Natalia Lyrio Dissertacao

Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Química
Programa de Pós-graduação em Ciência de
Alimentos
NATÁLIA NEY LYRIO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E DO PODER

SURFACTANTE DAS SAPONINAS DO JUÁ (Ziziphus joazeiro)
MODIFICADAS ENZIMATICAMENTE
Rio de Janeiro
2016
Natália Ney Lyrio

Dissertação de mestrado
apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciência de
Alimentos, do Instituto de Química
da Universidade Federal do Rio de
Janeiro objetivando a obtenção do
título de Mestre em Ciências.
Orientadora: Profa. Maria Alice Zarur Coelho, D.Sc.
Co-orientador: Prof. Bernardo Dias Ribeiro, D.Sc.
Rio de Janeiro
2016
Lyrio, Natália Ney.
Avaliação da atividade antimicrobiana e do poder surfactante das

saponinas do juá (Ziziphus joazeiro) modificadas enzimaticamente – Rio de
Janeiro: UFRJ, 2016.
65 f.
Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade Federal do Rio de

Janeiro, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Ciência de
Alimentos, 2016.
Orientadores: Maria Alice Zarur Coelho e Bernardo Dias Ribeiro.
1. saponinas. 2. juá. 3. enzimas. 4.antimicrobiano. 5. surfactante. I. Coelho, Maria

Alice Zarur. (orient). II. Ribeiro, Bernardo Dias. (orient). III. Universidade Federal do Rio
de Janeiro. Programa de Pós Graduação em Química. IV. Título.
Natália Ney Lyrio

Dissertação de mestrado
apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciência de
Alimentos, do Instituto de Química
da Universidade Federal do Rio de
Janeiro objetivando a obtenção do
título de Mestre em Ciências.
Aprovada em
_____________________________________________________
Orientadora: Maria Alice Zarur Coelho, D.Sc. (EQ/UFRJ)
_____________________________________________________
Orientador: Bernardo Dias Ribeiro, D.Sc. (EQ/UFRJ)
_____________________________________________________
Alexandre Guedes Torres, D.Sc. (IQ/UFRJ)
_____________________________________________________
Gizele Cardoso Fontes Sant’Ana, D.Sc. (IQ/UERJ)
Rio de Janeiro
2016
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por me presentear com tamanho desafio e por ser tão generoso
em permitir que eu pudesse contar com a ajuda de tantas pessoas especiais. Agradeço à
minha linda família, em especial aos meus pais, Rodolpho e Arina, que sempre me
deram toda a estrutura para que eu pudesse alcançar os meus objetivos e o fizeram com
o amor mais lindo que eu poderia receber nesse mundo. Obrigada por cuidarem de mim,
por me entenderem e por serem a minha melhor companhia. Obrigada aos meus irmãos
e cunhada, Daniel, Felipe e Flávia, por serem, além de tudo, verdadeiros amigos, que eu
tanto amo.
Agradeço aos meus amigos, que entenderam minhas ausências, minhas recusas
de convites, meus adiamentos de encontros e meu humor, muitas vezes diferente do
normal. Todos vocês foram importantes na minha jornada, ouvindo minhas dificuldades
e ansiando, tanto quanto eu pelas minhas vitórias.
Às amigas de toda minha vida acadêmica, Ana Paula, Gabriela, Thaís e Marcela,
com quem sei que posso contar, para o que for, meu muito obrigada por fazerem parte,
tão de perto, da minha história e pelo suporte de sempre. Gostaria de agradecer,
também, àquelas do meu convívio diário, pessoas que conheci há pouco tempo, mas que
já levo no coração, pela forma carinhosa como me tratam, por terem se preocupado,
acompanhado de perto todo meu esforço e por me darem o amparo que eu precisei:
Juliana, Sandra, Helayne e Gabi.
Agradeço, de todo o coração, ao Renato, um grande companheiro, que se privou
junto comigo de muitos finais de semana ensolarados e me proporcionou um ambiente
propício ao estudo e à concentração, fundamental ao longo desse trabalho. Agradeço ao
Rodrigo e ao Diego, que se dispuseram a tirar minhas dúvidas. E ao amigo Vinicius, por
ter sido o porta-voz da esperança, quando eu achei que não teria forças para continuar.
O seu recado ficou marcado em mim durante todo esse tempo.
Gostaria de agradecer especialmente àquela que esteve ao meu lado, desde o
início de tudo, aquela que aprendeu junto comigo dos princípios mais básicos da
química até a defesa do mestrado. Marselle, você e Rafael fazem jus ao significado da
palavra amizade e contribuíram de sobremaneira para a realização deste trabalho. Vocês
não fazem ideia do quanto foi importante tê-los por perto nos momentos em que mais
precisei.
Agradeço profundamente aos meus orientadores, professores Maria Alice e
Bernardo Dias, pela paciência, confiança e por todo o conhecimento passado através
dessa bela profissão que escolheram. Entre tantas outras coisas, agradeço ao Prof.
Bernardo pelas portas sempre abertas, e à Prof. Maria Alice por sua força, que nos traz
confiança e conforto.
Agradeço a todos os membros do Grupo Biose, companheiros de laboratório,
especialmente à doutoranda e amiga Ariane Gaspar, que me orientou durante todo o
trabalho e com quem tive oportunidade de aprender tanto. E ao amigo Felipe Vale, que
tanto contribuiu com suas boas ideias e ajudas.
Agradeço ao programa e aos professores do PPGCAL, em especial os
Professores Alexandre Torres e Daniel Perrone, que me abriram as portas do seu
laboratório, ao seu aluno e hoje meu amigo Fabrício Silva, que se dispôs a me ajudar a
operar o rotaevaporador, e a todos eles por compartilharem seus conhecimentos na área
de cromatografia.
Agradeço, finalmente, à CAPES pelo incentivo financeiro concedido através de
bolsa de estudos, à Fiocruz, pelo fornecimento dos micro-organismos, e ao
CENPES/Petrobras, pela análise das amostras por cromatografia.
“Nossa maior fraqueza está em
desistir. O caminho mais certo de
vencer é tentar mais uma vez.”
Thomas Edison
RESUMO
LYRIO, Natália Ney. Avaliação da atividade antimicrobiana e do poder

surfactante das saponinas do juá (Ziziphus joazeiro) modificadas
enzimaticamente. Rio de Janeiro, 2016. Dissertação (Mestrado em Ciência de
Alimentos) – Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio
de Janeiro, 2016.
Saponinas são glicosídeos encontrados, principamente, em vegetais
superiores, mas também em alguns animais marinhos invertebrados. Possuem
um esqueleto triterpênico ou esteroidal ligado a cadeias de açúcares através de
uma ou mais ligações glicosídicas. A estrutura das saponinas apresenta
característica anfifílica, o que faz com que essas substâncias apresentem
propriedades surfactantes. Neste trabalho, investigaram-se as saponinas
triterpênicas do juá (Ziziphus joazeiro), avaliando-se não só seu poder
tensoativo, através da determinação da sua concentração micelar crítica (CMC)
e do seu índice de emulsificação 24 horas (IE 24), como também sua atividade
antimicrobiana, pela determinação da concentração inibitória mínima (MIC)
contra Salmonella choleraesuis (ATCC 10708), Escherichia coli (ATCC 8739),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Staphylococcus aureus (ATCC 6538),
Bacillus subtilis (ATCC 6633) e Candida albicans (ATCC 10231).
Posteriormente, as saponinas do juá foram submetidas a reações de hidrólise
enzimática por três enzimas comerciais: Viscozyme L (celulases e
hemicelulases), Ultrazym AFPL (pectinases) e Celluclast 1.5L (celulases). As
condições reacionais utilizadas foram pH 5, temperatura 50ºC, rotação 200
rpm, concentração de saponina igual a 1%, enzima 5% (v/v) e tempo reacional
mínimo de 24 horas. Os produtos das reações foram caracterizados por HPLC-
MS e avaliados quanto às propriedades surfactantes e antimicrobiana. A
Celluclast foi a enzima que mais produziu compostos hidrolizados. Não houve
alteração das propriedades surfactantes após a modificação enzimática das
saponinas. As saponinas originais do juá apresentaram atividade contra C.
albicans em concentrações entre 2,5 e 0,313 mg/mL, mas não apresentaram
atividade contra nenhuma das bactérias testadas. As saponinas modificadas
não apresentaram atividade contra nenhum dos micro-organismos testados.
Observou-se uma relação entre a MIC e a CMC, indicando que o poder
antimicrobiano de compostos surfactantes depende de como as moléculas se
encontram em solução: na forma livre ou em micelas.
Palavras-chave: Saponinas, juá, hidrólise, enzimas, surfactantes,

antimicrobiano.
ABSTRACT
LYRIO, Natália Ney. Antimicrobial and surfactant activities of jua (Ziziphus

