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DETERMINAO DE PROTENAS TOTAIS PELO MTODO DE LOWRY (1951)

a) Objetivo: Determinar a concentrao de protenas totais.

b) Solues utilizadas:

- Soluo A: Soluo de Na2CO3 2% em soluo de NaOH 0,1M.


Para 1000 mL de soluo, dissolver 4,0 g de hidrxido de sdio (NaOH) em 500 mL de gua
destilada, em seguida adicionar 20,0 g de carbonato de sdio (Na 2CO3), homogeneizar at
dissolver, em balo volumtrico de 1000 mL, homogeneizar e armazenar a soluo.

- Soluo B: Soluo de Tartarato de Sdio e Potssio 2%.


Para 100 mL de soluo, dissolver 2,0 g de Tartarato de Sdio e Potssio (KNaC 4H4O6), em
balo volumtrico de 100 mL, homogeneizar e armazenar a soluo.

- Soluo C: Soluo de Sulfato de cobre 1%.


Para 100 mL de soluo, dissolver 1,0 g de Sulfato de cobre (CuSO 4), em balo volumtrico de
100 mL, homogeneizar e armazenar a soluo.

- Soluo D: Soluo de reao.


Adicionar a 100 mL da Soluo A 1,0 mL da soluo B e 1,0 mL da soluo C, homogeneizar e
utilizar. Esta soluo no pode ser armazenada, deve ser preparada no dia da determinao de
protenas apenas o suficiente para a utilizao.

- Reagente de Folin-Ciocalteau diludo 1:2 (1 reagente : 2 gua destilada).

c) Metodologia:

1. Diluir a amostra adicionando em um tubo de ensaio 200 L de gua destilada e 200 L da


amostra. A diluio pode ser modificada de acordo com a amostra.
2. Homogeneizar.
3. Adicionar 2,0 ml da soluo B, homogeneizar e deixar reagir durante 15 minutos a
temperatura ambiente.
4. Adicionar 200 L do reagente de Folin diludo 1:2, aguardar 30 minutos, no escuro e a
temperatura ambiente. Observao: o reagente de Folin fotosensvel.
5. Ler em espectrofotmetro no comprimento de onda de 750 nm. Observao: se necessrio
diluir a amostra na leitura para a absorbncia no passar de 0,900.
6. Antes da leitura, zerar o espectrofotmetro com o BRANCO, o qual feito seguindo-se o
procedimento descrito acima, mas no item 1 adicionar 400 L de gua destilada.

d) Curva-padro de Albumina

A curva padro ou curva de calibrao feita para mensurar ou quantificar a concentrao


de protenas das amostras desconhecidas. Para fazer a curva padro so utilizadas concentraes
conhecidas de albumina de soro bovino (BSA), as quais so plotadas com os valores de
absorbncia obtidos aps a reao com um reagente colorimtrico. Neste caso, o reagente
utilizado o Folin-Ciocalteau, o qual sofre uma reduo quando reage com protenas, na
presena do catalisador cobre (II), e produz um composto com absoro mxima em 750 nm.
A curva padro de albumina constituda a partir da soluo padro de albumina se soro
bovino (BSA) mg/mL, onde para 10 mL de soluo padro, diluir 0,01 mg de BSA em 5 mL de
1
gua destilada, completar volume em balo volumtrico de 10 mL, homogeneizar e armazenar
refrigerado at o momento do uso, preparar esta soluo no dia da elaborao da curva padro.

1000 mg1 g
10 mg x
x=0,01 g de BSA

Atravs da soluo padro de BSA (MG/mL) se realiza a seguinte diluio:

Concentrao de Volume de Volume da soluo


Volume final
Tubos Albumina gua destilada padro de albumina
(L)
(mg/mL) (L) mg/mL (L)
1 (branco) 0 2000 0 2000
2 0,01 1960 40 2000
3 0,04 1920 80 2000
4 0,06 1880 120 2000
5 0,08 1840 160 2000
6 0,1 1800 200 2000
7 0,3 1400 600 2000
8 0,5 1000 1000 2000
9 0,7 600 1400 2000
10 0,9 200 1800 2000
11 1,0 0 2000 2000
Total - - 7400 -

Tabela 1: Diluio da soluo padro de albumina.

Em seguida seguir a metodologia descrita acima, transferir 400 L das diluies realizadas
para tubos de ensaio (em triplicata), adicionar 2,0 mL da soluo de reao em cada tubo, deixar
reagir durante 15 minutos a temperatura ambiente, aps esse perodo adicionar 200 L do
reagente de Folin diludo (1:2), deixar reagir por 30 minutos no escuro e a temperatura ambiente.
Ler a absorbncia no comprimento de onda a 750 nm, zerando o aparelho com o branco.
Utilizando o programa Excel, plotar em planilha as absorbncias no eixo Y e os valores da
concentrao de albumina (mg/mL) no eixo X, gerando um grfico de disperso (completar a
tabela a seguir). Para adicionar no grfico a reta, seleciona um dos pontos da reta, clica com o
boto direito do mouse, seleciona Adicionar linha de tendncia, em seguida seleciona as
opes Exibir a equao no grfico, Exibir valor de R quadrado no grfico e opo de linha
de tendncia linear. Utiliza-se a equao da reta para calcular a concentrao de protenas totais,
onde x equivale a concentrao de protenas em mg/mL e y a absorbncia.

2
Concentrao de Absorbncias
Pontos
albumina (mg/mL) (750 nm)
1 0
2 0,01
3 0,04
4 0,06
5 0,08
6 0,1
7 0,3
8 0,5
9 0,7
10 0,9
11 1,0

Tabela 2: Exemplo.

Curva padro de Albumina


1.000
0.800 f(x) = 0.89x + 0.06
0.600 R = 0.99
Absorbncia a 750 nm 0.400

0.200
0.000
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
Concentrao de albumina (mg/mL)

Figura 1: Modelo de grfico de curva padro de Albumina.