UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR

LABORATRIO DE FRUTAS E HORTALIAS

MANUAL DE ANLISES

2010

NDICE
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

1. SLIDOS SOLVEIS (SS)

2. ACIDEZ TITULVEL (AT)
3. RELAO SS/AT
4. DETERMINAO DO PH
5. CIDO ASCRBICO
6. VITAMINA C POR ESPECTROFOTOMETRIA
7. ACARES SOLVEIS TOTAIS E REDUTORES
7.1 ANTRONA
7.2 DNS
7.3 MTODO DE SOMOGY NELSON
8. 8. CAROTENIDES
8.1 HIGBY
8.2 NAGATA E YAMASHITA
9. 9. ANTOCIANINA E FLAVONIDES AMARELOS
10. 10. DETERMINAO DE ANTOCIANINAS TOTAIS E DEGRADADAS
MTODO DE DIFERENA DE pH
11. 11. CLOROFILA TOTAL
12. 12. ANLISE DE COMPOSTOS FENLICOS TOTAIS
13. LIPDIOS OU EXTRATO ETREO EXTRAO DIRETA EM
SOXHLET
14. EXTRAO DA FRAO LIPDICA
15. NDICE DE PERXIDO DA FRAO LIPDICA
16. DETERMINAO DE VITAMINA E (TOCOFERIS TOTAIS)
17. PERDA POR DESSECAO (UMIDADE) SECAGEM DIRETA EM
ESTUFA A 105 C
18. RESDUO POR INCINERAO CINZAs
19. COR
19.1 ESPECTROFOTOMETRIA
19.2 INSTRUMENTAL

1. SLIDOS SOLVEIS (SS)

Aplicvel em amostras de produtos de frutas com ou sem a presena de slidos
insolveis. realizada em refratmetro digital.
Em produtos com pequena quantidade de slidos suspensos os resultados so
altamente precisos e muito significativos, podendo na maioria dos casos indicarem o
grau de maturidade do fruto.
Amostras lquidas:
Homogeneizar completamente a amostra, colocar uma ou duas gotas da mistura
no refratmetro e ler o resultado na escala desejada (geralmente Brix TC).
Amostras slidas:
Realizar a diluio da amostra utilizando a proporo 1:10 (amostra:gua
destilada), homogeneizar completamente a soluo, utilizar papel de filtro ou pedao de
algodo para filtrar a soluo diretamente sobre o refratmetro deixando pingar uma ou
duas gotas da soluo filtrada. Ler o resultado na escala desejada (geralmente Brix
TC).

2. ACIDEZ TITULVEL (AT)

A determinao de acidez pode fornecer um dado valioso na apreciao do estado
de conservao de um produto alimentcio. Um processo de decomposio seja por
hidrlise, oxidao ou fermentao, altera quase sempre a concentrao dos ons de
hidrognio. Os mtodos de determinao da acidez podem ser os que avaliam a acidez
titulvel ou fornecem a concentrao de ons de hidrognio livres, por meio do pH. Os
mtodos que avaliam a acidez titulvel resumem-se em titular com solues de lcali
padro a acidez do produto ou de solues aquosas ou alcolicas do produto e, em
certos casos, os cidos graxos obtidos dos lipdios.
Pode ser expressa em mL de soluo molar por cento ou em gramas do
componente cido principal.
Material
-

Proveta de 50 mL
Erlenmeyer de 125 mL
Bureta de 25 mL
Balana analtica
Esptula
Reagentes

Soluo fenolftalena (1%)

Pesa-se 1g de fenolftalena e dilui-se em lcool etlico P.A. em um balo
volumtrico de 100 mL.

Soluo de hidrxido de sdio 0,1 N

Pesar 4,00 g de NaOH em lentilhas em bquer de 250 mL, dissolver e transferir,
quantitativamente, para balo volumtrico de 1 litro, completando o volume com gua.
PADRONIZAO DA SOLUO NaOH 0,1 N
1. Pesar em vidro de relgio, em balana semi-analtica 2 g de biftalato de potssio
P.A. de frmula KHC8H4O4 e PM = 204,229
2. Secar em estufa a 103C durante duas horas
3. Transferir para o dessecador e deixar esfriar a temperatura ambiente
4. Pesar em balana analtica em um erlenmeyer de 250 mL, e em triplicata,
aproximadamente 0,6 g de biftalato de potssio

5. Adicionar 50 mL de gua a cada erlenmeyer agitando suavemente at completa

dissoluo do biftalato de potssio
6. Adicionar 2 a 3 gotas de fenolftalena a cada frasco e titular com a soluo de
NaOH utilizando uma bureta de 50 mL (VNaOH)
7. Fazer um branco com gua (50 mL de gua no erlenmeyer). Subtrair a leitura do
branco das leituras de cada um dos trs erlenmeyers contendo biftalato e tirar uma
mdia do gasto de soluo de NaOH da bureta (os valores individuais no devem diferir
em mais de 0,1 mL)
8. Usar a relao seguinte para calcular a normalidade exata da soluo de NaOH:
NNaOH = PB x 1000 / VNaOH x 204,229
Onde:
NNaOH = Normalidade da soluo de NaOH (fator do NaOH);
PB = Peso (g) do biftalato de potssio;
VNaOH = Volume (mL) da soluo de NaOH gasto na titulao
Procedimento Mtodo titulomtrico
Pesar de 1 a 5 g ou pipetar de 1 a 10 mL da amostra em Erlenmeyer de 125 mL,
adicionar 50 mL de gua e de 2 a 4 gotas da soluo fenolftalena e titular com soluo
de hidrxido de sdio 0,1 N at colorao rsea.
Procedimento Mtodo eletromtrico
Pesar de 1 a 5 g ou pipetar de 1 a 10 mL da amostra em Becker e adicionar 50 mL
de gua. Com o medidor de pH devidamente calibrado colocar os eletrodos na amostra.
Acrescentar NaOH 0,1 N da bureta, agitando a amostra continuamente at alcanar o
pH de 8,1.
Clculos mtodos titulomtrico e eletromtrico
Acidez = Vx f x 10 x Ccido
P
V = n de mL da soluo de hidrxido de sdio 0,1 N gasto na titulao
f = fator da soluo de hidrxido de sdio 0,1 N
P = n de g da amostra usado na titulao

Ccido = constante do cido presente no produto (tabela 1)

TABELA 1. Fatores para lcali 0,1 N de cidos orgnicos.
CIDO

PESO MOLECULAR

FATOR LCALI 0,1

Ctrico (anidro)
Ctrico (hidratado)

128,08
210,14

N
0,06404
0,07005

Actico

60,05

0,06005

Ltico

90,08

0,09008

Mlico

134,09

0,06705

Olico
Tartrico

0,282
150,09

0,07505

Exemplos de cidos predominantes em alguns vegetais:

cido ctrico:
Frutos: abacaxi, bagas, carambola, ctricos, ata, goiaba, mamo, maracuj, melo,
manga, mangaba, pra, pssego.
Hortalias: batata, beterraba, hortalias folhosas, tomate.
cido mlico:
Frutos: acerola, ameixa, banana, caju, cereja, ma, sapoti, coco.
Hortalias: alfafa, aipo, brcolis, cenoura.
cido tartrico: uva, tamarindo.
cido olico: amndoa de castanha de caju.
Referncia
BRASIL, Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Mtodos
Fsico-Qumicos para Anlise de Alimentos. Braslia: Ministrio da Sade, 2005,
1018p.

3. RELAO SS/AT
aplicada para sucos de frutas integrais e polpas de frutas. Este mtodo baseiase no calculo da relao Brix por acidez expressa em cido orgnico. Esta relao
utilizada como uma indicao do grau de maturao da matria prima.
Clculo
Relao SS/AT = Brix/Acidez total
Referncia
BRASIL, Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Mtodos
Fsico-Qumicos para Anlise de Alimentos. Braslia: Ministrio da Sade, 2005,
1018p.

4. DETERMINAO DO pH
Os processos que avaliam o pH so colorimtricos ou eletromtricos. Os
primeiros usam certos indicadores que produzem ou alteram sua colorao em
determinadas concentraes de ons de hidrognio. So processos de aplicao limitada,
pois as medidas so aproximadas e no se aplicam s solues intensamente coloridas
ou turvas, bem como s solues coloidais que podem absorver o indicador, falseando
os resultados. Nos processos eletromtricos empregam-se aparelhos que so
potencimetros especialmente adaptados e permitem uma determinao direta, simples
e precisa do pH.
Material
-

Bqueres de 50 e 150 mL
Proveta de 100 mL (amostras slidas)
pHmetro
Balana analtica (amostras slidas)
Esptula (amostras slidas)
Agitador magntico (amostras slidas).
Reagentes

Solues-tampo de pH 4 e 7.
Amostras lquidas:
Determinao direta do pH com o aparelho previamente calibrado, operando-o
de acordo com as instrues do manual do fabricante.
Amostras slidas:
Pesar 10 g da amostra em um bquer e diluir com auxlio de 100 mL de gua
(diluio 1:10). Agite o contedo at que as partculas, caso hajam, fiquem
uniformemente suspensas. Determine o pH, com o aparelho previamente calibrado,
operando-o de acordo com as instrues do manual do fabricante.
Referncia
BRASIL, Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Mtodos
Fsico-Qumicos para Anlise de Alimentos. Braslia: Ministrio da Sade, 2005,
1018p.

5. VITAMINA C CIDO ASCRBICO

Vitamina c por espectrofotometria
Curva Padro
Material
Bales volumtricos de 100 mL
Pipetas volumtricas de 1, 2, 3, 4 e 5 mL
Pipetas graduadas de 10 mL
Tubos de ensaio (ou copos descartveis de caf)
Reagentes
Soluo de Diclorofenol-indofenol (DFI)
cido oxlico 0,4%
cido ascrbico 0,1%
Procedimento Em uma srie de bales volumtricos de 100 mL, adicione 1, 2, 3,
4 e 5 mL da soluo de cido ascrbico 0,1%. Complete o volume com cido oxlico
0,4%. Zere o espectrofotmetro com gua destilada, ao comprimento de onda de 520
nm. Em um tubo de ensaio transfira 1 mL de cido oxlico 0,4%. Adicione 9 mL da
soluo corante de DFI e realize a leitura L1. Adicione ao tubo de ensaio alguns cristais
de cido ascrbico, para descorar a soluo, e realize a leitura L1A. De cada balo,
transfira 1 mL da soluo para dois tubos de ensaio. Em um deles adicione 9 mL de
gua destilada. Zere novamente o aparelho com esta soluo. No outro tubo adicione 9
mL de DFI e realize a leitura L2. Adicione a este tubo de ensaio alguns cristais de cido
ascrbico e realize a leitura L2A. Repita esta operao para cada balo.
Plote a curva de L contra Concentrao, onde:
L = (L1.- L1A) (L2 - L2A)
C = concentrao de cido ascrbico em mg/100 mL.
1.