joazeiro) enzymatically modified saponins. Rio de Janeiro, 2016.
Dissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos) – Instituto de Química,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2016.
Saponins are glycosides mainly found in many higher plants but also in some
marine invertebrates. They have a triterpenic or steroid skeleton linked to one or
more sugar chains by glycosidic linkages. The structure of saponins has
amphiphilic character, which makes these substances exhibit surfactant
properties. In this work, we investigated the triterpenic juá saponins (Ziziphus
joazeiro), evaluating not only their surfactant power, by determining the critical
micellar concentration (CMC) and its 24 hours emulsification index (IE24), as
well its antimicrobial activity, by determining the minimum inhibitory
concentration (MIC) against Salmonella choleraesuis (ATCC 10708),
Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027),
Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Bacillus subtilis (ATCC 6633) and
Candida albicans (ATCC 10231). Subsequently, the juá saponins were
subjected to enzymatic hydrolysis reactions of three commercial enzyme:
Viscozyme L (cellulases and hemicellulases) Ultrazym AFPL (pectinase) and
Celluclast 1.5L (cellulases). The reactions were conducted in pH 5, temperature
50 ° C, 200 rpm, saponin concentration of 1% enzyme 5% (v / v) and minimal
reaction time of 24 hours. The products of the reactions were characterized by
HPLC-MS and evaluated for surfactants and antimicrobial properties. Celluclast
enzyme produced more hydrolyzed compounds. There was no change in the
surfactant properties after enzymatic modification of saponins. The original juá
saponins showed activity against C. albicans at concentrations between 2.5 and
0.313 mg / ml, but showed no activity against any of the bacteria tested. The
modified saponins showed no activity against any of the tested microorganisms.
It was observed a relationship between MIC and CMC, indicating that the anti-
microbial power of surfactant compounds depends on how the molecules are in
solution: in free form or in micelles
Keywords: Saponins, jua, hydrolysis, enzymes, surfactants, antimicrobial.

Lista de Tabelas
Tabela 1. Concentração final (em µmols equivalentes em glicose/mL) de

açúcares redutores no meio após hidrólise enzimática.....................................44
Lista de Ilustrações
Figura 1. Disposição preferencial dos surfactantes nas interfaces ................................. 19

Figura 2. Influência da formação de micelas nas propriedades físicas das soluções de
surfactantes .......................................................................................................................... 21
Figura 3. Esqueletos representativos de saponinas triterpênicas (ácido oleanólico) e
esteroidais (diosgenina). ..................................................................................................... 23
Figura 4. Saponinas esteroidais com esqueletos do tipo furostano e espirostano (R=
açúcares). ............................................................................................................................. 24
Figura 5. Estruturas dos 10 tipos de esqueletos triterpênicos das saponinas. .............. 24
Figura 6. Estruturas das saponinas isoladas da banana-de-papagaio. .......................... 27
Figura 7. Saponinas encontradas no juá. .......................................................................... 30
Figura 8. Fluxograma do método de extração das saponinas. ........................................ 36
Figura 9. Esquema ilustrativo do método de microdluição para determinação da MIC.40
Figura 10. Curva-padrão de calibração do método DNS. ................................................ 42
Figura 11. Cromatograma das amostras de saponinas a 203 nm................................... 45
Figura 12. Cromatograma em escala aumentada, do tempo 30 a 48 minutos. ............. 46
Figura 13. Espectro de massa do pico de tr=17,117 no modo negativo. ........................ 47
Figura 14. Espectro de massas do pico de tr=20,496 no modo negativo. ...................... 48
Figura 17. Espectro de massas do pico de tr=30,5 minutos no modo positivo. ............. 50
Figura 18. Espectro de massas do pico de tr=33,5 minutos no modo positivo. ............. 50
Figura 19. Determinação da CMC pelo método turbidimétrico para a saponina não-
modificada............................................................................................................................. 51
Figura 20. Determinação da CMC pelo método turbidimétrico para a saponina
modificada pela Viscozyme ................................................................................................. 52
modificada pela Ultrazym. ................................................................................................... 52
modificada pela Celluclast. .................................................................................................. 53
Figura 23. Índice de emulsificação 24 horas para a saponina não-modificada e para as
modificadas pelas enzimas Viscozyme, Ultrazym e Celluclast, nas concentrações 0,1 e
1 g/L....................................................................................................................................... 53
Lista de Abreviaturas e Siglas
ATCC American Type Culture Collection

BHI Brain Heart Infusion
CLSI/NCCLS Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards
CMC Concentração Micelar Crítica

DNS ácido 3,5-dinitrosalicílico
ESI Ionização por Eletrospray
Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz
HPLC High Performance Liquid Chromatography
IE24 Índice de Emulsificação 24 horas
MIC Minimal Inhibitory Concentration
g Micrograma
mg Miligrama
mL Mililitro
MS Mass spectrometer
pH Potencial hidrogeniônico
rpm Rotações por minuto
RPMI Roswell Park Memorial Institute
Tween 80 Poloxietileno monooleato de sorbitana
UV Ultravioleta
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 14
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................... 17
2.1. SURFACTANTES ............................................................................................. 17
2.1.1. Classificação dos Surfactantes............................................................... 17
2.1.1.1. Quanto à Natureza da Parte Hidrofílica................................................... 17
2.1.1.2. Sintéticos x Naturais.................................................................................. 18
2.1.2. Comportamento dos Surfactantes em Solução ................................... 19
2.1.3 Emulsões ..................................................................................................... 21
2.1.4. Formação de espuma ................................................................................ 22
2.2. SAPONINAS ..................................................................................................... 22
2.2.1. Classificação ................................................................................................ 23
2.2.2. Fontes de Saponinas ................................................................................. 25
2.2.3. Propriedades ................................................................................................ 25
2.2.3.1. Poder Surfactante...................................................................................... 26
2.2.3.2. Interação com esteróis .............................................................................. 26
2.2.3.3. Atividade Antimicrobiana .......................................................................... 27
2.2.4. Saponinas do Juá ...................................................................................... 28
2.2.5. Modificação Estrutural das Saponinas........................................................ 31
2.2.5.1. Enzimas como Bioconversores ................................................................ 31
3. OBJETIVOS .............................................................................................................. 34
3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 34
4. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 35
4.1. MATERIAIS ....................................................................................................... 35
4.2. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS .......................................................... 35
4.2.1. Extração e Hidrólise Total das Saponinas ............................................ 35
4.2.1.1. Obtenção do Extrato Rico em Saponinas ............................................... 35

4.2.1.2. Hidrólise Total das Saponinas ....................................................................... 36
4.2.2. Modificação Enzimática das Saponinas ................................................. 37
4.2.3. Caracterização das Saponinas ................................................................. 38
4.2.4. Concentração Micelar Crítica (CMC) ....................................................... 39
4.2.5. Índice de Emulsificação (IE24) ................................................................... 39
4.2.6. Atividade Antimicrobiana das Saponinas do Juá ................................. 39
4.2.6.1. Cultivo e Preparo do Inóculo .................................................................... 40
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................... 42
5.1. EXTRAÇÃO E HIDRÓLISE TOTAL DAS SAPONINAS .............................. 42
5.1.1. Obtenção do Extrato Rico em Saponinas .............................................. 42
5.1.2. Hidrólise Total das Saponinas.................................................................. 42
5.2. MODIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DAS SAPONINAS ....................................... 43
5.3. CARACTERIZAÇÃO DAS SAPONINAS ....................................................... 44
5.4. CONCENTRAÇÃO MICELAR CRÍTICA ........................................................ 51
5.5. ÍNDICE DE EMULSIFICAÇÃO (IE24) .............................................................. 53
5.6. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS SAPONINAS DO JUÁ .................... 54
6. CONCLUSÕES E SUGESTÕES ............................................................................ 57
7. PERSPECTIVAS ...................................................................................................... 59
8. REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 60
14
1. INTRODUÇÃO
Saponinas é o nome genérico dado a glicosídeos oriundos do metabolismo
secundário dos vegetais. Consistem em um esqueleto derivado de
isoprenóides, triterpênico ou esteroidal, denominado aglicona ou sapogenina,
ligado a cadeias de açúcares através de uma ou mais ligações glicosídicas
(Augustin et al., 2011). Assim como outros metabólitos secundários, tais como
fitoesteróis, carotenóides, entre outros, as saponinas não desempenham papel
essencial no crescimento das plantas, mas desempenham funções fisiológicas
que favorecem sua sobrevivência, sendo parte do sistema de defesa dos
organismos vegetais (Kalinowska et al., 2005 apud Ribeiro, 2012).
O nome “saponina” está relacionado à capacidade dessas substâncias

formarem espumas estáveis em soluções aquosas, da mesma forma que os
sabões (Vincken et al., 2007; Wang et al., 2011). Essa propriedade é devida ao
caráter anfifílico de suas moléculas, que possuem uma parte lipofílica
(aglicona) e uma parte hidrofílica (cadeia de açúcares). Tal característica faz
com que as saponinas sejam classificadas como surfactantes naturais.
As saponinas, assim como os fosfolipídeos e algumas proteínas ou

hidrolisados proteicos, apresentam-se como alternativas mais verdes em
relação aos surfactantes sintéticos, devido à sua maior biodegradabilidade,
menor toxicidade e por serem extraídos de fontes renováveis, ao contrário dos
surfactantes sintéticos, que possuem o petróleo como matéria-prima (Nitschke
& Pastore, 2002).
Encontradas naturalmente em alguns alimentos, como alho-poró, cebola,

beterraba, erva-mate, entre outros, as saponinas encontram-se inseridas na
nossa dieta. Das fontes de saponina que compõem a biodiversidade brasileira,
o juá (Ziziphus joazeiro) apresentou-se com o maior potencial de aplicação, em
razão de suas propriedades tensoativas, como capacidade de redução da
tensão superficial da água e índice de emulsificação, serem mais expressivas
que as de saponinas oriundas de diversos vegetais estudados . Ainda assim, os
índices de emulsificação encontrados são baixos em relação aos surfactantes
comerciais, indicando que a saponina do juá deveria ser utilizada em conjunto
15
com outro surfactante, na estabilização de emulsões (Ribeiro, 2012).

