualmente que quando maior a concentração da solução, maior é a intensidade de cor
do produto formado pelo teste de DNS, conforme detectado no vídeo do experimento.
6. Conclusão
Diante dos resultados obtidos na pratica e descrito neste relatório, conclui-se que o
método do DNS para quantificação de açucares redutores é eficiente para a finalidade que
foi proposta. Vale destacar que o procedimento tem um alto consumo de reagentes,
conforme descrito em muitos estudos similares.
7. Referências Bibliográficas

Roteiro da aula prática, fornecido pela professora;

1
https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/item/81580/1/cot-85.pdf;
2
https://www.scielo.br/j/bjft/a/d9tY3nqNkxVk5gYngTSPLDr/?lang=pt&format=pdf;