Determinao

Material
Bquer de 250 mL

Balo volumtrico de 100 mL

Pipetas volumtricas de 1 mL
Pipetas graduadas de 10 mL
Proveta graduada de 50 mL
Reagentes
Soluo de Diclorofenol-indofenol (DFI)
cido oxlico 0,4%
cido ascrbico
Procedimento Pese aproximadamente 5 g da amostra (ou quantidade
conveniente) em um bquer. Adicione 40 mL de cido oxlico 0,4% e agite por 5
minutos. Transfira a amostra para um balo volumtrico de 100 mL e complete o
volume com cido oxlico. Filtre a soluo. Proceda como no preparo da curva padro
para determinao de L1 e L1A. Transfira 1 mL do filtrado para dois tubos de ensaio. Em
um deles adicione 9 mL de gua destilada. Zere novamente o aparelho com esta
soluo. No outro tubo adicione 9 mL de DFI e realize a leitura L2. Adicione a este tubo
de ensaio alguns cristais de cido ascrbico e realize a leitura L2A.
Clculos
L = (L1 - L1A) (L2 - L2A)
C=a+b*L
C x 100 = n de mg de c. Ascrbico por cento (p/p ou p/v)
P
a, b = coeficientes da curva padro
C = concentrao de cido ascrbico obtida atravs da curva padro
P = peso da amostra

2. Preparo das solues

Diclorofenol- indofenol (DFI)
Pese 12 mg (0,0120 g) do reagente 2,6-Diclorofenol-indofenol e dissolva em gua
destilada quente (60C) previamente fervida. Transfira para balo volumtrico de 500

mL, filtrando em papel de filtro qualitativo. Lave o papel at remover toda a cor. Resfrie
e complete o volume.
Mantenha a soluo ao abrigo da luz e sob resfriamento.
cido Ascrbico
Pese exatamente 0,1 g de cido ascrbico e dissolva em cido oxlico 0,4% (p/v).
Transfira para balo volumtrico de 100 mL e complete o volume com cido oxlico.
cido Oxlico 0,4%
Pese exatamente 8 g de cido oxlico e dissolva em gua destilada. Transfira para balo
volumtrico de 200 mL e complete o volume com gua destilada.
Vitamina c por titulao

6. ACARES SOLVEIS TOTAIS E REDUTORES

Mtodo de Quantificao de acar solvel total pela ANTRONA (YEMN;
WILLIS, 1954)
Consiste na hidrlise pelo cido sulfrico concentrado, que quando aquecido com
hexoses sofre uma reao de condensao, formando um produto de colorao verde e
lida no espectrofotmetro a 620 nm.
A antrona (C4H10O) o produto da reduo da antraquinona. Foi primeiramente
reconhecida por Dreywood (1946) como reagente especfico para muitos carboidratos
em soluo de H2SO4 concentrado produzindo cor azul-esverdeada caracterstica. A cor
atribuda ao produto da reao HMF (hidroximetilfurfural) ou furfural e antrona.
Material e reagentes
-

Antrona (9,10-dihidro-9-oxoanthracena)
Acido sulfrico P.A.
Becker
Basto de vidro
Balo volumtrico
Funil de filtrao
Pipetas volumtricas
Tubos de ensaio
Banho-maria para gua fervente
Espectrofotmetro
Balana analtica.
Preparo das solues

Soluo padro de glicose

Pesar 100 mg de glicose pura e dissolver em balo volumtrico de 1000 mL com
gua destilada.

Reagente de Antrona
Pesar 200 mg de antrona para balo volumtrico (100 mL) e completar o volume
com H2SO4 concentrado.
Obs.: Mantenha ao abrigo da luz e refrigerada (4 C). soluo estvel por 3 semanas.
Curva Padro da Antrona
TUBOS

S. PADRO

VOLUME

GUA (mL)

ANTRONA

Branco
P1
P2
P3
P4

10 g
20 g
30 g
40 g

(mL)
0,10
0,20
0,30
0,40

1,00
0,90
0,80
0,70
0,60

(mL)
2
2
2
2
2

Preparo do extrato
Amostras com pouco ou nenhum amido:
Pesar 1 g de amostra. Dissolver em balo de 100 mL com gua destilada. Filtrar.
Do filtrado retirar uma alquota de leitura (mximo de 1 mL).*
Amostras ricas em amido:
Pesar 1 g de amostra. Dissolver em 100 mL (em balo volumtrico) de etanol 80
%. Filtrar. Retirar uma alquota de 10 mL, colocar a alquota em um balo de 100 mL e
completar o volume com gua destilada. Retirar uma alquota de leitura (mximo de 1
mL).*
* Aps colocar a amostra e a gua, os tubos devem ir para um banho de gelo, onde
devem permanecer enquanto se coloca o reagente da antrona. Sempre aps colocar a
antrona, deve-se agitar os tubos e volt-los imediatamente para o banho de gelo. Depois
levar os tubos para banho-maria fervente por 8 minutos. Esfriar em gua gelada e ler a
absorbncia em espectrofotmetro a 620 nm.
Clculos
Amostras com pouco ou nenhum amido:
% Acares solveis totais = C / (P x al x V)
Onde:
C = concentrao (calculada atravs da substituio da absorbncia obtida na leitura da
amostra na equao da reta obtida na curva padro da antrona)
P = peso da amostra (g)
al = alquota utilizada para leitura
V = volume do balo (mL)
Amostras ricas em amido

% Acares solveis totais = C x 100/ ((al2 x F)/ V2)

Onde:
C = concentrao (calculada atravs da substituio da absorbncia obtida na leitura da
amostra na equao da reta obtida na curva padro da antrona)
al2 = alquota (mL) utilizada para leitura
F = (P x al1/ V1) x 1000000
P = peso da amostra
al1 = alquota (mL) retirada da mistura amostra e lcool 80% e colocada da
diluio 2
V1 = volume do balo (mL) da primeira diluio (diluio em lcool 80%)
V2 = volume do balo (mL) da segunda diluio
Referncia
YEMN, E.W. & WILLIS, A.J. The estimation of carbohydrate in plant extracts
by anthrone. The Biochemical Journal, London, 57:508-14, 1954.

Mtodo de Quantificao de acar solvel total e redutor pela DNS (MILLER,

1959)
Os acares redutores reagem com os ons cpricos da soluo de Fehling,
reduzindo-se a ons cuprosos, sob a ao do calor em meio alcalino. Ao reagir com os
ons cpricos, os acares sofrem oxidao, enquanto que o cobre reduzido,
formando-se um precipitado vermelho de xido cuproso. Os acares no redutores
devem sofrer uma prvia hidrlise com cido clordrico dissociando o dissacardeo em
seus monossacardeos.
Preparo da soluo
Para 50 mL do reagente:
1. Pesar 0,5 g de DNS em Becker de 100 ml
2. Pesar 15 g de tartarato de sdio e potssio em Becker de 100 ml
3. Preparar uma soluo de hidrxido de sdio 2 N (pesar 1,65 g de NaOH e dissolver em
20 mL de gua)
4. Dissolver sob aquecimento e agitao as 15 g de tartarato de sdio e potssio em 25 mL
de gua destilada (SOLUO A)
5. Dissolver parcialmente, a frio, os 0,5 g de DNS em 10 mL de NaOH 2 N anteriormente
preparado (SOLUO B)

6. Verter a soluo A na soluo B sob aquecimento e agitao, at a dissoluo completa

do DNS.
7. Resfriar a mistura em um banho gua fria sem gelo
8. Transferir a mistura para um balo volumtrico de 50 mL completando seu volume com
gua destilada
Curva padro do DNS
Preparar uma mistura de soluo de glicose 10 mM (0,450 g de glicose dissolvida
em gua destilada para balo volumtrico de 250 mL)
Adicionar em 6 tubos de ensaio com rosca, numerados de 1 a 6, as quantidades de
cada reagente, descritas na tabela abaixo.
Padro

Glicose 10 mM

1 (branco)
2
3
4
5
6

(mL)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

gua destilada
1,5
1,3
1,1
0,9
0,7
0,5

DNS

Acar redutor

1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0

(g)
0
360,32
720,64
1080,96
1441,28
1801,60

Aps a adio do DNS, agitar os tubos e levar para banho-maria a 100 C por 5
minutos. Esfriar em banho de gelo e adicionar 7,5 mL de gua destilada em cada tubo.
Agitar novamente e fazer a leitura a 540 nm.
Procedimento
Em um Becker de 100 mL pesar entre 1 e 2 g da amostra e adicionar 40 mL de
gua destilada.
Levar em banho-maria com temperatura entre 60 70 C por 5 minutos.
Esfriar em banho de gelo.
Transferir a amostra para balo volumtrico de 100 mL e aferir com gua
destilada, homogeneizar e filtrar utilizando papel de filtro qualitativo.
O filtrado o extrato do acar redutor.
Retirar 25 mL do filtrado, colocar em um Becker e adicionar 2 mL de cido
clordrico P.A.
Levar em banho-maria com temperatura entre 70- 80 C por 30 minutos.

Esfriar em banho de gelo e neutralizar a soluo utilizando NaOH 20% e com o

auxlio do papel de tornassol tendo como. Se ficar bsico pode ajustar o pH adicionando
HCl 1:1.
Transferir a soluo para balo volumtrico de 50 mL e aferir com gua destilada.
Este o extrato do acar total.
Procedimento de leitura em espectrofotmetro
Acar redutor:
Em tubos de ensaio pipetar uma alquota de at 0,5 mL do extrato de acar
redutor. Em seguida pipetar 1,0 mL de gua destilada e 1,0 mL de DNS. Agitar os tubos
e levar para banho-maria a 100 C por 5 minutos. Esfriar em banho de gelo e adicionar
7,5 mL de gua destilada em cada tubo. Agitar novamente e fazer a leitura a 540 nm.
Acar total:
Em tubos de ensaio pipetar uma alquota de at 1,0 mL do extrato de acar total.
Em seguida pipetar 0,5 mL de gua destilada e 1,0 mL de DNS. Agitar os tubos e levar
para banho-maria a 100 C por 5 minutos. Esfriar em banho de gelo e adicionar 7,5 mL
de gua destilada em cada tubo. Agitar novamente e fazer a leitura a 540 nm.
Clculos
% acar redutor = C/(al x P1 x 100)
% acar total = C/(al x P2 x 50)
Onde =
C = concentrao (calculada atravs da substituio da absorbncia obtida na leitura da
amostra na equao da reta obtida na curva padro do DNS)
al = alquota (mL) utilizada para leitura
P1 = peso da amostra (g)
P2 = (25 x P1)/100
Referncia
MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.
Analytic Chemistry, Washington, v. 31, p. 426-428, 1959.
Mtodo De Somogy Nelson

O mtodo de Somogy-Nelson permite a determinao de quantidade muito pequena de

acares. O material inicial dever ser diluida (D) em conseqncia para conseguir uma leitura
de absorbncia no espectrofotmetro entre 0,2 e 0,8. Pipetar 1 ml do material neutralizado e
filtrado, transferir para tubo de ensaio e acrescentar 1 ml do Reativo de Somogy. Levar ao
banho-maria fervente por 10 minutos. Retirar do banho e resfriar em gua corrente. Acrescentar
1 ml do Reativo de Nelson e 7 ml de gua, agitar e fazer a leitura no espectrofotmetro a 535
nm (%A).
Clculo:
A % . D . K . 100 = % Somogy Nelson
1.000.000
A% = absorbncia da amostra
K
= constante da curva padro de glicose (ver pargrafo Curva padro de glicose)
D
= diluio do material inicial
- Curva padro de glicose
Pesar 1g de glicose P.A. anidro e completar com gua a 100ml. Retirar do balo: 0,2 0,4 - 0,6 - 0,8 e 1,0 ml e transferir para balo volumtrico de 100 ml, para se obter solues a 2,
4, 6, 8, 10 mg/100ml. Retirar de cada balo volumtrico 1 ml da soluo de glicose e transferir
para tubos de ensaio, acrescentando 1 ml do Reativo de Somogy. Levar ao banho-maria fervente
durante 10 minutos tampando os tubos com bolinhas de vidro. Retirar do banho e resfriar com
gua corrente. Acrescentar 1 ml do Reativo de Nelson e 7 ml de gua destilada. Agitar os tubos
e fazer a leitura a 535 nm.

