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METODOLOGIAS PADRONIZADAS
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Nível: Grupo de Bioativos – Projeto Acerola

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Título: Determinação direta de L-ácido ascórbico por
espectrofotometria (vitamina C)

1. Referências

SELIMOVIC, A.; SALKIC, M.; SELIMOVIC, A. 2011. Direct Spectrophotometric

Determination of L-ascorbic acid in Pharmaceutical Preparations using Sodium Oxalate
as Stabilizer. International Journal of Basic & Applied Sciences IJBAS-IJENS, v.
11, n. 2, p. 106-109.

FERNANDES, F.A.N.; SANTOS, V.O.; RODRIGUES, S. 2018. Effects of glow plasma

technology on some bioactive compounds of acerolajuice. Food Research
International(in press).

2. Objetivo da metodologia

O objetivo desta metodologia é estimar a quantidade de vitamina C em soluções

líquidas utilizando oxalato de sódio como estabilizador do L-ácido ascórbico presente
nas amostras de sucos ou extratos de frutas tropicais.

3. Princípio técnico

A vitamina C é reconhecida há muito tempo pela sua importância nutricional e pode

ser obtida a partir de diversos alimentos através da nutrição. A forma reduzida da
vitamina C é referenciada como L-ácido ascórbico, enquanto a forma oxidada é
reconhecida como ácido dehidroascórbico. Para humanos, ambas as formas são
biologicamente ativas. Há várias formas de estimar a quantidade de vitamina C em
amostras de alimentos e composições, sendo que o uso direto da luz ultravioleta (UV) é
uma delas. Em soluções aquosas, o L-ácido ascórbico é bastante instável e pode
rapidamente ser convertido em ácido dehidroascórbico, entretanto, esta reação é
reversível e pode ser prevenida pelo uso de um agente estabilizador em solução.
Portanto, a função do oxalato de sódio nesta metodologia é inibir a reação de oxidação
do L-ácido ascórbico, permitindo assim sua quantificação de maneira integral em
solução aquosa sob luz UV.

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4. Procedimento

Prepare as soluções envolvidas na análise com antecedência ao início do

procedimento analítico. São estas:

1) Solução tampão pH 5.4 como diluente do ácido oxálico

2) Solução de ácido oxálico como estabilizador na análise = AO
3) Solução de ácido ascórbico como padrão para curva de calibração = AA

4.1. Preparo da solução (1) tampão

Prepare o tampão utilizando uma mistura dos reagentes Dihidrogeno-fosfato de

potássio (KH2PO4) e Hidrogeno-fosfato de sódio (Na2HPO4.2H2O). Para
preparar a solução tampão, pese as seguintes quantidades descritas no quadro
abaixo de cada sal, e dissolva-os na quantidade correspondente de água destilada
em um béquer e utilizando um bastão de vidro. Se necessário, utilize um agitador
magnético para auxiliar na dissolução. A medição do volume de água do tampão
pode ser feita em proveta (não é necessário utilizar balão volumétrico nesta etapa).

Componente Para 500 ml de tampão Para 1.000 ml de tampão

KH2PO4 2,04 g 4,08 g
Na2HPO4.2H2O 0,08 g 0,16 g
Água destilada 500 ml 1.000 ml

Uma vez que os sais estejam completamente dissolvidos na solução, meça o pH

da mesma. Se a resposta de pH estiver na faixa entre 5.2 e 5.4, nenhum ajuste é
necessário. Se o pH for inferior a 5.2, adicione cuidadosamente algumas pérolas de
NaOH para ajustar até a faixa desejada; caso o pH seja superior a 5.4, adicione
cuidadosamente algumas gotas de ácido clorídrico ou sulfúrico em solução fraca para
ajustar até a faixa desejada (5.2-5.4).

*lembrete: o pHmetro requer calibração antes do uso, certifique-se que o

equipamento que você está utilizando foi calibrado recentemente, ou proceda à
calibração antes da medição.
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Armazene a solução tampão preparada em temperatura ambiente para uso na fase

seguinte.

4.2. Preparo da solução (2) de oxalato de sódio 0,005M

Pese 0,75 g de ácido oxálico em pó e dissolva em 1.000 mL da solução tampão

preparada acima, ou, pese 0,375 g para um volume final de 500 mL da mesma.
Esta etapa pode ser realizada utilizando béquer e proveta para medir o volume.
Acondicione a solução de ácido oxálico em um frasco com tampa e identifique com
etiqueta (nome da solução / data do preparo / responsável pelo preparo).

4.3. Preparo da solução (3) de ácido ascórbico (AA)

Pese 0,05 g de ácido ascórbico e dissolva em 250 mL da solução (2) de ácido

oxálico 0,005M (200mg/L) preparada na etapa anterior. Esta etapa deve ser feita
em um balão volumétrico com bastante cuidado, pois é o preparo do padrão
analítico que será usado na curva de calibração. Depois de dissolvido
completamente, transfira a solução de ácido ascórbico do balão para um frasco de
guarda com tampa e identifique com etiqueta (nome da solução / data do preparo /
responsável pelo preparo).

