ESPECTROFOTOMETRIA

 Parte

1 ± espectro de absorção  Parte 2 - Curva de calibração Dosagem de amostra

Aplicações da fotometria (Exemplo prático) Dosagem de Proteina
A principal finalidade de uma medida espectrofotométrica, nas regiões do ultravioleta e visível, é avaliar quantidades. Assim, é extremamente importante efetuar uma rigorosa calibração visando obter resultados exatos. Para obter-se uma curva de calibração alguns aspectos devem ser

considerados como: 1. 2. 3. A escolha de uma solução padrão ( Ex:proteina-Albumina) O estabelecimento de um branco adequado A seleção da área espectral.(realizado em aula anterior)

Espectro de absorção do permanganato de potássio A amostra (1) tem 66 mg/L de concentração. As demais (2),(3),(4) e (5) foram diluídas para (0,8), (0,6), (0,4) e (0,2) da concentração da primeira amostra, respectivamente.

Absorbância (P fixo)

Absortividade (constante para um P fixo)

Lei de Lambert e Beer

AP =

P

· c · l

Concentração da solução que absorve a luz

Distância percorrida pela luz através da amostra

Solução padrão
Constitui parte integrante da análise quantitativa no laboratório e usada na dosagem de amostra desconhecida. Uma solução padrão apresenta concentração exata de uma substância conhecida, que servirá como referência na determinação fotométrica de concentrações desconhecidas desta mesma substância. Uma solução padrão tem grande importância no preparo da curva de calibração. Exemplo: uma solução padrão de albumina 10 mg/ml Isto significa que foram pesados 10 mg de albumina que a seguir foram dissolvidas em 1 ml de água ou outro solvente. Evidentemente, a pessoa responsável ( aqui é o Armando! ) preparou uma quantidade maior de solução padrão...

Preparo de uma curva padrão (ou calibração)
O preparo da curva de calibração é de grande importância e deve ser bem entendido. Todo analista deve ser capaz de preparar suas próprias curvas de calibração e interpretar os resultados obtidos. Para se obter o valor da concentração de substâncias cuja concentração se

desconhece, é necessário estabelecer uma relação entre a absorbância desta solução em diferentes concentrações com as suas concentrações. Isto se chama curva de calibração (curva padrão).

BR 1.

2

4

6

8

10mg/ml

Preparar uma série de padrões exatos, cobrindo a faixa de trabalho usada ou indicada. Usar o padrão recomendado para o método a ser calibrado.

2. Dosar todos os padrões de acordo com a técnica recomendada. Efetuar as leituras colorimétricas, usando o branco apropriado para acertar o zero-A, além do comprimento de onda recomendado pela literatura ou obtido pela curva de absorção espectral previamente realizada. 3. Obter os valores de Absorbância. 4. Plotar os resultados em papel milimetrado, relacionando Absorbância (ordenada) com as concentrações dos padrões (abcissa). Examinar bem os pontos e decidir se eles serão cobertos por uma linha reta. Se os pontos aparentemente seguirem uma linha reta, traçar uma curva de modo que mais se aproxime de todos os pontos obtidos. A curva não deve ser traçada de ponto a ponto, mas interpolando através dos pontos. 5. Examinar a curva traçada, avaliando se ela tem sensibilidade correta

Uma boa curva padrão
A curva padrão ideal deve ter ângulo aproximado de 45°

A

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 8

C
10 mg/ml

Na prática, como será a performance de vocês?
Curva padrão de Albumina
Tubo Conc. (mg/ml) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 --------1,0 Albumina 10 mg/ml (ml) Água (ml) Biureto (ml) A

1 2 3 4 5 BR

4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 -----

Temos que preparar as diluições do padrão 10 mg/ml tendo como volume final 1,0 ml.

Albumina 10 mg/ml

Exemplo: Tubo 1 ( 2,0 mg/ml ) Recorremos a regra geral da diluição: Ci · Vi = Cf · Vf onde: Ci = concentração inicial (10 mg/ml) Vi = volume a ser retirado do padrão (?) Cf = concentração final (2mg/ml) Vf = volume final (1,0 ml)

Albumina 2 mg/ml

Ci · Vi = Cf · Vf 10 mg/ml · Vi (?) = 2 mg/ml · 1,0 mg/ml Vi = 0,2 ml

Vi = 0,2 ml do padrão + 0,8 ml de água 1,0 ml (2 mg/ml)

Preenchendo a tabela para obter a curva...
Tubo Conc. Albumina (mg/ml) 10 mg/ml (ml) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 ----Água (ml) Biureto (ml) A

1 2 3 4 5 BR

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-----

0,8 0,6 0,4 0,2 --1,0

4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 -----

Deixar os tubos em repouso por 10 minutos. Ler as absorbâncias de todos os tubos contra o Branco no P adequado. Traçar o gráfico e analisar.

Dosagem de proteínas totais de uma amostra
1,0 ml da amostra 4,0 ml do reagente de biureto Esperar 10 minutos Ler contra o Branco

Amostra Conc. ?

Determinar a concentração de proteínas totais na amostra recorrendo à curva padrão

A

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 8

C
10 mg/ml

O uso de Fator de Calibração (FC)
È um artifício usado rotineiramente e seu cálculo é feito como: concentração padrão FC = €€€€€€€€€€€ absorbância padrão

2. Obtendo o Fator de Calibração pela própria curva padrão
A
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4

Y2
cateto oposto (sen E)

FC = cotag E Portanto: FC = 1 / tg E Como: tg E = sen E / cos E C X1
6 8

Y1

E
cateto adjacente (cos E)

X2 10

mg/ml

Então: FC = cos E / sen E X2 - X1 €€€€€€ Y2 - Y1

De onde se conclui que: cateto adjacente FC = €€€€€€€€€ cateto oposto

=

Finalmente, para calcular a concentração da amostra: [amostra] = Absorbância da amostra · FC

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