Micrograma de glicose

Clculo da constante da curva padro de glicose

120

Y2

100
80

Y1

60
40
20

X1

X2

0
0

0,2

0,4

0,6

ABS

A constante da curva padro de glicose K calculada seguindo a coeficiente diretor da reta :

Y2 - Y1 = K
X2 - X1

Material usado na metodologia:

a) Equipamentos:
espectrofotmetro
balana analtica
banho-maria fervente
agitador de tubos de ensaio
b) Vidraria:
tubos de ensaio de 15x160mm
pipetas volumtricas de 1 e 7 ml
balo volumtrico de 100 e 200 ml
c) Reagentes:
glicose anidra P.A.
fosfato cido de sdio (Na2HPO4)
tartarato duplo de sdio e potssio P.A.
hidrxido de sdio P.A.
sulfato de cobre (CuSO4 5 H2O)
sulfato de sdio P.A. (Na2SO4)
molibdato de amnio P.A. (NH4)6Mo7O24 . 4 H20
cido sulfrico concentrado P.A.
hidrognio arseniato de sdio (Na2HAsO4)
d) Diversos:
bolinhas de vidro
papel absorvente
piceta de plstico de 500ml
esptula de ao
Preparo das solues:
a) Reativo de Somogy:
Pesar 28 g de Na2HPO4 e adicionar 40 g de tartarato duplo de sdio e potssio em 700
ml de gua. Adicionar 100 ml de NaOH 1N. Gotejar 80 ml de uma soluo de CuSO 4 5 H2O a
10%, sob agitao constante. Juntar 180 g de Na 2SO4 e completar o volume com gua a 1000
ml. Deixar em repouso por 2 dias e filtrar em papel qualitativo (tipo Whatman n 42 ou similar),
guardar o reativo em frasco escuro a 37oC.
b) Reativo de Nelson:
Pesar 50 g de (NH4)6Mo7O24 . 4 H20 (molibdato de amnio) e dissolver em 800 ml de
gua. Adicionar 52 ml de H2SO4 concentrado. Juntar 6 g de hidrognio arseniato de sdio

(Na2HAsO4) dissolvidos em 50 ml de gua. Completar o volume a 1000ml. Deixar em frasco

escuro por 2 dias e conservar a 37oC.
Referncias:
NELSON, N.A. Pthotometric adaptation of the Somogy method for the determination of
glucose. J.Biol.Chem., Baltimore, n 153, p.375-80, 1944.
SOMOGY, M. Determination of blood sugar. J.Biol.Chem., Baltimore, n 160, p.69-73, 1945.

7. CAROTENIDES
Carotenides totais (HIGBY, 1962)
Procedimento
Pesa-se 5 mL ou 5 g da amostra, 15 mL de lcool isoproplico e 5 mL de
hexano, coloca-se em um Erlenmeyer protegido da luz e em seguida agita-se esta
soluo 1 min em um agitador magntico. Aps a agitao, transfere o contedo para
um funil de separao de 125 mL envolto em papel alumnio, completando-se o
contedo com gua e deixando-se descansar por 30min, fazendo-se a lavagem em
seguida (retirando a fase aquosa e deixando a fase de cor amarela). Aps trs descansos
de 30 min cada, filtra-se o contedo em um algodo (pulverizado com uma pitada de
sulfato de sdio anidro P.A.) para um balo volumtrico (25 mL) envolto em papel
alumnio, lavando o algodo com hexano e pressionando-o no funil, para que no
ficasse pigmento amarelo no algodo. Adiciona-se ao balo 2,5 mL de acetona e
completa-se o restante com hexano. O branco composto de 1 mL de acetona e 9 mL
de hexano e a leitura feita em um comprimento de onda de 450 nm.
Clculo
mg de carotenides = (Abs450 x 50)/(125 x (P/V))
Onde:
Abs450 = absorbncia lida em espectrofotmetro a 450 nm
P = peso da amostra (g)
V = volume do balo utilizado (mL)
Referncia
HIGBY, W.K. A simplified method for determination of some the carotenoid
distribuition in natural and carotene-fortified orange juice. Journal of Food Science,
Chicago, v.27, p.42-49, 1962.

Carotenides totais (NAGATA; YAMASHITA, 1992)

Procedimento:
- Colocar 1ml da amostra em tubo de ensaio;

- Misturar com 10ml da amostra de uma mistura de acetona-hexano (4:6);

- Agitar por 1minuto;
- Retirar o sobrenadante e filtr-lo com papel de filtro;
- Realizar a leitura em espectrofotmetro nos seguintes comprimentos de onda: 453nm,
505nm, 645nm e 663nm.
Branco: Apenas a mistura acetona-hexano.
Resultados:
Licopeno Resultado(mg/100 ml)= -0,0458Xa663 + 0,204Xa645 + 0,372Xa505
0,0806Xa453
-caroteno (mg/100 ml)= 0,216Xa663 1,22Xa645 0,304Xa505 +
0,452Xa453
Observao: os resultados devero ser multiplicados por 1000 para serem expressos
em g/100ml.
Referncia
NAGATA, M.; YAMASHITA, I. Simple method for simultaneous determination of
chlorophyll and carotenoids in tomato fruit. J. Japan. Soc. Food Sci. Technol., v. 39, n.
10, p. 925928, 1992.

8. ANTOCIANINAS TOTAIS E FLAVONIDES AMARELOS

Mtodo: Francis, 1982 (adaptado)
1. Colocar 1 mL ou 1 g da amostra em balo de 50mL;
2.Aferir o balo com soluo extratora;
3. Agitar e depois transferir para um frasco de vidro, envolto em papel de alumnio, e
deixou-se descansando por uma noite na geladeira (16 horas);
4. Na dia seguinte, filtra-se o material para um bcker 50 mL sempre envolto com papel
alumnio, lendo-se logo em seguida no espectrofotmetro em um comprimento de onda
de 535nm, para os flavonides realizou-se leitura a 374 nm.
O branco composto apenas da soluo de etanol - HCL (1,5N).
Soluo extratora
Preparo da soluo extratora

Colocar um pouco de gua em balo de 500 mL, adicionar 62,1 mL de HCl e

completar com gua.

Retirar 150 mL desta soluo, colocar em um balo de 1000 mL e completar com

lcool etlico 95%.

Resultados
Os resultados so expressos em mg de antocianinas totais/100mL (leitura a 535 nm ) e
mg de flavonides /100 mL (leitura a 374 nm).
Frmula
Fator de diluio x absorbnica/ 98,2
Clculo prtico:
Peso da amostra: 1,00 g
Diluio: 50 mL
Absorbncia:0,495
Fator de diluio (X):

Antocianina:

1,00g --------- 50 mL

(0,495 x 5000)/98,2=25,20mg/100g

--------- 1 mL

y = 0,02g

0,02g --------- 1 mL
100g --------- X

X = 5000

Referncia:
FRANCIS, F.J. Analysis of anthocyanins. In: MARKAKIS, P. (ed.). Anthocyanins as
food colors. New York: Academic Press, 1982. p.181-207.
Determinao de antocianinas totais e degradadas - mtodo de diferena de ph
(Fuleki e Francis, 1968b).

Materiais
Reagentes:
Cloreto de potssio (PM = 74,56).
cido clordrico (PM = 36,46).
Acetato de sdio (PM= 136,08).
gua destilada.

Equipamentos e vidrarias:
Bales volumtricos de 25 mL, 500 mL e 1000 mL.
Papel de filtro.
Cubetas de poliestireno.
Espectrofotmetro.
Preparo da soluo pH 1,0
Soluo de cloreto de potssio (KCl) 0,2 N
Seca-se o cloreto de potssio durante 2 horas a 110 C. Em seguida, dissolve-se
14,92 g e completa-se a 1000 mL.
O cloreto de potssio um cristal incolor ou branco e estvel ao ar. 100 g de
gua dissolvem 27,6 g (0 C) e 56,7 g (100 C) e a soluo neutra. tambm solvel
em lcool.
Soluo de cido clordrico (HCl) 0,2 N
Diluem-se 17 mL de cido clordrico concentrado com gua destilada e completa
o volume para 1000 mL.
Esta soluo relativamente estvel, excetuando-se a dissoluo do recipiente
vtreo.
0,2 N KCl 0,2 N HCl (25:67)
Para o preparo de 1000 mL de soluo pH 1,0, misturar 271,74 mL de soluo de
KCl 0,2 N e 728,26 mL de HCl 0,2 N. Medir o pH da soluo ao final.
Preparo da soluo pH 4,5

Soluo de cido clordrico (HCl) 1,0 N

Adiciona-se em gua 8,5 mL de cido clordrico concentrado e completa-se o
volume para 100 mL.
Acetato de sdio HCl 1,0 N gua (100:60:90)
Para o preparo de 1000 mL de soluo, adicionar 400 mL de HCl 1,0 N, 600 mL
de gua destilada e aproximadamente 84 g de acetato de sdio. Medir o pH da soluo
ao final.
OBS. Acrescentar o acetato, pesando as quantidades, at a soluo atingir o pH 4,5.
Procedimento
Preparar, em duplicata, 0,5 mL da amostra para um balo volumtrico de 25 mL,
na cor mbar, para cada uma das solues de pH. Aferir com suas respectivas solues.
Deixar em repouso por duas horas, na ausncia de luz. Aps esse tempo, filtrar e
quantificar o teor antocinico espectrofotometricamente, com comprimento de onda de
510 nm.
Utilizar para branco somente a soluo respectiva de cada pH.