4.4. Curva de calibração

• Para confeccionar a curva de calibração do ácido ascórbico, dispunha 6

tubos plásticos de falcon com capacidade para 15 ml ou em micro-tubos de
2 mL em uma grade e identifique-os com os números de 1 a 7.
• Faça as misturas conforme descrito no quadro abaixo utilizando a solução
(3) de ácido ascórbico preparada acima – como padrão – de Solução
Oxalato de sódio, permitindo obter um gradiente de concentração crescente
para a curva de calibração, sendo:

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Curva para tubos de plásticos (15 mL)

Tubo Concent. Vol. Padrão AA Sol. Oxalato de sódio Volume total

BRANCO 0 mg/L 0 10 mL 10 mL
1 4 mg/L 0,2 mL (200 ul) 9,8 mL 10 mL
2 8 mg/L 0,4mL ( 400 ul) 9,6 mL 10 mL
3 12 mg/L 0,6mL( 600 ul) 9,4 mL 10 mL
4 16 mg/L 0,8 mL( 800 ul) 9,2 mL 10 mL
5 20 mg/L 1 mL (1000 ul) 9,0 mL 10 mL
6 28 mg/L 1,4 mL(1400ul) 8,6 mL 10 mL
7 32 mg/L 1,6 mL(1600 ul) 8,4 mL 10 mL

Curva para micro-tubos (2mL)

Tubo Concent. Vol. Padrão AA Sol. ác.oxálico Volume total

BRANCO 0 mg/L 0 2 mL (2000 ul ) 2 mL
1 4 mg/L 0,040 mL (40 ul) 1,96 mL (1960 ul) 2mL
2 8 mg/L 0,080 mL (80 ul) 1,92 mL (1920 ul) 2 mL
3 12 mg/L 0,120 mL(120 ul) 1,88 mL (1880 ul) 2 mL
4 16 mg/ 0,160 mL (160 ul) 1,84 mL (1840 ul) 2 mL
5 20 mg/L 0,200 mL (200 ul) 1,80 mL (1800 ul) 2 mL
6 28 mg/L 0,280 mL (280 ul) 1,720 mL (1720 ul) 2 mL
7 32 mg/L 0,320 mL (320 ul) 1,680mL (1680 ul) 2 mL

• Preferencialmente inicie adicionando os volumes de água aos tubos, e

depois, adicione os volumes do padrão dispensando o ácido ascórbico sob a
água com a ponteira imersa na água. Troque de ponteira para cada tubo.
Depois de distribuídos todos os volumes, tampe os tubos e homogeneíze-os
em vórtex;
• Submeta os seis padrões diluídos da curva de calibração ao procedimento
4.5 Determinação da vitamina C como se fossem as amostras sem esquecer
o branco. Faça as reações em, no mínimo, em triplicata para a curva;
• Ao final, plote um gráfico de Absorbância versus Concentração como
exemplificado abaixo. Extraia do gráfico a equação da reta e certifique-se de
que o R2 é superior a 0.997.

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4.5. Determinação da vitamina C

Antes de iniciar a análise, recomenda-se ligar o espectrofômetro e aguardar sua

estabilização no comprimento de onda de leitura (266 nm) enquanto faz as
reações.

• Para quantificar vitamina C, misture 200 μL de amostra (integral ou diluída

conforme a necessidade - você deve conhecer a sua amostra) com 1,5 ml
da solução de oxalato de sódio 0,005M. Faça também um tubo com 200 μL
de água destilada com 1,5 ml da solução de oxalato de sódio 0,005M de
para utilizar como BRANCO.

Obs.1: a mistura deve ser feita em tubos plásticos (eppendorf) com

capacidade para 2 ml em triplicata para cada amostra, exceto o Branco.
Obs.2:as diluições devem ser realizadas na oxalato em solução de oxalato de
sódio.
• Deixe a mistura em temperatura ambiente para extração da vitamina C
durante 5 minutos (utilize cronômetro para controlar o tempo);
• Faça a leitura do Branco e das amostras em espectrofômetro ajustado para
266 nm, que representa uma faixa de leitura em luz ultravioleta, por isso, é
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necessário o uso exclusivo de cubetas de quartzo de 10 mm de

comprimento óptico;

*lembrete: nunca bater a cubeta de quartzo sob qualquer superfície, pois há

grande risco de quebra. Para esgotar líquidos entre uma leitura e outra, utilize
papel absorvente e comprima suavemente a cubeta sob sua mão apenas!

• Registre os resultados em formulário próprio e faça o descarte dos resíduos

da análise em recipiente próprio (não descartar na pia).

5. Definições e abreviaturas

Abreviatura Expressão completa e definição

N/A N/A
6. Histórico de modificações
Substitui
Versão nº Modificações desde a última versão
versão nº

01 N/A Novo documento

7. Anexos
Número Título Sigla

N/A N/A

8. Assinaturas
Nome Assinatura Data

Elaborador Otília Mônica Alves Borges

Revisor Sidnei Bordignon

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Revisor GAQ - - -

Aprovador Patrícia Poletto

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