Entretanto, a presença de grupos sulfato em algumas saponinas encontradas
no juá (Higuchi et al., 1984) amplia seu uso como surfactante, uma vez que
elas podem apresentar-se com caráter aniônico, ao contrário da maioria das
saponinas, que são surfactantes não-iônicos.
A aplicação das saponinas, entretanto, vai além de sua atuação como

surfactante. Elas têm potencial aplicação industrial também como
preservativos, modificadores de sabor e até como agentes de remoção de
colesterol de laticínios (Guclu-Ustundag & Mazza, 2007; San Martin & Briones,
1999 apud Augustin et al., 2011). Com relação à sua potencial atividade
antimicrobiana, saponinas de diversas fontes vegetais são citadas como
portadoras de atividade antifúngica (Yang et al., 2006), porém não costumam
ser eficientes em sua ação antibacteriana (Hostettmann & Marston, 2005).
As propriedades funcionais, bem como as propriedades físico-químicas,

são consequências da estrutura química das moléculas. Alterações na
estrutura provocam, via de regra, alterações físico-químicas, uma vez que a
massa e a geometria molecular são determinantes para tais propriedades,
sendo relativamente fácil prever de que forma essas mudanças estruturais irão
afetá-las. Quanto às propriedades funcionais, como a atividade antimicrobiana
e o poder surfactante, por exemplo, tal relação de causa e efeito não é
previsível.
Nesse sentido, dada a imensa diversidade estrutural e de atividades das

saponinas, ainda não é possível prever que tipo de atividade cada uma irá
apresentar apenas conhecendo sua estrutura. Por se tratar de uma
biomolécula com grande potencial tecnológico, estudos experimentais acerca
da relação atividade/estrutura ainda são necessários e de grande relevância
para seu melhor entendimento e definição de novos rumos de pesquisa
(Augustin et al., 2011).
Liu et al. (2013) avaliaram a relação estrutura-bioatividade de saponinas

naturais e modificadas quimicamente, observando aumento da citotoxicidade
de saponinas contra células cancerígenas quando se aumentava a cadeia de
açúcares, entre outras conclusões. Feng et al. (2015) modificaram saponinas
16
de chá através de esterificação, obtendo saponinas modificadas com maior

poder surfactante.
Uma estratégia verde para serem obtidas saponinas modificadas é

através de reações enzimáticas. Wie et al. (2007) utilizaram β-glicosidase e α-
rhamnosidase obtidas de Aspergillus niger para modificar enzimaticamente
saponinas de Platycodon grandiflorum, obtendo saponinas com cadeia lateral
de açúcares reduzida. Enzimas do tipo carboidrolases são biocatalisadores
capazes de quebrar as ligações entre duas moléculas de açúcares, produzindo
saponinas parcialmente hidrolisadas, o que pode ter algum efeito sobre suas
propriedades, como o poder surfactante e a atividade antimicrobiana.
17
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. SURFACTANTES
Surfactantes são moléculas que apresentam, em sua estrutura, uma

parte apolar (hidrofóbica) e uma parte polar (hidrofílica). Essa característica
anfifílica confere a elas algumas propriedades, tais como detergência, poder
emulsificante e formação de espuma.
De uma forma geral, os surfactantes atuam reduzindo a tensão

interfacial entre duas fases imiscíveis. A tensão interfacial é definida como a
energia livre da interface por unidade de área. Quanto maior essa energia,
maior o trabalho necessário para expandir a interface (Tadros, 2005).
As propriedades dos surfactantes fazem com que eles encontrem

variadas aplicações na indústria, como na área de cosméticos, produtos de
higiene e limpeza. Na indústria de petróleo, são importantes na recuperação
terciária de óleo nos poços. Na indústria de alimentos, são utilizados como
emulsificantes na formulação de diversos produtos, como achocolatados, leite
em pó, pães, molhos, entre outros.
2.1.1. Classificação dos Surfactantes

Os surfactantes são classificados de acordo com a natureza da parte
hidrofílica, que pode ser não-iônica, iônica (aniônica ou catiônica) ou anfótera.
Podem, ainda, ser classificados como sintéticos ou naturais, sendo estes
últimos subdivididos quanto à origem: microbiana ou vegetal.
2.1.1.1. Quanto à Natureza da Parte Hidrofílica

A parte hidrofílica da molécula é a responsável pelo caráter iônico ou
não-iônico dos surfactantes: se sua polaridade for grande o suficiente para
gerar íons por dissociação (cargas verdadeiras), tem-se um surfactante
aniônico ou catiônico, dependendo se a carga gerada na molécula for negativa
ou positiva (Daltin, 2011). Exemplos de surfactantes aniônicos são os sabões
(sais de ácido carboxílico) e os sulfatados, como o laurilsulfato de sódio. Os
18
surfactantes catiônicos são representados pelos sais quaternários de amônia

(Peres, 2005).
Entretanto, se a parte polar da molécula apresentar apenas carga

parcial, não havendo formação de íons, o surfactante é não-iônico. Existem,
ainda, os surfactantes anfóteros, que são aqueles que podem apresentar-se
carregados positiva ou negativamente, dependendo do pH do meio (Daltin,
2011).
2.1.1.2. Sintéticos x Naturais

Os surfactantes sintéticos são de origem petroquímica e encontram-se
disponíveis comercialmente, com ampla aplicação industrial. Os álcoois
sulfatados foram os primeiros surfactantes usados comercialmente. Depois,
surgiram os alquilbenzenos sulfonados (ABS), que, por serem ramificados e,
consequentemente, pouco biodegradáveis, foram substituídos pelo linear
alquilbenzeno sulfonado (LAS), que é menos prejudicial ao meio ambiente
(Peres, 2005).
O mercado global de surfactantes foi avaliado pela Acmite Market

Intelligence (2016) em aproximadamente US$ 30,65 bilhões em 2015. Com um
crescimento esperado de 4,4% ao ano, espera-se que esse mercado chegue a
US$ 39,69 bilhões em 2021.
Entretanto, em termos sustentáveis, os surfactantes naturais trazem

inúmeras vantagens. Enquanto os surfactantes sintéticos são derivados de
fontes fósseis, produzidos por processo que, em si, já traz impacto para o meio
ambiente, os naturais são extraídos de fontes renováveis ou produzidos por
micro-organismos, sendo muito menos agressivos por serem biodegradáveis e
apresentarem baixa toxicidade, ao contrário dos sintéticos (Mulligan, 1993 apud
Nitschke & Pastore, 2002).
Os biossurfactantes incluem glicolipídeos, lipopeptídeos, lipoproteínas

fosfolipídios e ácidos graxos, surfactantes poliméricos e surfactantes
particulados produzidos por micro-organismos e são classificados de acordo
com sua composição química ou origem microbiana (Desai, 1993 apud
Nitschke & Pastore, 2002). São utilizados em várias aplicações, como na
biorremediação de solos, na recuperação melhorada de petróleo, em
19
aplicações terapêuticas, na agricultura, na mineração, em produtos de higiene

e cosméticos e na indústria de alimentos (Nitschke & Pastore, 2002). Apesar
disso, ainda possuem um mercado muito menor do que o dos surfactantes
sintéticos: espera-se atingir 2,3 milhões em 2020, segundo a Grand View
Research, Inc (2016).
Surfactantes também podem ser extraídos de fontes vegetais, como é o

caso das saponinas, além de fosfolipídeos, proteínas ou hidrolisados proteicos.
Um exemplo bem conhecido de surfactante natural é a lecitina de soja, mistura
de fosfolipídeos amplamente utilizada na indústria alimentícia (Ribeiro, 2012).
2.1.2. Comportamento dos Surfactantes em Solução