9. CLOROFILA TOTAL
determinado na casca (espessura de aproximadamente 1 mm). Utiliza-se 1
grama do material contendo 10 mL de uma soluo de acetona a 80% para
desintegrao em um homogeneizador de tecidos, conforme recomendao de Bruinsma
(1963). Na ausncia deste equipamento pode ser utilizado um gral (almofariz). Ao
volume do extrato, aps a homogeneizao, adiciona-se a acetona a 80% at a completa
descolorao, seguida de filtrao. O volume final do extrato ser de 50 mL. A leitura de
absorbncia deve ser feita a 652 nm at meia hora do incio da extrao e os extratos
envolvidos em papel alumnio. Os nveis de clorofila total seram determinados em
mg/100g de casca, seguindo a equao por Engel e Poggiani (1991).
Clculo:
Clorofila Total = [( (xabs x 1000 x V) / (1000 x W) ) / 34,5] x 100
Onde: V = volume final do extrato clorofila-acetona
W = peso da casca em gramas
xabs = mdia das absorbncias
Referncia:
BRUINSMA, J. The quantitative analysis of clorophylls A and B in plant extracts.
Photochemistry and photobiology, Elmsford, v.2, p.241-249, 1963.
ENGEL, V.L.; POGGIANI, F. Estudo da concentrao de clorofila nas folhas e s eu
espectro de absoro de luz em funo sombreamento em mudas de quatro espcies
florestais. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal. Londrina, v.3, n.1, p.39-45, 1991.

10. LIPDIOS OU EXTRATO ETREO

Mtodo de extrao direta em Soxhlet
Material
Aparelho extrator de Soxhlet;
Bateria de aquecimento com resfriador de bolas;
Balana analtica;
Estufa;
Cartucho de Soxhlet ou papel de filtro de 12 cm de dimetro;
Balo de fundo chato de 250 mL;
Algodo;
Esptula;
Dessecador com slica gel.
Reagente
Hexano
Procedimento
Pesar de 2 a 5 g da amostra previamente seca (utilizada na determinao de
umidade) em cartucho de Soxhlet ou em papel de filtro e fechado nas pontas com
grampos comuns. Transfira o cartucho ou o papel de ofcio grampeado para o aparelho
extrator tipo Soxhlet. Acople o extrator ao balo de fundo chato previamente tarado a
105C1. Adicione 100 mL de hexano. Adapte a um refrigerador de bolas. Mantenha, sob
aquecimento em chapa eltrica, extrao contnua por 6horas. Retire o cartucho ou o
papel de filtro amarrado, destile o hexano e transfira o balo com o resduo extrado
para uma estufa a 105C, mantendo por cerca de uma hora. Resfrie em dessecador at a
temperatura ambiente. Pese e repita as operaes de aquecimento por 30 minutos na
estufa e resfriamento at peso constante (no mximo 2 h).
Clculo
% Lipdios = [(peso do balo com gordura seco peso do balo seco) x 100] /peso da
amostra mida

Nota: no caso de produtos contendo alta proporo de carboidratos, pese a amostra

sob papel de filtro e lave com cinco pores de 20 mL de gua. Coloque em estufa a
105C por uma hora para secagem e proceda a extrao conforme acima descrito.
Referncias Bibliogrficas:
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1:
Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos, 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985.
p. 42-43.
ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of
analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 920.39,C).
Arlington: A.O.A.C., 1995, chapter 33. p. 10-12
Mtodo de extrao por (BLIGH & DYER, 1959). Extrao frio
Material:
Capela qumica
Bcker
Estufa
Dessecador
Funil de separao
Papel de filtro
Agitador magntico
Provetas
Funil de separao de 125 mL
Algodo
Rotaevaporador com controle de presso
Balana analtica.
Reagentes:
Clorofrmio
Metanol
Sulfato de sdio anidro
Procedimento:

Pesar 12,5 g da amostra homogeneizada e transfirir para um Bcker. Adicionar

12,5 mL de clorofrmio e 25 mL de metanol. Adicionar novamente 12,5 mL de
clorofrmio e 12,5 mL de gua. Agitar, com o auxlio de um agitador mecnico, por 15
minutos, em capela qumica. Filtrar o material homogeneizado, utilizando funil de vidro
com papel de filtro contendo uma pitada sulfato de sdio anidro, para um funil de
separao de 125 mL. Aps completa separao e clarificao, recolher a camada de
clorofrmio (inferior) em balo de fundo chato com boca esmerilhada ou Becker de
vidro, previamente tarados. Evaporar num rotavapor at a completa remoo do
solvente ou na ausncia do rotavapor deixar em capela qumica com o exaustor ligado
at evaporar todo o solvente. Transferir o balo ou o Becker para uma estufa a 105C
por 1 hora. Esfriar em dessecador e pesar. Repitir as operaes de aquecimento e
resfriamento at peso constante.
Clculo
% Lipdios = [(peso do balo com gordura seco peso do balo seco) x 100] /peso da
amostra mida
OBSERVAO: O LEO EXTRADO POR ESTE MTODO PODER SER
UTILIZADO PARA DETERMINAR O NDICE DE PERXIDO, A ACIDEZ DA
FRAO LIPDICA E O TEOR DE VITAMINA E.
Referncias:
BLIGH, E. G.; DYER, W. J. A rapid method of total lipid extraction and
purification. Canada. Journal Biochem. Physiol. 37: 911-917, 1959.
SILVA, V. V. da. Caju. O produtor pergunta, a Embrapa responde. Braslia: Embrapa
SPI; Fortaleza: Embrapa CNPAT, 1998. 220 p.; il. (Coleo 500 Perguntas 500
Respostas).

11. NDICE DE PERXIDO DA FRAO LIPDICA

Segundo metodologia da American Oil Chemists' Society, mtodo Cd 8-53
(A.O.C.S., 1990)
Este mtodo determina todas as substncias, em termos de miliequivalentes de
perxido por 1000 g de amostra, que oxidam o iodeto de potssio nas condies do
teste. Estas substncias so geralmente consideradas como perxidos ou outros produtos
similares resultantes da oxidao da gordura (BRASIL, 2005).
Material:
Balana analtica;
Frasco Erlenmeyer de 250 mL;
Proveta de 50 mL;
Pipeta graduada de 1 mL;
Bureta de 10 mL.

Reagentes:
Soluo de cido actico clorofrmio (3:2);
Soluo saturada de iodeto de potssio;
Soluo de tiossulfato de sdio 0,1 N;
Soluo de amido a 0,5 % m/v;
Bureta de 10 mL.
Procedimento:
Pese (5 0,05) g da frao lipdica em um frasco Erlenmeyer de 250 mL (ou 125
mL). Adicione 30 mL da soluo cido actico-clorofrmio 3:1 e agite at a dissoluo
da amostra. Adicione 0,5 mL da soluo saturada de KI e deixe em repouso ao abrigo da
luz por exatamente um minuto. Acrescente 30 mL de gua e titule com soluo de
tiossulfato de sdio 0,1 N ou 0,01 N, com constante agitao. Continue a titulao at
que a colorao amarela tenha quase desaparecida. Adicione 0,5 mL de soluo de
amido indicadora e continue a titulao at o completo desaparecimento da colorao
azul. Prepare uma prova em branco, nas mesmas condies e titule.

Clculo:
ndice de Perxido em meq por 1000 g de amostra =

[(A B) x N x f x 1000] / P

A = volume gasto da soluo de tiossulfato de sdio 0,1 (ou 0,01 N) na titulao da

amostra
B = volume gasto da soluo de tiossulfato de sdio 0,1 (ou 0,01 N) gasto na titulao
do branco
N = normalidade da soluo de tiossulfato de sdio
f = fator da soluo de tiossulfato de sdio.
P = n de g da amostra
Nota: Se o volume gasto na titulao da amostra for menor que 0,5 mL, usando soluo
de tiossulfato de sdio 0,1 N, repita a determinao com soluo 0,01 N. No caso do
branco, o volume gasto no deve exceder a 0,1 mL da soluo de tiossulfato de sdio
0,1 N.
Referncias:
AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended
praticces of the American Oil Chemists` Society. 4th ed. Champaign, USA, AOCS,
1990. [AOCS Official method Cd 8-53].
ARAJO, J.M.A. Qumica de Alimentos: teoria e prtica. 3.ed. Viosa: UFV, 2006.
478p.
BRASIL. MINISTRIO DA SADE. AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA
SANITRIA. Mtodos fsico-qumicos para anlise de alimentos. Ministrio da Sade,
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Braslia: Ministrio da Sade, 2005. 1018p.
(Srie A. Normas e Manuais Tcnicos).

12. NDICE DE ACIDEZ DA FRAO LIPDICA

Segundo normas analticas do Instituto Adolfo Lutz (BRASIL, 2005)
Material:
Erlenmeyer de 125 mL;
Bureta de 25 mL;
Proveta de 50 mL;
Balana analtica.
Reagentes:
Soluo de ter etlico-lcool etlico (2+1);
Soluo de NaOH 0,1 N;
Indicador Fenolftalena a 1%.
Preparado do NaOH 0,1 N: descrita na metodologia de determinao de acidez.
Procedimento:
Pese 2 g da frao lipdica em frasco Erlenmeyer de 125 mL. Adicione 25 mL de
soluo de ter-lcool (2:1). Adicione duas gotas do indicador fenolftalena. Titule com
soluo de hidrxido de sdio 0,1 N M at o aparecimento da colorao rsea, a qual
dever persistir por 30 segundos.
Clculo:
% cido = (V x f x 100 x fator do cido)/P
V = volume de soluo padro de NaOH 0,1N gastos na titulao, em mL;
f = fator de correo da soluo de NaOH 0,1 N;
P = peso da amostra em g;
Nota - Para transformar a acidez em cido olico em acidez em soluo normal, divida o
resultado por 3,55.
Referncias:
BRASIL. MINISTRIO DA SADE. AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA
SANITRIA. Mtodos fsico-qumicos para anlise de alimentos. Ministrio da Sade,
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Braslia: Ministrio da Sade, 2005. 1018p.
(Srie A. Normas e Manuais Tcnicos).
CECCHI, H. M. Fundamentos tericos e prticos em anlise de alimentos. Campinas,
SP: Ed. UNICAMP.1999. 212p.

13. DETERMINAO DE VITAMINA E (TOCOFERIS TOTAIS)

A vitamina E essencialmente uma vitamina lipossolvel e age como
antioxidante na estabilizao de lipdios insaturados. Esta vitamina inclui oito
compostosque ocorrem naturalmente e esto distribudos em duas classes designadas
como tocoferis e tocotrienis com diferentes atividades biolgicas. O d--tocoferol
(5,7,8-trimetiltocol) apresenta a maior atividade biolgica e a forma mais disponvel
de vitamina E em alimentos. As melhores fontes de vitamina E so os leos de sementes
vegetais, tais como: soja, milho, girassol, nozes, gros integrais e o grmen de trigo.
Muitos alimentos so adicionados de vitamina E, por exemplo, margarinas, molhos para
salada, entre outros.
Nos alimentos naturais, este mtodo determina tocoferis totais e nos
enriquecidos, o -tocoferol. Baseia-se na reduo de ons ferro (III) e posterior quelao
do ferro (II) com --dipiridila para determinao de tocoferis e tocotrienis.
Alguns cuidados devem ser tomados nesta anlise, tais como: usar solventes
puros e sem contaminao com oxidantes e redutores, observar rigorosamente o tempo
de reao e evitar a exposio luz. Previamente reao colorimtrica, a amostra deve
ser saponificada para eliminar os lipdios presentes, liberar os tocoferis e hidrolisar os
steres de tocoferis.
Material
Espectrofotmetro UV/VIS ou colormetro (400 a 600 nm) e respectivos tubos,
cubetas de vidro (se usar espectrofotmetro), placa aquecedora com agitadores
magnticos, balana analtica, cronmetro, cilindro de nitrognio, balo de 250 mL com
boca esmerilhada adaptvel a um refrigerante de refluxo, condensador de refluxo, funis
de separao mbar de 250 e 500 mL, funis de vidro com 5 cm de dimetro, bales
volumtricos mbar de 25, 50 ou 100 mL, provetas de 50 mL, pipetas graduadas de 5 e
10 mL, pipetas volumtricas de 1, 2, 5 e 10 mL, bastes de vidro e papel de filtro
Whatman n 4.
Reagentes
lcool, isento de substncias oxidantes
ter de petrleo (30-60)C
Soluo alcolica de cloreto de ferro III a 0,25% m/v (recm-preparada)

 Soluo alcolica de --dipiridila a 0,6% m/v

Soluo de EDTA a 0,35% m/v
Soluo de fenolftalena
cido piroglico
Hidrxido de potssio em lentilhas
Sulfato de sdio anidro
dl--Tocoferol
lcool absoluto
Preparado dos reagentes:
Soluo-padro de dl--tocoferol Pese 100 mg de dl--tocoferol, transfira
quantitativamente para um balo volumtrico de 100 mL e complete o volume com
lcool absoluto. Retire uma alquota e dilua em lcool absoluto para se obter uma
concentrao de 80 g/mL. Conserve esta soluo sob refrigerao a 5C. Determine a
absorbncia a 292 nm (mxima absoro) e calcule a concentrao de vitamina E com a
frmula:
Vitamina E, em m/m = (0,01 x A)/(0,76 x P)
A = Absorbncia
P = massa em gramas da amostra em 100 mL de etanol
Soluo alcolica de cloreto de ferro III 0,25% m/v
Soluo alcolica de -dipiridila 0,6% m/v. Armazene esta soluo em frasco
mbar ou opaco, a 5C.
Procedimentos
Alimentos slidos, raes e premix devem ser homogeneizados e armazenados
em local com baixa umidade e sob a proteo da luz. A amostras lquidas devem ser
conservadas sob refrigerao temperatura menor que 8C, em frasco hermtico.
Antes de iniciar a anlise, deixe estabilizar temperatura ambiente. As gorduras
necessitam de aquecimento prvio e homogeneizao, antes da retirada da amostra para
anlise.
Saponificao da amostra Pese diretamente em um balo de 250 mL com boca
esmerilhada, uma quantidade de amostra que contenha de 1 a 10 mg de vitamina E.

Adicione 50 mL de lcool e 100 mg de cido piroglico. Aquea com refluxo em placa

aquecedora, sob agitao, por 20 minutos. Aps 1 minuto de aquecimento, adicione,
pelo do condensador, 1 g de pastilhas de hidrxido de potssio (uma pastilha por vez).
Depois de 20 minutos de refluxo, esfrie em banho de gelo e lave o aparelho de refluxo
com pequenas quantidades de gua. Transfira a amostra saponificada quantitativamente
para um funil de separao mbar de 250 mL e extraia a vitamina E com duas pores
consecutivas de 30 e 20 mL ou trs de 40, 30 e 20 mL. Transfira quantitativamente com
gua, os extratos etreos para um funil de separao de cor mbar de 500 mL. Lave os
extratos etreos com alquotas de 50 mL de gua, agitando suavemente, at que a fase
aquosa no apresente mais colorao rsea pela adio de algumas gotas de soluo
alcolica de fenolftalena. Filtre, em funil contendo sulfato de sdio anidro, para balo
volumtrico de 50 ou 100 mL e complete o volume com ter de petrleo. Evapore at a
secura, sob nitrognio, o solvente de um volume do extrato etreo que contenha entre 10
e 100 g de vitamina E. Dissolva o resduo em 7 mL de lcool, ao abrigo da luz.
Adicione 1 mL de --dipiridila e 1 mL de soluo de cloreto de ferro III.
Cronometre 2 minutos e 30 segundos e adicione 1 mL da soluo de EDTA. Espere
mais 2 minutos e 30 segundos e determine a absorbncia a 520 nm. Acerte previamente
o 100% de transmitncia do aparelho com um branco preparado com os referidos
reagentes e nas mesmas propores. Determine a quantidade de vitamina E
correspondente, usando a curva-padro.
Curva-padro Pipete, em tubos do colormetro, volumes da soluo-padro de
-tocoferol que contenham em cada tubo, aproximadamente de 20-100 g de
-tocoferol, em incrementos crescentes de 20 g. Adicione a cada tubo 1 mL da soluo
alcolica de -dipiridila e uma quantidade de lcool tal que atinja o volume total da
mistura de 7 mL. Proteja os tubos da luz e adicione em cada um deles 1 mL da soluo
de cloreto de ferro III. Espere 2 minutos e 30 segundos e leia a absorbncia no
colormetro ou no espectrofotmetro, utilizando o comprimento de onda 520 nm. Acerte
o 100% da transmitncia do aparelho com o branco.
Clculo
Determine a quantidade de vitamina E correspondente usando a curva-padro
estabelecida.
Referncias:

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz: v. 1,

Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlises de Alimentos. 3. ed. So Paulo: IMESP,
1985. p. 395-396.

14. PERDA POR DESSECAO (UMIDADE) SECAGEM DIRETA EM

ESTUFA A 105 C
Material
Estufa, balana analtica, dessecador com slica gel, cpsula de porcelana ou de
metal de 8,5 cm de dimetro, pina e esptula de metal.
Procedimento
Pese de 2 a 10 g da amostra em cpsula de porcelana ou de metal, previamente
tarada. Aquea durante 3 horas. Resfrie em dessecador at a temperatura ambiente.
Pese. Repita a operao de aquecimento e resfriamento at peso constante.
Clculo
% umidade = (100 x N)/P
N = n de gramas de umidade (perda de massa em g)
P = n de gramas da amostra
Referncia:
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1:
Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos, 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985.
p. 21-22.

15. RESDUO POR INCINERAO CINZAS

Material
Cpsula de porcelana ou platina de 50 mL, mufla, banho-maria, dessecador com
cloreto de clcio anidro ou slica gel, chapa eltrica, balana analtica, esptula e pina
de metal.
Procedimento
Pese 5 a 10 g da amostra em uma cpsula, previamente aquecida em mufla a
550C, resfriada em dessecador at a temperatura ambiente e pesada. Caso a amostra
seja lquida, evapore em banho-maria. Seque em chapa eltrica, carbonize em
temperatura baixa e incinere em mufla a 550C, at eliminao completa do carvo. Em
caso de borbulhamento, adicione inicialmente algumas gotas de leo vegetal para
auxiliar o processo de carbonizao. As cinzas devem ficar brancas ou ligeiramente
acinzentadas. Em caso contrrio, esfrie, adicione 0,5 mL de gua, seque e incinere
novamente. Resfrie em dessecador at a temperatura ambiente e pese. Repita as
operaes de aquecimento e resfriamento at peso constante.
Nota: podem ser utilizadas cpsulas de outros metais resistentes ao calor desde que as
cinzas obtidas no sejam empregadas para posterior anlise de metais.
Clculo
% cinzas = (100 x N)/ P
N = n de g de cinzas (perda de massa em g)
P = n de g da amostra
Referncias:
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1:
Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos, 3. ed. So Paulo: IMESP,
1985. p. 27-28.
ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of
analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 900.02).
Arlington: A.O.A.C., 1996 chapter 44. p. 3.

16. COR
Por Espectrofotometria Quantificao de pigmentos escuros
Cor Instrumental
Determinada pela mdia de leituras efetuadas em uma placa de petri, em
quantidade da amostra suficiente para cobrir a base da placa, atravs de colormetro
Konica Minolta spectrophotometer CM 3500d. Os resultados foram expressos de
acordo com as coordenadas CIE lab (Figura 6) que inclui as variveis L*, a*, b*,
Chroma (c*), ngulo Hue (h*). Onde L* uma medida da luminosidade de um objeto e
varia do 0 (para o preto) at o 100 (para o branco), a* uma medida do vermelho (a*
positivo) ou do verde (a* negativo); b* uma medida do amarelo (b* positivo) ou do
azul (b* negativo). A partir destas coordenadas, foram calculadas as coordenadas
cilndricas c* e h* (Equaes 1 e 2), onde c* define o a saturao e h* representa o
ngulo de tom.
c* = [(a*)2 + (b*)2]

Equao 1

h* = arctan (b*/a*)

Equao 2

Coordenadas do sistema CIE lab de cor (HunterLab, 1978).

HUNTERLAB. Color Measurement of Transluscent Materials. Hunter Associates

Laboratory, Incorporated 9529. Lee Highway, Fairtax Va. 22030, USA. 1978.