Devido ao seu caráter anfifílico, a solubilização de um surfactante em
meio polar (como a água) ou apolar (como óleo) sempre envolve uma certa
instabilidade, oriunda da não-afinidade de parte da molécula pelo meio
solvente. A fim de diminuir essa instabilidade, as moléculas de surfactante
tendem a migrar para as interfaces do sistema, sejam elas a superfície do
líquido (interface líquido-ar), as paredes do sistema (interfaces líquido-sólido)
ou a interface entre dois líquidos imiscíveis, se for um sistema com mais de
uma fase. Dessa forma, a parte hidrofílica da molécula fica voltada para a fase
mais polar, dando maior estabilidade ao sistema (Daltin, 2011). Esse processo
é explicado na Figura 1, na qual a parte polar da molécula é representada por
elipses.
Figura 1. Disposição preferencial dos surfactantes nas interfaces

Fonte: Daltin, 2011.
20
Quando não há mais espaço para se dispor nas interfaces, as moléculas

de surfactantes livres no meio do líquido começam a se agrupar. Por exemplo,
em meio aquoso, essas moléculas se dispõem de forma que suas cadeias
apolares se aproximem umas das outras, expondo as porções polares para o
seio do líquido. Esse processo tem o mesmo objetivo que a disposição
preferencial dos surfactantes quando se orientam perpendicularmente nas
interfaces: diminuir a instabilidade do sistema, através da diminuição da
energia livre. Às estruturas assim formadas, dá-se o nome de micelas, e
concentração em que se inicia a formação de micelas é chamada
Concentração Micelar Crítica (CMC) (Bordel & Giesecke, 2007; Daltin, 2011).
A CMC é uma importante propriedade, característica de cada

surfactante. O processo de formação de micelas é fundamental para qualquer
aplicação de um surfactante, uma vez que propriedades como emulsificação,
detergência e formação de espuma só se pronunciam quando a concentração
do surfactante é maior que a CMC (Jumpertz et al., 2010).
A CMC pode ser determinada experimentalmente, aumentando-se

gradativamente a concentração do surfactante em solução e observando-se a
redução da tensão superficial que ocorre devido à migração das moléculas
tensoativas para as interfaces líquido-ar e líquido-sólido. A tensão superficial
cai com o aumento da concentração até que, na CMC, todas as interfaces
estão saturadas e inicia-se a formação de micelas. Nesse ponto, a tensão
deixa de variar e atinge um patamar mínimo, tornando possível a determinação
da CMC graficamente (Daltin, 2011). Na CMC, ocorrem mudanças em
propriedades macroscópicas da solução (Figura 2), sendo possível determiná-
las não só pelo acompanhamento da tensão superficial, como também pela
variação da turbidez, pressão osmótica, solubilidade, condutividade, auto-
difusão, etc (Gurgel, 2000; Viades-Trejo et al., 2012).
21
Figura 2. Influência da formação de micelas nas propriedades físicas das soluções de surfactantes
Fonte: Gurgel, 2000.
2.1.3 Emulsões
Quando dois líquidos imiscíveis, como água e óleo, são agitados

fortemente, forma-se uma emulsão na qual encontram-se suspensos entre si. A
emulsão assim formada é um sistema instável, uma vez que a falta de
afinidade entre a água e o óleo gera tensões interfaciais que o sistema tenderá
a reduzir, a fim de ganhar mais estabilidade. Deste modo, as gotículas de água
ou óleo suspensas tendem a coalescer aumentando de volume e,
consequentemente, diminuindo a área superficial sujeita às tensões, até a
completa separação das fases (Rieger, 1996 e Ansel et al., 2000 apud Casteli
et al, 2008; Daltin, 2011).
Os surfactantes têm a função de aumentar a estabilidade das emulsões,

pois, além de reduzirem as tensões interfaciais, tendem a impedir a
coalescência através de dois possíveis efeitos (dependendo do tipo de
surfactante): repulsão eletrostática ou impedimento estérico. Quando dois
líquidos imiscíveis são agitados na presença de um surfactante com
concentração acima da CMC, ocorre a migração das moléculas surfactantes
das micelas para as novas interfaces formadas. Se o surfactante for aniônico,
as gotículas suspensas serão envoltas por cargas negativas que, por repulsão
eletrostática, impedirão a coalescência e, consequentemente, a separação das
fases. Se o surfactante for não-iônico, o efeito observado é o de impedimento
estérico, ou seja, as gotículas suspensas não coalescem porque as moléculas
22
de surfactante encontram-se ao redor delas, impedindo sua aproximação. Para

aumentar a estabilidade das emulsões de forma mais efetiva, é recomendado o
uso combinado desses dois tipos de surfactantes (Daltin, 2011).
Um importante parâmetro de avaliação do poder de um emulsificante e

da estabilidade da emulsão é o Índice de Emulsificação (IE) (Cooper &
Goldenberg, 1987; Abu-Ruwaida et al., 1991). De acordo com Cooper &
Goldenberg (1987), o IE é calculado pela razão entre a altura remanescente de
emulsão e a altura total de líquido, após agitação de dois líquidos imiscíveis,
normalmente água e óleo, na presença de um surfactante. O IE é dependente
do tempo, logo, estabelece-se um intervalo para sua avaliação, por exemplo, o
IE24 é medido 24 horas após a agitação. O IE para um mesmo surfactante pode
variar com o tipo de substância hidrofóbica utilizada (diferentes hicrocarbonetos
ou óleos vegetais) (Barros et al., 2008).
2.1.4. Formação de espuma

Quando uma solução contendo um surfactante em concentração acima
da CMC é agitada, pequenas bolhas de ar podem entrar nessa solução e
formar novas superfícies água–ar, em um processo muito semelhante ao de
formação de uma emulsão. Como mais superfícies foram geradas, há migração
das moléculas do surfactante para essas superfícies. As bolhas formadas,
envoltas em surfactantes, emergem à superfície do líquido, formando a
espuma. Surfactantes aniônicos, em especial os sulfatados, são geralmente os
que proporcionam espumas mais volumosas e duradouras, uma vez que a
espuma formada por estes possui um maior volume de filme líquido entre as
bolhas de ar. Isso ocorre devido à repulsão eletrostática, uma vez que os
surfactantes aniônicos apresentam a maior concentração de carga em suas
partes polares (Daltin, 2011).
2.2. SAPONINAS
Saponinas são glicosídeos produzidos como metabólitos secundários

por diversos vegetais superiores. Apesar dessa classe de compostos naturais
reunir substâncias com variadas estruturas, as saponinas apresentam algumas
23
características em comum, como a capacidade de formar espuma, devido ao

caráter anfifílico de suas moléculas, que lhes confere atividade surfactante
(Podolak et al., 2010).
2.2.1. Classificação
As saponinas são classificadas de acordo com o tipo de esqueleto da
aglicona: esteroidal ou triterpênico (Figura 3). Tanto os triterpenos como os
esteroides são isoprenóides, que possuem como precursor o óxido de
esqualeno, composto de trinta carbonos que sofre ciclizações enzimáticas, na
biossíntese que dá origem às agliconas. Nas saponinas esteroidais, a aglicona
é formada por um esqueleto de 27 carbonos, enquanto as agliconas
triterpênicas mantêm os 30 carbonos do seu precursor (Augustin et al., 2011).
Saponinas esteroidais são encontradas nas famílias Liliaceae,

Dioscoreaceae, Agavaceae. As triterpênicas são as mais abundantes na
natureza e encontram-se mais difundidas nas dicotiledôneas (famílias
Primulaceae, Sapotaceae, Caryophyllaceae, entre outras) (Podolak et al.,
2010).
Figura 3. Esqueletos representativos de saponinas triterpênicas (ácido oleanólico) e esteroidais

(diosgenina).
Fonte: Augustin et al, 2011.
Existem, ainda, subclassificações quanto ao esqueleto da aglicona. As

saponinas esteroidais podem ser do tipo espirostano, ou furostano (Figura 4)
(Sparg et al, 2004 apud Ribeiro, 2012). Já as saponinas triterpênicas, podem
24
ser dos seguintes tipos: damarano, tirucalano, lupano, hopano, oleanano,

taraxasterano, ursano, cicloartano, lanostano e cucurbitano. Dentre eles, as do
tipo oleanano são as mais comumente encontradas no reino vegetal (Figura 5)
(Vincken et al., 2007).
Figura 4. Saponinas esteroidais com esqueletos do tipo furostano e espirostano (R= açúcares).
Fonte: Sarker e Nahar, 2009.
Figura 5. Estruturas dos 10 tipos de esqueletos triterpênicos das saponinas.