17. ANLISE DE COMPOSTOS FENLICOS TOTAIS

Mtodo Singleton et al., 1999:
Mtodo espectrofotomtrico de Folin-Ciocalteau descrito por Singleton et al.,
(1999), utilizando cido glico como padro. O reagente de Folin-Ciocalteau uma
soluo complexa de ons polimricos formados a partir de heteropolicidos
fosfomolibdicos e fosfotungsticos. Esse reagente oxida os fenolatos, reduzindo os
cidos a um complexo azul Mo-W. A leitura ser feita em espectrofotmetro a 740nm.
Os extratos obtidos sero diludos e, uma alquota de 0,5 mL da amostra diluda ser
transferida para um tubo e adicionado 2,5 mL do reagente Folin Ciocalteau, diludo em
gua 1:10. A mistura permanecer em repouso por 3 a 8 minutos. Em seguida ser
adicionado 2 mL de carbonato de sdio 4% e os tubos deixados em repouso por 2 horas,
ao abrigo da luz. A absorbncia ser medida em espectrofotmetro a 740 nm. Uma
amostra em branco ser conduzida nas mesmas condies e os resultados dos compostos
fenlicos totais sero expressos em equivalente de cido glico.
Preparo dos reagentes:
- Carbonato de sdio 4%
8g de Na2CO3 anidro em 200mL de gua destilada (pesar 8g de Na2CO3)
anidro em bquer, dissolver, transferir para balo volumtrico de 200mL e completar
com gua destilada)
- Folin Ciocauteau 1/10 ou 10%
20mL de Folin em 200mL de gua destilada (medir em proveta 10mL de Folin e
completar para 100mL com gua destilada)
Curva padro.
1- Preparo da soluo padro de cido Glico 500g/mL (soluo me): dissolver
50mg de cido glico em 10mL de EtOH 100%, completar a 100mL em gua destilada.
Fazer diluies em gua destilada a fim de obter solues de 5, 10, 20, 40, 50, 60, 80,
100g/mL para fazer a curva padro. Fazer em triplicatas.
Diluies para a curva:

 2,5g/0,5mL ou 5g/1mL= 10mL da soluo 50g/mL e completar para 100mL de

gua destilada.
5g/0,5mL ou 10g/1mL= 10mL da soluo 100g/mL e completar para 100mL de
gua destilada.
10g/0,5mL ou 20g/1mL= 20mL da soluo 100g/mL e completar para 100mL de
gua destilada.
20g/0,5mL ou 40g/1mL= 40mL da soluo 100g/mL e completar para 100mL de
gua destilada.
25g/0,5mL ou 50g/1mL= 10mL da soluo me e completar para 100mL de gua
destilada.
30g/0,5mL ou 60g/1mL= 60mL da soluo 100g/mL e completar para 100mL de
gua destilada.
40g/0,5mL ou 80g/1mL= 80mL da soluo 100g/mL e completar para 100mL de
gua destilada.
50g/0,5mL ou 100g/1mL= 20mL da soluo me para 100mL de gua destilada
(ou 50mL da soluo me e completar para 250mL de gua destilada).
Procedimento:
1- Pipetar 0,5 mL da amostra a ser analisada e/ou das solues para a curva, em tubo de
ensaio.
2- Acrescentar 2,5 mL da soluo de Folin- Ciocateau diludo em gua destilada a 1:10.
Agitar bem.
3- Deixar em repouso por 5 minutos.
4- Acrescentar 2,0 mL da soluo de Na2CO3 a 4%. Agitar bem.
5- Fazer um branco, usando 0,5 mL de gua destilada, Folin- Ciocateau e carbonato de
sdio.
6- Deixar em repouso por 2 horas, protegido da luz (em local escuro).
7- Fazer leituras em 740 nm, zerando com o branco.
8- Fazer grfico determinando a reta da equao, de maneira que o eixo x seja a
absorbncia e o eixo y seja a concentrao.

OBS: O Na2CO3 usado dever neutralizar o cido do Folin, a cor da reao se

desenvolve em meio alcalino, mas o carbonato no dever estar em excesso, pois
prejudica a reao.
Referncia:
SINGLETON, V. L.; ORTHOFER, R.; LAMUELA, R. M. Analysis of total phenols
and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteau
reagent. Methods of Enzymology, 299: 152178, 1999.
Mtodo Larrauri et al., 1997:
Reagentes:
cido glico 98% (Acros Organics, cdigo 410860050, ou equivalente)
Carbonato de Sdio Anidro P.A.
Reativo Folin Ciocalteau
lcool etlico P.A.
Acetona P.A.
gua destilada.
Equipamentos e vidrarias:
Balana analtica
Espectrofotmetro
Balo volumtrico de 50 mL, 100 mL, 500 mL e 1000 mL
Tubos de ensaio com tampa rosqueada
Cubetas
Pipeta automtica (10 2000 L)
Agitador de tubos de ensaio
Proveta de 50 mL.
Preparo de solues:
Soluo etanol 50%: Diluir 500 mL de lcool metlico para 1000 mL com gua
destilada em balo volumtrico, homogeneizar e transferir para um frasco de vidro
devidamente etiquetado. Armazenar em temperatura ambiente por tempo inderteminado.

Soluo acetona 70%: Diluir 700 mL de acetona de 1000 mL com gua destilada
em balo volumtrico, homogeneizar e transferir para um frasco de vidro devidamente
etiquetado. Armazenar em temperatura ambiente por tempo indeterminado.
Soluo de Folin Ciocalteau (1:3): Diluir 12,5 mL do reativo Folin Ciocalteau
(p/ fenol) para 37,5 mL de gua destilada, homogeneizar e transferir para um frasco de
vidro mbar devidamente etiquetado. Armazenar em temperatura ambiente por at um
ms.
Soluo de Carbonado de sdio anidro a 20%: Dissolver 20 g de carbonato de
sdio anidro (Na2CO3) para 100 mL de gua destilada, aquecer a 70-80 C e deixar
descansar durante 12 horas. Aps o tempo de descanso, filtrar e completar para 100 mL
com gua destilada em balo volumtrico, homogeneizar e transferir para um frasco de
plstico devidamente etiquetado. Armazenar em temperatura ambiente por tempo
indeterminado.
Soluo de cido glico: Dissolver 5 mg de cido glico (PM=170,12) em gua
destilada e completar para 100 mL em um balo volumtrico mbar e homogeneizar.
Preparar e usar apenas no dia da anlise.
Curva Padro do cido glico:
Concentrao (g)
0
10
20
30
40
50

cido glico (mL)

0
100
200
300
400
500

gua destilada (mL)

500
400
300
200
100
0

Aps pipetar o cido glico e a gua destilada, pipetar 0,5 mL do Folin Ciocalteau (1:3),
1 mL do carbonato de sdio 20% e 1 mL de gua destilada. Agitar os tubos e esperar no
mnimo 30 minutos para realizar a leitura. A leitura pode ser realizada at no mximo 4
horas aps agitar os tubos. As leituras devem ser realizadas em espectrofotmetro a 700
nm. O espectrofotmetro deve ser zerado com a soluo de concentrao 0. Toda a
anlise deve ser realizada na ausncia da luz.

Plotar em planilha as concentraes de cido glico (g) no eixo x versus as

respectivas absorbncias no eixo y e calcular a equao da reta.
Preparo dos extratos das frutas:
Pesar de 1 a 12,5 g da amostra, de acordo com a fruta (quanto maior o teor de
polifenis na fruta, menor ser a quantidade a ser pesada), em um bcker, adicionar 20
mL de etanol 50% homogeneizar com basto de vidro e deixar em repouso por 60
minutos temperatura ambiente. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos, filtrar o
sobrenadante 1 em um balo volumtrico de 50 mL. A partir do resduo da primeira
extrao, adicionar 20 mL de acetona 70%, homogeneizar e deixar em repouso por 60
minutos temperatura ambiente. Centrifugar novamente a 3000 rpm durante 15
minutos, filtrar o sobrenadante 2 no mesmo balo em que foi filtrado o sobrenadante 1,
completar o volume do balo com gua destilada.
OBSERVAO: TODO O PROCEDIMENTO DEVER SER REALIZADO AO
ABRIGO DA LUZ.
Determinao dos polifenis extraveis totais (PET) nas frutas:
Realizar o teste de alquota que ser utilizada na anlise. A Alquota pode variar
de poucos micro litros a no mximo 0,5 mL, dependendo da concentrao de polifenis
da fruta em anlise. A alquota a ser escolhida deve ter absorbncia entre o ponto
mnimo e o mximo da curva padro de cido glico, de preferncia a alquota utilizada
deve possuir absorbncia prxima ao valor mediano da curva.
Em tubos de ensaio, realizar no mnimo em duplicata, pipetar a alquota que ser
utilizada do extrato da fruta e completar o volume para 0,5 ml com gua destilada
(Exemplo: alquota de 0,03 mL + 0,47 mL de gua destilada), acrescentar (sempre nesta
ordem) 0,5 mL do folin ciocalteau (1:3), 1 mL de carbonato de sdio 20% e 1 mL de
gua destilada e homogeneizar em agitador de tubos. As leituras em espectrofotmetro a
700 nm, devem ser realizadas aos 30 minutos aps a adio dos reagentes e at no
mximo 4 horas depois.
Branco: 0,5 mL de gua destilada + 0,5 mL de folin ciocalteau (1:3) + 1 mL de
carbonato de sdio 20% e 1 mL de gua destilada, homogeneizar e esperar no mnomo
30 minutos para ler.
OBSERVAO: TODO O PROCEDIMENTO DEVER SER REALIZADO AO
ABRIGO DA LUZ.

Clculo:
A partir da absorbncia e utilizando a equao da reta obtida na curva padro do
cido glico, determinar a concentrao das amostras.
Resultado 1 = (peso x alquota de leitura)/volume do balo
Resultado 2 = Resultado 1 x 1000
mg de cido glico/100 g de fruta = (100 x concentrao)/Resultado 2
O resultado expresso em mg GAE/100 g ou g GAE/100 mg
Referncias:
LARRAURI, J. A. RUPREZ, P.; SAURA-CALIXTO, F. Effect of drying temperature
on the stability of polyphenols and antioxidant activity of red grape pomace peels. J.
Agric. Food Chem. v. 45, p. 209-215. 1997.

18. Metodologias de quantificao de antioxidantes

Determinao da Atividade Antioxidante Total em frutas pela captura do Radical
Livre ABTS.+
Material:
Agitador de tubos de ensaio
Balana analtica
Balo volumtrico de 10 mL, 50mL e 1.000 mL
Cronmetro digital
Cubetas (4 x 1 cm)
Espectrofotmetro
Pipeta automtica (2 L a 5.000 L)
Provetas
Tubos de ensaio
Reagentes:
ABTS (2,2 AZINO BIS (3-ethylbenzo thiazoline 6 sulfonic acid) diammoninum
salt (PM = 548,68) - Sigma, cdigo A1888 ou equivalente.
Persulfato de Potssio (PM = 270,3) Acros Organics, cdigo 202015000 ou
equivalente.
Trolox

(6-Hidroxi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-cido

carboxlico)

(PM

250,29) - Sigma, cdigo 218940050, ou equivalente.

cool etlico P.A.
Preparado das solues:
Soluo estoque de ABTS 7 mM: Dissolver 192 mg de ABTS em gua destilada
e completar o volume para 50 mL em um balo volumtrico com gua destilada,
homogeneizar e transferir para um frasco de vidro mbar, devidamente etiquetado.
Armazenar sob refrigerao por at um ms.
Soluo de persulfato de potssio 140 mM: Dissolver 378,4 mg de persulfato de
potssio em gua destilada e completar o volume para 10 mL em um balo volumtrico
com gua destilada, homogeneizar e transferir para um frasco de vidro mbar,
devidamente etiquetado. Armazenar em temperatura ambiente por at um ms.