Fonte: Vincken et al, 2007.
Outra forma de classificação das saponinas é quanto ao número de

glicosilações. Desta forma, elas podem ser classificadas como mono, di ou
25
tridesmosídicas. A glicosilação geralmente ocorre no carbono C3 (via éter) e/ou

C28 (via éster), ocorrendo raramente em outras posições, no caso das
tridesmosídicas. É comum que se encontrem ligados à aglicona
monossacarídeos, tais como D-glicose, D-galactose, ácido D-glucurônico, ácido
D-galacturônico, L-ramnose, L-arabinose, D-xilose e D-fucose (Vincken et al.,
2007).
2.2.2. Fontes de Saponinas

As saponinas podem ser encontradas nas raízes, caules, folhas, flores
ou nos frutos de organismos vegetais. A quilaia (Quillaja saponaria), o juazeiro
(Ziziphus joazeiro) e o sisal (Agave sisalana) são exemplos de plantas que
contêm saponinas. A quilaia apresenta elevada concentração de saponinas,
presentes no caule (5 a 20% da casca), sendo uma das principais fontes
conhecidas e estudadas. Extratos de quilaia são utilizados em alimentos como
emulsificantes (San Martín & Briones, 1999; Resnik, 2003).
Dentre os alimentos que consumimos, existem também diversas fontes

de saponinas. Alguns alimentos possuem alta concentração desses
compostos, como é o caso do ginseng e do alcaçuz, cujas saponinas
representam cerca de 4 - 20% do peso seco da raiz, no caso do alcaçuz, e 1,5
- 6%, no caso do ginseng. O alho-poró, o alho, a cebola, o aspargo, a erva-
mate, a beterraba, a quinoa e a soja, entre outros, apresentam concentrações
mais baixas de saponinas (Ribeiro, 2012). Apesar de serem largamente
distribuídas no reino vegetal, as saponinas também podem ser encontradas em
algumas espécies animais, como certos animais marinhos invertebrados
(Podolak et al., 2010).
2.2.3. Propriedades
A diversidade estrutural das saponinas é extremamente grande, porém
pode-se atribuir, de uma forma geral, algumas propriedades às saponinas. O
poder surfactante, por ser inerente à anfifilicidade da molécula, é a propriedade
mais comum. Entretanto, certas saponinas podem apresentar propriedades
mais específicas, como é o caso do poder antimicrobiano.
26
2.2.3.1. Poder Surfactante

Uma das principais características das saponinas é a sua capacidade de
formar espuma, o que explica a origem de seu nome (do latim sapo, que
significa sabão) (Vincken et al., 2007). A espuma formada é estável à ação de
ácidos minerais diluídos, diferenciando-se dos sabões comuns (Cunha &
Roque, 2005 apud Castejon, 2011). A formação de espuma é uma das
consequências da estrutura anfifílica das saponinas, que lhes confere poder
surfactante.
Saponinas têm sido estudadas e, até mesmo, disponibilizadas

comercialmente como surfactantes naturais (Wang et al., 2011; Yang et al.,
2013). O poder surfactante de saponinas de quilaia foi semelhante ao do
tensoativo comercial Tween 80, um surfactante não-iônico muito utilizado na
indústria de alimentos, concluindo-se que saponinas de quilaia têm potencial
para substituir os surfactantes comerciais em formulações de alimentos e
bebidas (Yang et al., 2012).
2.2.3.2. Interação com esteróis

A capacidade de interação das saponinas com esteróis é uma
característica bastante estudada dessa classe de compostos. A digitonina, por
exemplo, uma saponina esteroidal, forma complexos com o colesterol em
solução aquosa (Akiyama et al., 1980). A interação com esteróis foi uma
característica elucidada a partir de estudos que indicaram que saponinas
seriam responsáveis pela formação de poros em membranas de células virais,
o que, por sua vez, estaria diretamente relacionado com os esteróis presentes
na membrana celular (Bangham & Horne, 1962; Glauert et al., 1962).
Como consequência da capacidade de interagir com os esteróis das
membranas celulares, tem-se as atividades hemolítica, antifúngica,
antiprotozoário, hipocolesterolêmica e até mesmo farmacológicas (Giner et al.,
2000; Zhang et al., 2008) observadas para muitas saponinas (Micich et al.,
1992; Hwang & Damodaran, 1994; Mitra & Dungan, 2000 apud Ribeiro, 2012).
Todas essas propriedades estão, obviamente, fortemente relacionadas à
estrutura de cada saponina, em termos do tipo de aglicona, quantidade de
27
glicosilações e o número e tipo de açúcares ligados à aglicona (Augustin,

2011).
2.2.3.3. Atividade Antimicrobiana

Saponinas de diversas fontes podem apresentar atividade
antimicrobiana. Saponinas triterpênicas com esqueleto do tipo oleanano, como
hederagenina e ácido oleanólico, demonstraram possuir efeito antifúngico
contra Candida glabratra, C. albicans, Trichosporon beigeli, Penicillium
avelaneum UC-4376, Pyriculataoryzae, Cryptococcusneoformans, Coccidioides
immitis, Saccharomyces cerevisiae, Microsporum canis e Trichophyton
mentagrophytes (Du et al., 2003; Lee et al., 2001 apud Tsuzuki et al., 2007).
Escalante et al. (2002) também estudaram saponinas triterpênicas com
esqueletos do tipo oleanano, com grupos dicarboxílicos em C-28 e C-30 e
dupla ligação no C-12, concluindo que estas possuíam atividade contra alguns
fungos patogênicos.
Saponinas antifúngicas de banana-de-papagaio (Swartzia langsdorffii)

que foram isoladas por Monti et al. (2008) também apresentavam esqueleto
oleanano e uma carboxila livre no C28 (Figura 6). Santiago et al. (2005) haviam
concluído que a existência de uma carboxila livre no C28 era essencial para a
atividade larvicida de saponinas com esqueleto do tipo oleanano sobre Aedes
aegypti, bem como observaram que essa atividade era maior para as
saponinas monodesmosídicas e com um menor números de açúcares na
cadeia lateral no C3.
Figura 6. Estruturas das saponinas isoladas da banana-de-papagaio.

Fonte: Monti et al., 2008.
28
Em relação à atividade antibacteriana, Lemos et al. (1992) observaram

que a saponina acetilada 3-β-O-[α-L-rhamnopiranosil-(1→3)-β-D-glicopiranosil]-
hederagenina possuía efeito contra Pseudomonas aeruginosa ATCC 15422,
Bacillus subtilis ATCC 6633 e Cryptococcus neoformans. Ahmad e Beg (2001)
também reportaram sua ação contra Staphylococcus aureus.
Ginsenosídeos, saponinas triterpênicas de Panax ginseng, com

esqueleto do tipo damarano (Park et al., 2016), apresentaram ação
antimicrobiana, atuando através de disrupção da membrana celular de
bactérias gram positivas e gram negativas, como Staphylococcus aureus e
Salmonella typhimurium (Sung & Lee, 2008).
2.2.4. Saponinas do Juá

O juazeiro (Ziziphus joazeiro Martius, Família Rhamnaceae) é uma
árvore encontrada preferencialmente na caatinga, ocorrendo naturalmente na
região Nordeste do Brasil, mas também em alguns estados do Norte, Centro-
Oeste e Sudeste (Lima, 1985). Tem grande importância socioeconômica na
região Nordeste, onde suas folhas e frutos são utilizados na alimentação
animal (Barros et al., 1991); seus frutos, na alimentação humana; suas cascas,
como detergente e dentifrício; seus caules, como combustível e material de
construção, entre outros (Carvalho, 1994). As cascas do caule e as folhas do
juá também são utilizadas para fins medicinais, como cicatrizantes e anti-
inflamatório, entre outros (Matos, 1999).
As seis saponinas do juá possuem agliconas triterpênicas do tipo

damarano, com um quinto anel formado contendo um oxigênio como
heteroátomo. As estruturas 1, 2 e 3 da Figura 7 representam as saponinas
encontradas em maior quantidade no juá, chamadas jujubosídeos, cujas
agliconas são chamadas jujubogeninas. São monodesmosídicas, com uma
única glicosilação no carbono 3. Os açúcares encontrados nesses glicosídeos
são glicose e arabinose, na forma dos anéis α-arabinopiranosil, β-glicopiranosil
e α-arabinofuranosil, sulfatados ou não. (Higuchi et al., 1984; Schühly et al.,
2000).
29
As saponinas 4, 5 e 6 da Figura 7 foram isoladas por Schühly et al.