Preparo do radical ABTS+: O radical ABTS+ preparado a partir da reao de 5

mL da soluo estoque de ABTS 7 mM com 88 L da soluo de persulfato de potssio.
Manter a mistura no escuro, temperatura ambiente, por 16 horas. Em seguida, diluir 1
mL desta mistura em lcool etlico at obter uma absorbncia de 0,70 nm 0,05 nm a
734 nm. Preparar e usar apenas no dia da anlise.
Soluo padro de trolox 2 mM: Dissolver 25 mg de trolox em lcool etlico e
completar o volume para 50 mL em um balo volumtrico com lcool etlico,
homogeneizar e transferir para um frasco de vidro mbar, devidamente etiquetado.
Preparar e usar apenas no dia da anlise.
Preparo da curva padro Trolox:
A partir da soluo padro de trolox (2 mM), preparar, em bales volumtricos
de 10 mL ou tubos de ensaio, solues variando a concentrao de 100 M a 1.500 M,
conforme a Tabela abaixo:
Concentrao (M)

Soluo padro de trolox

lcool Etlico (mL)

100
500
1000
1500
2000

(mL)
0,5
2,5
5,0
7,5
10

9,5
7,5
5,0
2,5
0

Em ambiente escuro, transferir uma alquota de 30 L de cada soluo de trolox

(100 M, 500 M, 1.000 M, 1.500 M e 2.000 M) para tubos de ensaio, misturar
com 3,0 mL da soluo do radical ABTS com absorbncia entre 0,700 a 0,705 (item
Preparo do radical ABTS+ ) e homogeneizar em agitador de tubos. Realizar a leitura
(734 nm) aps 6 minutos da mistura e utilizar lcool etlico como branco para calibrar o
espectrofotmetro.
Plotar as concentraes de trolox (M) no eixo X e as respectivas absorbncias
no eixo Y e calcular a equao da reta.
A partir da equao da reta, calcula-se a absorbncia referente a 1.000 M de
trolox:
Clculo 1:
y1 = a1x1 +b1
Onde:

y1 = 1000 M do trolox
y = absorbncia correspondente a 1000 M de trolox
.
Obteno dos extratos da fruta: utiliza o mesmo extrato dos polifenis. Olhar o item
preparo dos extratos da fruta do Mtodo Larrauri et al., 1997.
Exemplo de clculo das concentraes:
Pesou-se 10 g de fruta.
Concentrao em ppm = 10000 mg = 200000 ppm
0,05 mL
Utilizando as diluies:
Concentrao de 150000 ppm:
C1 x V1 = C2 x V2
200000 x V1 = 150000 x 10
V1 = 7,5 mL
Concentrao de 100000 ppm:
C1 x V1 = C2 x V2
200000 x V1 = 100000 x 10
V1 = 5 mL
Explicao prtica: O analista tem um extrato na concentrao de 200000 ppm e quer, a
partir deste extrato obter extratos de concentrao de 150000 ppm e de 100000 ppm.
Para o extrato de 150000 ppm ele vai ter que pegar 7,5 mL do extrato de 200000 ppm e
aferir para um balo volumtrico de 10 mL. J para a concentrao de 100000 ppm o
analista ir pegar 5 mL do extrato de concentrao de 200000 ppm e ir aferir com gua
para um balo volumtrico de 10 mL.
Utilizando as micro pipetas:
Concentrao de 150000 ppm:
C1 x V1 = C2 x V2
200000 x V1 = 150000 x 30
V1 = 22,5 L
Concentrao de 100000 ppm:
C1 x V1 = C2 x V2
200000 x V1 = 100000 x 30
V1 = 15 L
Explicao prtica: O analista tem um extrato na concentrao de 200000 ppm e quer, a
partir deste extrato obter extratos de concentrao de 150000 ppm e de 100000 ppm.

Para o extrato de 150000 ppm ele vai ter que pipetar no tubo de ensaio 22,5 L do
extrato de 200000 ppm e adicionar 7,5 L de gua. J para a concentrao de 100000
ppm o analista ir pegar 15 L do extrato de concentrao de 200000 ppm e ir
adicionar 15 L gua destilada.
Para esta anlise, necessrio utilizar no mnimo 3 concentraes diferentes. Estas
concentraes devero ter absorbncia baseada na curva padro, assim 1 concentrao
deve ter absorbncia no meio da curva padro, 1 concentrao deve estar abaixo deste
valor e a outra concentrao deve ter absorbncia acima deste valor. No geral 1
concentrao deve ter absorbncia prxima a 0,400, uma deve estar abaixo deste valor e
a outra deve estar acima de 0,400.
Leitura dos extratos:
Em ambiente escuro, transferir 30 L de cada concentrao para tubos de ensaio,
misturar com 3,0 mL da soluo do radical ABTS com absorbncia entre 0,700 a 0,705
(item Preparo do radical ABTS+ ) e homogeneizar em agitador de tubos. Realizar a
leitura (734 nm) aps 6 minutos da mistura e utilizar lcool etlico como branco para
calibrar o espectrofotmetro.
Clculos:
Calcular a equao da reta da concentrao x absorbncia.
y1 = a2x2 + b2
x2 = (y1 b2)/a2
Equivalente (g/L) = x2/1000
g trolox/ amndoa = 1000/ Equivalente
Exemplo prtico:
Curva Padro:
Concentrao Absorbncia
100
0,642
500
0,552
1000
0,427
1500
0,275
2000
0,153

Equao da curva padro:

y1 = -0,0003x1 + 0,6769
y1 = (-0,0003 x 1000) + 0,6769
y1 = 0,3769
Extrato da fruta:
Concentrao
200000
100000
50000
25000

Absorbncia
0,354
0,470
0,576
0,647

y1 = - 0,000002x1 + 0,6637
y1 = - 0,000002x2 + 0,6637
x2 = (0,3769 0,6637) / -0,000002

x2 = 143400

Equivalente (g/L) = 143400/1000 = 143,4 g/L

g trolox/ amndoa = 1000/ 143,4 = 6,97 g trolox/g fruta

Referncia:
RE, R.; PELLEGRINI, A. P.; PANNALA, A.; YANG, M.; RICE-EVANS, C.
Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay.
Free radic. biol. med., New York, v. 26, p. 1231-1237, 1999.
RUFINO, M. do S. M.; ALVES, R. E.; BRITO, E. S. de; MORAIS, S. M. de;
SAMPAIO, C. de G.; PREZ-JIMNEZ, J.; SAURA-CALIXTO, F. D. Metodologia
Cientfica: Determinao da atividade antioxidante total em frutas pela captura do
radical livre ABTS+. Comunicado Tcnico 128, EMBRAPA Agroindstria Tropical,
Fortaleza, CE, 2007.
Metodologia Cientfica: Determinao da Atividade Antioxidante Total em Frutas
pela Captura do Radical Livre DPPH
Equipamentos e vidrarias:
Agitador de tubos de ensaio
Balana analtica
Balo volumtrico
Cronmetro digital
Cubetas (4 x 1 cm)
Espectrofotmetro
Pipeta automtica (10- 5000 L)
Provetas
Tubos de ensaio com tampa rosqueada
Reagentes:
cool etlico P.A.
DPPH (2,2-Diphenyl-1-picryl-hidrazil) (PM = 394,3) - Sigma, cdigo
095K1452, ou equivalente
Preparado de solues:

Soluo controle de lcool etlico, acetona e gua. Em balo volumtrico de 100

mL, adicionar 40 mL da soluo de lcool etlico 50% e 40 mL da soluo de acetona
70%. Completar o volume para 100 mL com gua destilada, homogeneizar e transferir
para um frasco de vidro, devidamente etiquetado. Armazenar em temperatura ambiente
por tempo indeterminado.
Soluo de DPPH 0,06 mM: Dissolver 2,4 mg de DPPH em lcool etlico e
completar o volume para 100 mL em um balo volumtrico com lcool metlico,
homogeneizar e transferir para um frasco de vidro mbar, devidamente etiquetado.
Preparar e usar apenas no dia da anlise.
Curva do DPPH
Preparo das solues: A partir da soluo inicial de DPPH (0,06 mM), preparar
em bales volumtricos de 10 mL ou em tubos de ensaio, solues variando a
concentrao de 10 M a 50 M conforme a Tabela abaixo:
Concentrao (M)
0
10
20
30
40
50
60

Soluo de DPPH (mL)

0
1,7
3,3
5,0
6,7
8,3
10

lcool etlico (mL)

10
8,3
6,7
5,0
3,3
1,7
0

Em ambiente escuro, transferir uma alquota de, aproximadamente, 4 mL de

cada soluo de DPPH (10 M, 20 M, 30 M, 40 M, 50 M e 60 M) para cubetas
de e realizar a leitura em espectrofotmetro a 515 nm. Utilizar lcool etlico, como
branco, para calibrar o espectrofotmetro. Plotar as concentraes de DPPH (M) no
eixo X e as respectivas absorbncias no eixo Y e calcular a equao da reta (Eq. 1: y =
ax+b).
Obteno dos extratos da fruta: utiliza o mesmo extrato dos polifenis. Olhar o item
preparo dos extratos da fruta do Mtodo Larrauri et al., 1997.
Exemplo de clculo das concentraes:

Para o clculo das concentraes o procedimento semelhante ao descrito na

metodologia do ABTS+, a diferena nos clculos ocorre somente quando for utilizar a
micro pipeta.
Pesou-se 10 g de fruta.
Concentrao em ppm = 10000 mg = 200000 ppm
0,05 mL
Utilizando as micro pipetas:
Concentrao de 150000 ppm:
C1 x V1 = C2 x V2
200000 x V1 = 150000 x 100
V1 = 75 L
Concentrao de 100000 ppm:
C1 x V1 = C2 x V2
200000 x V1 = 100000 x 100
V1 = 50 L
Explicao prtica: O analista tem um extrato na concentrao de 200000 ppm e quer, a
partir deste extrato obter extratos de concentrao de 150000 ppm e de 100000 ppm.
Para o extrato de 150000 ppm ele vai ter que pipetar no tubo de ensaio 75 L do extrato
de 200000 ppm e adicionar 25 L de gua. J para a concentrao de 100000 ppm o
analista ir pegar 50 L do extrato de concentrao de 200000 ppm e ir adicionar 50
L gua destilada.
Determinao da atividade antioxidante total (AAT):
Cintica para determinao do tempo de leitura
A partir do extrato obtido no item obteno dos extratos da fruta, preparar em
tubos de ensaio no mnimo trs concentraes diferentes. Em ambiente escuro, transferir
uma alquota de 0,1 mL de cada diluio do extrato para tubos de ensaio e acrescentar
com 3,9 mL do radical DPPH (item soluo de DPPH 0,06 mM) e homogeneizar em
agitador de tubos. Utilizar 0,1 mL da soluo controle (item soluo controle de lcool
metlico, acetona e gua) com 3,9 mL do radical DPPH e homogeneizar. Utilizar lcool
etlico, como branco, para calibrar o espectrofotmetro. As leituras (515 nm) devem ser
monitoradas a cada minuto, onde observada a reduo da absorbncia at sua
estabilizao. A leitura da absorbncia final para o clculo do EC 50 s deve ser feita aps
a estabilizao da absorbncia (tempo EC50). Considera-se que a absorbncia est

estvel quando a diferena da absorbncia de duas leituras consecutivas no for maior