(2000). Os compostos 4 e 5 são denominados juazeirosídeos A e B,
respectivamente. O esqueleto do composto 6 é derivado da lotogenina, sendo
denominado lotosídeo A. Encontram-se ligados aos esqueletos, os anéis β-
glicopiranosil, α-arabinopiranosil e β-apiofuranosil.
As saponinas 1 a 6 são denominadas: (1) Jujubogenina 3-O-α-L-

arabinofuranosil-(12)-[β-D-glicopiranosil (13)]-α-arabinopiranosídeo; (2)
Jujubogenina 3-O-α-L-arabinofuranosil-(12)-[β-D-glicopiranosil-4-O-sulfato
(13)]-α-arabinopiranosídeo; (3) Jujubogenina 3-O-α-L-arabinofuranosil-
(12)-[β-D-glicopiranosil-4-O-sulfato (13)]-α-arabinopiranosídeo-3-O-sulfato;
(4) Juazeirogenina 3-O-β-D-glicopiranosídeo; (5) Juazeirogenina 3-O-β-D-
glicopiranosil-(12)-[β-D-apiofuranosil-(13)]-β-D-glicopiranosil-(12)-α-L-
arabinopiranosídeo; e (6) Lotogenina 3-O-β-D-glicopiranosil-(12)-[β-D-
apiofuranosil-(13)]- β-D- glicopiranosil-(12)-α-L-arabinopiranosídeo.
Dentre as fontes de saponinas que compõem a biodiversidade brasileira,

o juá apresenta-se como uma boa alternativa, levando-se em consideração o
teor (2 a 10% das cascas do caule) e o poder de emulsificação das suas
saponinas. As saponinas do juá foram capazes de reduzir a tensão superficial
em aproximadamente 35 mN/m, além de apresentarem Índice de Emulsificação
em torno de 50%, o que representa um dos melhores desempenhos, quando
se compararam saponinas de diversas fontes vegetais (Ribeiro, 2012).
Apesar das saponinas do juá terem demonstrado possuir maior poder

tensoativo que a maioria das saponinas investigadas, seu desempenho ainda
pode ser melhorado, especialmente em relação à estabilização de emulsões.
Além do poder surfactante, as saponinas do juá apresentaram atividade contra
a levedura Candida albicans a uma concentração de 156 µg/mL e contra o
fungo Aspergillus niger a 312,5 µg/mL, mas não apresentaram atividade
antibacteriana.
Cruz et al. (2007) observaram atividade antifúngica de extrato aquoso de

juá em concentrações entre 6,25 a 400 μg/mL. Alviano et al. (2008) observaram
atividade antibacteriana do mesmo tipo de extrato em concentrações entre 1,0
e 16,0 mg/mL. Porém, nesses casos, por se tratar de extratos aquosos, outros
componentes do juá poderiam estar contribuindo para tais atividades, como os
30
compostos fenólicos, alcaloides e triterpenos (Cushnie & Lamb, 2005 apud

Ribeiro, 2012).
Figura 7. Saponinas encontradas no juá.

Fonte: Higuchi et al., 1984; Schühly et al., 2000.
31
2.2.5. Modificação Estrutural das Saponinas

Diversos trabalhos investigaram a quebra ou aumento da cadeia lateral
de açúcares e os consequentes efeitos na bioatividade e demais propriedades
das saponinas. As cadeias laterais de açúcar nas posições C3 e C28 da
aglicona, bem como a presença de grupos funcionais nessas posições,
desempenham papel fundamental na biotividade da molécula (Wie et al., 2007;
Zhu et al., 2011). As modificações podem ser efetuadas via processamento
químico ou por bioconversão microbiana ou enzimática.
Monti et al. (2005) utilizaram glicosidases, glicosiltransferases, lipases e

lacases para modificar a parte glicosídica de saponinas de Centella asiática.
Wie et al. (2007) estudaram o efeito da quebra parcial da cadeia de açúcares
de saponinas de Platycodon grandiflorum por enzimas produzidas por A. niger,
obtendo saponinas modificadas com maior poder antioxidante, melhores
características sensoriais e menor toxicidade.
Outras abordagens, porém, vão além da modificação da parte glicosídica

da molécula. Modificações estruturais no esqueleto lipofílico, como inserção de
grupos funcionais e esterificação, por exemplo, também podem ter impacto
significativo na bioatividade. Zhu et al. (2011) estudaram a biotransformação de
derivados do ácido oleanólico e suas saponinas pela ação dos micro-
organismos Streptomyces griseus ATCC 13273 e Aspergillus ochraceus CICC
40330, caracterizando os novos compostos produzidos. Feng et al. (2015)
sintetizaram saponinas modificadas através de esterificação da aglicona das
saponinas do chá, obtendo um produto com melhor atividade tensoativa.
2.2.5.1. Enzimas como Bioconversores

Enzimas são proteínas que atuam como catalisadores naturais, ou
biocatalisadores, sendo largamente utilizadas na biotransformação de
compostos naturais. Através de seu centro-ativo, as enzimas se ligam ao
substrato, formando um complexo enzima-substrato, que, após a reação, dará
origem aos produtos mais a enzima livre. As enzimas aceleram as reações pelo
decréscimo da energia livre de ativação necessária, através da formação de
um complexo intermediário de menor energia (Stryer, 2008).
32
As reações enzimáticas trazem uma série de vantagens em relação às

reações com catalisadores químicos, dentre elas o fato das enzimas serem
obtidas a partir de organismos vivos, por simples extração ou fermentação a
partir de matérias primas renováveis, trabalharem em condições reacionais
mais brandas e terem altíssima especificidade. Entretanto, são extremamente
sensíveis às condições ambientais, como temperatura, pH e força iônica do
meio, fatores que podem causar alterações na sua estrutura terciária e/ou
secundária, o que levará à sua desnaturação e consequente perda de atividade
enzimática (Illanes, 1994).
As enzimas são classificadas de acordo com o tipo de reação que

catalisam em seis classes: oxidorredutases, transferases, hidrolases, liases,
isomerases e ligases. O grupo das hidrolases engloba a maioria das enzimas
com aplicação industrial, como as carboidrolases, proteases etc (Illanes, 1994).
Podem-se obter saponinas com cadeias laterais parcialmente

hidrolisadas ou até mesmo agliconas livres a partir de reações enzimáticas
(Monti et al., 2005; Wie et al., 2007). No caso da modificação enzimática de
saponinas via quebra da cadeia de açúcares, as carboidrolases apresentam-se
como possíveis biocatalisadores da reação. Pertencem ao grupo das
carboidrolases, as amilases, glicoamilases, pectinases, celulases,
hemicelulases, lactases, galactosidases e invertases (Illanes, 1994).
Celulases são enzimas que atuam na quebra da celulose e derivados,

gerando glicose. Os três tipos de celulase envolvidos nessa reação são a
exocelulase, a endocelulase e a celobiase. A exocelulase (1,4-β-D-glucano
celobiohidrolase) atua na extremidade da cadeia de celulose, produzindo
celobiose; a endocelulase (1,4-β-D-glucano-4-glucanohidrolase) atua na quebra
de ligações no meio da cadeia, gerando celodextrinas; e a celobiase (β-
glicosidase) hidrolisa a celobiose e celodextrinas de baixo peso molecular,
gerando glicose (Gerhartz, 1990).
As hemicelulases são enzimas que atuam nas ligações encontradas nas

hemiceluloses, que são polissacarídeos heterogêneos compostos
predominantemente de pentoses (xilose, arabinose) e hexoses (manose,
glicose, galactose) (Gerhartz, 1990; Saha, 2003). Dentre as hemicelulases,
encontram-se as xilanases, que hidrolisam ligações do tipo β-1,3 e β-1,4 entre
33
moléculas de xilose; as arabanases, que quebram ligações α-1,5 e α-1,3 entre

arabinases; as dextranases, que atuam na ligação α-1,6 de dextranas; as
inulinases, que quebram as ligações β-1,2 entre as moléculas de frutose da
inulina; as pentosanases; as β-glucanases (ligações β-1,3, β-1,4 e β-1,6 de β-
glucanos), entre outras (Gerhartz, 1990; Uhlig, 1998; Koblitz, 2008).
As pectinases são um conjunto de enzimas capazes de hidrolisar as

ligações glicosídicas da pectina. São muito utilizadas na indústria de bebidas,
como na clarificação de sucos e no aumento de rendimento de suco na
produção de vinho. Pectinases comerciais utilizadas em tais aplicações são
capazes de degradar a parede celular de vegetais, sendo compostas, muitas
vezes, além das enzimas pectinolíticas, por celulases e hemicelulases.
Levando em consideração a estrutura das saponinas, em especial os

tipos de açúcares presentes na cadeia lateral e das ligações existentes entre
eles, nota-se que preparados enzimáticos comerciais com atividade em
diversos tipos de ligações glicosídicas, compostos por celulases, hemicelulases
e/ou pectinases, são capazes de modificar a estrutura original da molécula. Os
preparados contendo hemicelulases são os mais promissores quando se trata
das ligações do tipo α-1,2, α-1,3, β-1,2 e β-1,3 presentes nas saponinas do juá.
Kim et al. (2006) modificaram enzimaticamente ginsenosídeos, obtendo