0,02. Para experimentos posteriores, com uma mesma fruta, a leitura pode ser feita
apenas no tempo estabelecido anteriormente (tempo EC50), acompanhado, tambm, da
leitura inicial do controle.
Leitura dos extratos
Aps determinar o tempo de leitura pipetar, em ambiente escuro, em tubos de
ensaio no mnimo trs concentraes diferentes um volume de 0,1 mL e acrescentar 3,9
mL do radical DPPH (item soluo de DPPH 0,06 mM) e homogeneizar em agitador de
tubos. Utilizar 0,1 mL da soluo controle (item soluo controle de lcool metlico,
acetona e gua) com 3,9 mL do radical DPPH e homogeneizar. Utilizar lcool etlico,
como branco, para calibrar o espectrofotmetro. A leitura (515 nm) deve ser realizada
no tempo onde ocorreu a estabilizao das absorbncias na cintica descrita no item
anterior.
Clculos tericos:
Aps a leitura, substituir (Eq. 1) o valor correspondente a metade da absorbncia
inicial do controle pelo y da equao da curva do DPPH para encontrar o consumo em
M DPPH e, em seguida, transformar para g DPPH.
Obs.: converter para g DPPH, atravs da transformao: g DPPH = (M DPPH /
1.000.000) * 394,3 (peso molecular do DPPH).
A partir das absorbncias obtidas das diferentes diluies dos extratos, plotar a
absorbncia no eixo Y e diluio (mg/L) no eixo X e determinar a equao da reta (Eq.
2). Para calcular a AAT deve-se substituir a absorbncia equivalente a 50 % da
concentrao do DPPH (item determinao da atividade antioxidante total ) pelo y (Eq.
2) e encontrar o resultado que corresponde amostra necessria para reduzir em 50% a
concentrao inicial do radical DPPH (EC50).
Clculo prtico:
Curva padro
Concentrao (mM)
0
10
20
30

Absorbncia
0
0,092
0,190
0,300

40
50
60

0,394
0,486
0,641

Leitura do controle = 0,640

Metade do controle = 0,320
Eq.1:
y1 = 0,0104x1 0,0119
y1 = (0,320 + 0,0119)/0,0104
y1 = 31,913
g DPPH = (y1/1000000) x 394,3 = 0,0126
Extrato da fruta:
Concentrao (ppm)
200000
100000
50000
25000

Absorbncia
0,379
0,466
0,505
0,539

Eq. 2:
y2 = -0,0000009x2 + 0,5556
x2 = (0,320 0,5556)/-0,0000009 = 261777,78 mg/L
g/L = x2/1000 = 261.778
g fruta/g DPPH = (g/L)/g DPPH = 261.778/0,0126 = 20776,032
Referncias
BLOIS, M. S. Antioxidant Determinations by the Use of a Stable Free Radical. Nature,
London, v. 118, p. 1199-1200, 1958.
BRAND-WILLIANS, W.; CUVELIER, M. E.; BERSET, C. Use of Free Radical
Method Evaluate Antioxidant Activity. Food Sci. Tech., London, v. 28, n. 1, p. 25-30,
1995.
RUFINO, M. do S. M.; ALVES, R. E.; BRITO, E. S. de; MORAIS, S. M. de;
SAMPAIO, C. de G.; PREZ-JIMNEZ, J.; SAURA-CALIXTO, F. D. Metodologia
Cientfica: Determinao da atividade antioxidante total em frutas pela captura do
radical livre DPPH. Comunicado Tcnico 127, EMBRAPA Agroindstria Tropical,
Fortaleza, CE, 2007.
Determinao da Atividade Antioxidante Total em Frutas no Sistema caroteno/cido Linolico
Equipamentos e Vidrarias
Agitador de tubos
Balana analtica
Balo volumtrico
Banho-maria
Becker
Cronmetro digital
Cubetas (4 x 1 cm)
Erlenmeyer 500 mL
Espectrofotmetro
Oxigenador

 Pipeta automtica (10 5.000 L)

Tubos de 2 mL
Tubos de ensaio com tampa rosqueada
Reagentes
-Caroteno - Merck, cdigo 01111324, ou equivalente.
cido linolico - Acros organics, cdigo 01111322, ou equivalente.
lcool etlico P.A.
Clorofrmio
Trolox (PM = 250,29) Sigma, cdigo 218940050, ou equivalente.
Tween 40
Preparo de solues
Soluo Controle de Trolox 200 mg/L: Dissolver 2 mg de Trolox em
aproximadamente 5 mL de lcool etlico e completar o volume para 10 mL em um balo
volumtrico com lcool etlico, homogeneizar e transferir para um frasco de vidro
mbar devidamente etiquetado. Preparar e usar apenas no dia da anlise.
Tratamento da gua Destilada: Submeter aproximadamente 700 mL de gua
destilada a borbulhamento com oxignio (oxigenador) por 30 minutos.
Soluo -Caroteno 20 mg/mL: Pesar 20 mg de -caroteno em um tubo de 2 mL,
protegido da luz com papel alumnio, adicionar 1 mL de clorofrmio, agitar e utilizar
imediatamente.
Soluo Sistema -caroteno/cido :Linolico Em um erlenmeyer, adicionar 80
L de cido linolico, 28 gotas de Tween 40, 100 L da soluo -caroteno e, para
solubilizar, adicionar 2 mL de clorofrmio, homogeneizar e, posteriormente, evaporar,
em capela qumica, o clorofrmio com o auxlio do oxigenador e do exaustor da capela.
Em seguida, adicionar a gua tratada com oxignio at obter uma absorbncia entre 0,6
nm e 0,7 nm a 470 nm. A soluo sistema deve ser sempre protegida da luz e
prontamente utilizada.
Obteno dos extratos da fruta: utiliza o mesmo extrato dos polifenis. Olhar o item
preparo dos extratos da fruta do Mtodo Larrauri et al., 1997.
Exemplo de clculo das concentraes:

Para o clculo das concentraes o procedimento semelhante ao descrito na

metodologia do ABTS+, a diferena nos clculos ocorre somente quando for utilizar a
micro pipeta.
Pesou-se 10 g de fruta.
Concentrao em ppm = 10000 mg = 200000 ppm
0,05 mL
Utilizando as micro pipetas:
Concentrao de 150000 ppm:
C1 x V1 = C2 x V2
200000 x V1 = 150000 x 400
V1 = 300 L
Concentrao de 100000 ppm:
C1 x V1 = C2 x V2
200000 x V1 = 100000 x 400
V1 = 200 L
Explicao prtica: O analista tem um extrato na concentrao de 200000 ppm e quer, a
partir deste extrato obter extratos de concentrao de 150000 ppm e de 100000 ppm.
Para o extrato de 150000 ppm ele vai ter que pipetar no tubo de ensaio 300 L do
extrato de 200000 ppm e adicionar 100 L de gua. J para a concentrao de 100000
ppm o analista ir pegar 200 L do extrato de concentrao de 200000 ppm e ir
adicionar 200 L gua destilada.
Determinao da atividade antioxidante total (AAT):
A partir do extrato obtido no item obteno dos extratos da fruta, preparar em
tubos de ensaio, no mnimo trs diluies diferentes. Misturar 0,4 mL de cada diluio
do extrato com 5 mL da soluo sistema (item soluo sistema -caroteno/cido
linolico). Utilizar como controle 0,4 mL da soluo de trolox (item soluo controle de
trolox 200 mg/L) com 5 mL da soluo sistema -caroteno/cido linolico,
homogeneizar os tubos de ensaio em agitador e manter em banho-maria a 40 C.
Realizar a primeira leitura (470 nm) aps 2 minutos de efetuada a mistura e depois em
intervalos de quinze minutos at 120 minutos. O espectrofotmetro deve ser calibrado
com gua oxigenada.
Clculos tericos:

 % Oxidao: [(Reduo Abs)amostra x 100]/(Reduo Abs)sistema

% Proteo: 100 (% Oxidao)
% Inibio da oxidao (% I.O.): o percentual de proteo do extrato de
fenlicos da amostra no sistema de co-oxidao de substratos calculada em relao ao
decaimento da absorbncia do sistema controle. Utiliza-se as seguintes equaes:
% I. O.= [(Ac Aam)/Ac] x100
Onde: Ac = Abs(inicial) Abs(final)
Aam = Abs(inicial) Abs(final)
Onde: c = controle (sistema) e am = amostra
Atividade antioxidante (AA): tambm calculada como percentagem de
inibio relativa ao controle em diferentes tempos (t = 30 min., t = 60 min. e t = 120
min.). Para este clculo usam-se as seguintes equaes (AL-SAIKHAN et al.,1995):
AA = [(TDC TDA)/TDC] x 100
Frmulas:
Taxa de degradao do controle (TDC) = Ln (Absinicial/Abst) x 1/t
Taxa de degradao da amostra (TDA) = Ln (Absinicial/Abst) x 1/t
Coeficiente de atividade antioxidante (CAA): calculado atravs da absorbncia
dos extratos em relao ao controle. calculado usando a seguinte frmula (MALLETT
et al., 1994):
CAA = [(Absam(120) - Absc(120))/(Absc(0) Absc(120))] x 100
Razo da taxa de degradao (RTD): baseado na relao da taxa de oxidao
em diferentes tempos (t = 30, t = 60 e t = 120), calculado segundo Marinova et al.,
(1994) usando a seguinte equao:

RTD = TDA/TDC
AOX (A/h): o valor antioxidante, sendo expresso atravs do valor absoluto
da inclinao da reta, obtida atravs da curva cintica plotada a partir da absorbncia x
tempo (t = 0,75h, t = 1h e t = 2h).
Referncias
AL-SAIKHAN, M. S.; HOWARD, L. R.; MILLER, J. C., JR. Antioxidant activity and
total phenolics in different genotypes of potato (Solanum tuberosum, L.). J. Food Sci.,
Chicago, v. 60, n. 2, p. 341-343, 1995.
MALLETT, J. F.; CERRATI, C.; UCCIANI, E.; GAMISANA, J.; GRUBER, M.
Antioxidant activity of plant leaves in relation to their R-tocopherol content. Food
Chem., Oxford, v. 49, p. 61-65, 1994.
MARCO, G. A rapid method for evaluation of antioxidantes. J. Am. Oil Chem. Soc.,
Champaign, v.45, p.594-598, 1968.
MARINOVA, E. M.; YANISHLIEVA, N.; KOSTOVA, I. N. Antioxidative action of the
ethanolic extract and some hydroxycoumarins of Fraxinus ornus bark. Food Chem.,
Oxford, v. 51, p. 125-132, 1994.
MILLER, H. E. A simplified method for the evaluation of antioxdante. J. Am. Oil
Chem. Soc., Champaign, v. 48, p. 91, 1971.
RUFINO, M. do S. M.; ALVES, R. E.; BRITO, E. S. de; MORAIS, S. M. de;
SAMPAIO, C. de G.; PREZ-JIMNEZ, J.; SAURA-CALIXTO, F. D. Metodologia
Cientfica: Determinao da atividade antioxidante total em frutas no sistema caroteno/cido linolico. Comunicado Tcnico 126, EMBRAPA Agroindstria
Tropical, Fortaleza, CE, 2006.