novos compostos quando utilizaram-se as enzimas comerciais Pectinex
(pectinase e arabanase) e Viscozyme (hemicelulases, celulases). As condições
ótimas de reação para esses tipos de enzimas, segundo a literatura, são
temperaturas em torno de 50°C, pH entre 4 e 5 e concentração de enzima de
5%. O tempo de incubação pode variar de acordo com o grau de reação que se
deseja, podendo chegar a dois ou três dias (Kim et al., 2006).
34
3. OBJETIVOS
O objetivo do trabalho é investigar como se comportam as atividades
emulsificante e antimicrobiana das saponinas do juá frente a alterações em sua
estrutura molecular, efetuadas a partir de reações enzimáticas, tendo como
estratégia o encurtamento da cadeia lateral de açúcares.
3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obter um extrato purificado de saponinas a partir das cascas do juá;
Avaliar as propriedades surfactantes e o poder antimicrobiano das

saponinas extraídas do juá;
Realizar reações de hidrólise enzimática utilizando enzimas comerciais

com diferentes atividades: Viscozyme L, Ultrazym AFPL e Celluclast 1.5L;
Caracterizar os produtos formados pelas reações através de HPLC-MS;
Determinar as propriedades (CMC, IE24 e MIC) das saponinas do juá

após as modificações enzimáticas;
Avaliar como se comportam as propriedades surfactante e atimicrobiana

frente às modificações estruturais provocadas pelas reações de hidrólise
enzimática.
35
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Extratos liofilizados ricos em saponinas do juá foram submetidos a

reações enzimáticas, e os produtos dessas reações, bem como o próprio
extrato original, foram analisados quanto ao poder surfactante e antimicrobiano.
4.1. MATERIAIS
O juá foi obtido no mercado local na forma de pedaços da casca e do

tronco. As enzimas utilizadas foram Viscozyme L (lote KTN02215), Ultrazym
AFPL (lote KJN07024) e Celluclast 1.5 L (lote CCN03138), todas da
Novozymes®. Demais solventes e reagentes utilizados: ácido sulfúrico,
metanol, hidróxido de sódio e butanol (Vetec); óleo de soja (Leve).
4.2. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
4.2.1. Extração e Hidrólise Total das Saponinas
4.2.1.1. Obtenção do Extrato Rico em Saponinas

As cascas do caule do juá foram trituradas e peneiradas (Mesh Tyler
32). Em um Erlenmeyer, 100 gramas desse material foram, então, extraídos
com solução metanol/água 1:1 (150mL de metanol + 150 mL de água) por 24
horas, sob agitação constante à temperatura ambiente. Após esse tempo, o
meio extrativo foi filtrado em funil de Büchner à vácuo. O filtrado foi reservado e
o resíduo sólido passou por nova extração por mais duas vezes. Ao final das
três extrações, o resíduo sólido foi descartado, e o filtrado foi rotoevaporado em
Evaporador Rotativo TE-210 acoplado a bomba de vácuo TE-0581. O metanol
foi, assim, recuperado e a solução aquosa resultante seguiu para a etapa de
partição com butanol.
Na partição, ocorre transferência de massa das saponinas da fase

aquosa para a fase butanólica. Essa etapa foi feita em funil de decantação,
repetindo-se o processo até que a fase butanólica adicionada à solução aquosa
ficasse quase incolor. Todo volume de butanol contendo as saponinas, oriundo
da partição, foi, então, lavado duas vezes em funil de decantação com solução
36
de NaOH 1%. Essa lavagem tem como objetivo remover os flavonóides

presentes no extrato butanólico. Após a lavagem com NaOH, foi feita uma
lavagem com água destilada. A solução butanólica purificada foi, então,
rotoevaporada até todo butanol ser recuperado e restar apenas as saponinas
cristalizadas no balão de evaporação. As saponinas foram ressuspensas em
uma quantidade mínima de água e, em seguida, liofilizadas por 24 horas em
Liofilizador Terroni Enterprise I, de forma a obter-se um extrato liofilizado rico
em saponinas. A Figura 8 mostra o fluxograma do procedimento de extração.
Figura 8. Fluxograma do método de extração das saponinas.

Fonte: Elaboração própria.
4.2.1.2. Hidrólise Total das Saponinas

A hidrólise da saponina resulta na quebra das ligações glicosídicas,
gerando agliconas e açúcares livres. Estes foram quantificados pelo método do
ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) para açúcares redutores totais adaptado de
Miller (1959). Adicionaram-se 150µL da amostra, 200µL do reagente DNS e
37
200µL de água destilada em frasco do tipo eppendorf; a solução reagiu por 10

minutos a 90ºC e, em seguida, adicionou-se 1,5mL de água destilada. A
absorbância da solução final foi lida a 540nm em espectrofotômetro Shimadzu
modelo UV-1800, frente a uma curva-padrão de glicose (0 a 10µmol/mL). Os
ensaios foram feitos em triplicata.
A hidrólise total, realizada com o intuito de fornecer um valor máximo de

concentração final de açúcares redutores, foi realizada pelo método adaptado
de Rothrock et al. (1957). Efetuou-se a reação da solução de saponina 1% com
HCl 4N, por 48 horas à temperatura ambiente. O meio hidrolisado foi, então,
centrifugado, e o sobrenadante foi neutralizado com NaOH 4N. A amostra
neutralizada foi submetida ao ensaio de determinação de açúcares redutores ,
conforme descrito anteriormente.
4.2.2. Modificação Enzimática das Saponinas
As reações enzimáticas teoricamente produzirão saponinas parcialmente

hidrolisadas, ou seja, com uma cadeia menor de açúcares, mas ainda na forma
glicosídica. Como biocatalisadores dessas reações, foram utilizadas três
enzimas comerciais: Viscozyme L (celulases e hemicelulases), Ultrazym AFPL
(pectinases) e Celluclast 1.5L (celulase). A reação foi conduzida em shaker,
com rotação de 200 rpm, à 50ºC e pH 5, a partir de solução de saponina 1%
com adição de enzima 5% v/v, por um tempo mínimo de 24 horas. O ponto final
de reação foi determinado através da determinação, por DNS, dos açúcares
formados.
Após o tempo de reação, filtrou-se o meio reacional para remoção de

agliconas e, então, realizou-se a partição das saponinas modificadas com
butanol, parando a reação. Em seguida, o extrato butanólico foi lavado com
água para remoção de açúcares residuais e, então, partiu-se para a
rotoevaporação e liofilização do extrato rico em saponinas modificadas.
O pH utilizado nas reações enzimáticas foi escolhido após a

determinação das concentrações finais de açúcar (em equivalentes de glicose)
para tratamentos com as três em enzimas, nos pH´s 4, 5, 6 e 7. Utilizou-se
análise de variância (ANOVA) seguida de teste de Tukey para analisar a a
38
existência de diferença estatística entre as médias, com auxílio do software

Statistica 13.0.
4.2.3. Caracterização das Saponinas

A caracterização das saponinas e dos produtos obtidos na hidrólise enzimática
foi feita por HPLC-MS. A análise foi realizada pelo Laboratório de
Cromatografia do CENPES/ Petrobras, coordenado pelo químico Íris Medeiros
Junior. As amostras de saponinas (não-modificadas e modificadas) foram
solubilizadas em metanol e transferidas para o frasco de amostrador
automático, sendo diretamente injetadas no HPLC-MS (módulos positivo e
negativo). O sistema de HPLC utilizado (Agilent Technologies, modelo 1200) é
constituído por amostrador automático, degaseificador de solventes, bomba
quaternária e detector de ultravioleta (UV) por arranjo de diodos. Os principais
parâmetros da análise encontram-se descritos no Quadro 1.
Quadro 1: Parâmetros e condições analíticas da identificação das saponinas por HPLC-MS.
Parâmetro Condição
Vydac Guard Column C-18 + Zorbax XDB-C18 3,5

Pré-Coluna + Coluna:
µm, 4,6 x 150 mm.
Temperatura da coluna: Ambiente

Volume de injeção: 10 µL
Composição da fase móvel: Solvente A: Acetonitrila + Ácido acético 0,1%

Solvente B: Água + Ácido acético 0,1%
Gradiente de composição:
0 min 25% A / 75% B
3 min 25% A / 75% B
35 min 50% A / 50% B
37 min 100% A / 0% B
45 min 100% A / 0% B
47 min 25% A / 75% B
55 min 25% A / 75% B
Fluxo de fase móvel: 1,0 mL/min
Detector de UV:
Comprimento de onda 203 nm
Intervalo do espectro 190-400 nm
39
4.2.4. Concentração Micelar Crítica (CMC)

Mediu-se a transmitância a 450nm de soluções aquosas com
concentrações variando de 10 a 0,001g/L de saponinas (original e modificadas)
em espectrofotômetro Shimadzu modelo UV-1800. O ensaio foi feito em
duplicata, e a variação da transmitância com a concentração foi avaliada, para
se determinar a concentração micelar crítica.
4.2.5. Índice de Emulsificação (IE24)
Os índices de emulsificação da saponina original e das modificadas

enzimaticamente foram determinados segundo Cooper & Goldenberg (1987) e
Sarubbo et al. (2006). Adicionaram-se 4mL de solução aquosa de saponinas
(0,1 e 1g/L) a 4mL de óleo de soja, agitando-se em vórtex por dois minutos a
2500 rpm, formando uma emulsão. O IE 24 é calculado como a razão entre a
altura em emulsão após 24 horas e a altura total de mistura. Os ensaios foram
feitos em duplicata. Utilizou-se análise de variância (ANOVA) seguida de teste
de Tukey para analisar a a existência de diferença estatística entre as médias,
com auxílio do software Statistica 13.0.
4.2.6. Atividade Antimicrobiana das Saponinas do Juá
A atividade antimicrobiana das saponinas do juá foi determinada pelo

método padrão internacional de microdiluição, de acordo com as normas M27-
A2 (NCCLS, 2002a) e M7-A6 (NCCLS, 2003), do CLSI/NCCLS (Clinical and
Laboratory Standards Institute). Este método baseia-se na inoculação de uma
suspensão de micro-organismos (bactérias, fungos ou leveduras) em placas de
96 poços tipo ELISA, contendo meio de cultura específico para bactérias
(Müller-Hinton), fungos ou leveduras (RPMI-1640).
Antes da inoculação, adicionou-se a solução de saponina de juá ao meio

de cultura, fazendo-se diluições sucessivas que resultaram em uma faixa de
concentração de saponina no meio que variou de 40 a 0,02 mg/mL para
bactérias e de 20 a 0,01 mg/mL para leveduras. A Figura 9 mostra o esquema
do método de microdiluição.
40
Figura 9. Esquema ilustrativo do método de microdluição para determinação da MIC.

Fonte: SANTOS, 2013.
A atividade antimicrobiana da saponina do juá foi testada para os micro-

organismos listados no Quadro 2, gentilmente cedidos pela Coleção de
Microrganismos de Referência em Vigilância Sanitária-CMRVS, FIOCRUZ-
INCQS, Rio de Janeiro, RJ. Através do método descrito, é possível determinar
a concentração inibitória mínima (CIM), ou seja, a menor concentração de
saponina capaz de inibir o crescimento microbiano. A CIM é determinada
visualmente, 24 horas após a incubação da placa de 96 poços, pela turvação
e/ou adição de corante resazurina (0,005% em tampão fosfato-salino pH 7.2).
Quadro 2: Micro-organismos utilizados na determinação de atividade antimicrobiana.
Salmonella choleraesuis (ATCC 10708)

Gram negativas Escherichia coli (ATCC 8739)
Bactérias Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)
Staphylococcus aureus (ATCC 6538)
Gram positivas
Bacillus subtilis (ATCC 6633)
Levedura Candida albicans (ATCC 10231)
4.2.6.1. Cultivo e Preparo do Inóculo

Existem diferenças no método para cada tipo de micro-organismo, não
só em razão dos diferentes tempos e temperaturas ótimos de crescimento, mas
41
também em relação ao preparo do inóculo a ser utilizado. Esta etapa apresenta

singularidades quando se trata de bactérias, leveduras ou fungos, no que
concerne à determinação da turbidez padrão da suspensão e à seguinte
diluição da mesma.
No caso de bactérias, o inóculo é preparado a partir de uma subcultura

(repique) de 24 horas, incubada à 35 ± 2 ºC em ágar BHI. Com auxílio de uma
alça microbiológica esterilizada, suspende-se uma quantidade de células em
água destilada estéril. A densidade celular dessa suspensão deve ser ajustada
por espectrofotômetro, a fim de obter-se turbidez equivalente a de uma
solução-padrão da escala de McFarland igual a 0,5. A absorbância dessa
solução deve variar entre 0,08 e 0,10, à 625nm. Essa suspensão padronizada
apresenta concentração de células bacterianas de aproximadamente 1x108
UFC/mL. A fim de se obter uma concentração final, no poço, de 5x105 UFC/mL,
a suspensão padronizada é diluída 1:20 em meio Müller-Hinton e, finalmente,
adiciona-se10µL dessa suspensão diluída a cada poço que contém 100µL de
meio já com o agente antimicrobiano.
No caso da levedura (C. albicans), o inóculo foi preprarado a partir de

subcultura de 24h incubada à 35ºC em ágar Sabouraud-dextrose. Foi feita a
suspensão de células em água, da mesma forma descrita aneriormente, porém
a leitura da turbidez para fungos e leveduras é feita a 530nm. Dilui-se a
suspensão-padrão 1000 vezes (para leveduras) e, finalmente, adicionam-se
100µL de inóculo a cada poço (contendo 100µL de meio já com a substância
teste), de forma que a concentrção final de células seja de aproximadamente
5x102 a 2,5x103 UFC/mL.
42
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. EXTRAÇÃO E HIDRÓLISE TOTAL DAS SAPONINAS
5.1.1. Obtenção do Extrato Rico em Saponinas

A extração, realizada a partir do caule do juá, produziu um extrato
liofilizado rico em saponinas: um sólido de cor amarela-clara, com rendimento
próximo ao descrito na literatura, em torno de 2% em massa. Esse foi o produto
de partida para o estudo descrito neste trabalho.
5.1.2. Hidrólise Total das Saponinas

A Figura 10 mostra a curva-padrão de glicose (0 a 10µmol/mL) para o
método DNS, utilizada na determinação da concentração de açúcares
redutores das amostras. A absorbância foi lida à 540nm em espectrofotômetro
Shimadzu modelo UV-1800.
Curva-padrão DNS
1,4
1,2
1
y = 0,1354x - 0,0586
0,8 R² = 0,9938
Abs
0,6
0,4
0,2
0
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00
-0,2
Concentração de glicose (µmol/mL)
Figura 10. Curva-padrão de calibração do método DNS.

Através da curva-padrão foi possível determinar a concentração total de

açúcares redutores, em equivalentes de glicose, no meio reacional, após
43
hidrólise com ácido clorídrico 4N, por 48 horas à temperatura ambiente. A

hidrólise ácida deveria ser capaz de quebrar todas as ligações glicosídicas,
liberando a aglicona e os monossacarídeos presentes na molécula. Quando
hidrolizou-se a solução de saponina na concentração de 0,1% (1g/1000mL),
obteve-se, ao final da reação, uma concentração de açúcares redutores igual a
2,55 µmol/mL em equivalentes de glicose. Quando a solução de saponina na
concentração de 1% (10g/1000mL) foi hidrolizada, obteve-se uma
concentração final de 14,08 µmol/mL, ou seja, 1,41 µmol/mL. g.
Esperava-se que a concentração final de açúcares redutores, partindo-

se da solução de saponina 1%, fosse aproximadamente 10 vezes maior que
aquela obtida para a saponina 0,1%. Entretanto, pela estequiometria da reação
e levando-se em consideração as diversas estruturas de saponinas
possivelmente presentes no juá, conclui-se que os dois valores de
concentração obtidos encontram-se na faixa esperada.
Se considerarmos a estrutura da saponina 3, um jujubogosídeo com

duas sulfatações, de massa igual a 1055 g/mol e que possui 3 moléculas de
açúcar por esqueleto, tem-se que a hidrólise dessa saponina geraria 2,84
µmol/mL.g de açúcares redutores (3 vezes a concentração de saponina, em
µmols). Já a saponina 4, o joazeirosídeo A, que possui massa igual a 666 g/mol
e apenas uma glicose ligada ao esqueleto, produziria uma concentração final
de açúcares redutores igual a 1,5 µmol/mL.g.
Apesar dos valores obtidos na prática estarem bem próximos a esses

valores teóricos, não se pode afirmar se a hidrólise foi total, devido à
diversidade estrutural das saponinas no juá e à falta de conhecimento das
proporções de cada tipo de estrutura. Entretanto, os valores obtidos foram
utilizados apenas como uma forma de comparação, a fim de balizarem os
resultados das hidrólises enzimáticas, os quais não devem ultrapassar, em
termos de concentração final de açúcares, o resultado da hidrólise ácida.
5.2. MODIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DAS SAPONINAS

As reações enzimáticas foram realizadas nas condições pré-definidas:
temperatura igual a 50˚C, rotação de 200 rpm, concentração de saponina igual
a 1% e enzima a 5% (v/v). O pH=5 foi selecionado como ótimo para a atividade
44
das enzimas, após as reações serem testadas em quatro diferentes pHs,

mantendo-se constantes as demais variáveis, como mostra a Tabela 1.
Tabela 1: Concentração final (em µmols equivalentes em glicose/mL) de açúcares redutores no meio
após hidrólise enzimática (*).
Enzima pH=3 pH=4 pH=5 pH=6
Celluclast 1.5L 3,18 d ± 0,30 4,84 a,b,c

± 0,51 6,10 a ± 0,63 5,04 a,b
± 0,43
Ultrazym AFPL b,c b,c b,c c,d

4,37 ± 0,28 4,37 ± 0,22 4,74 ± 0,27 3,69 ± 0,21
b,c b,c a,b b,c
Viscozyme L 4,56 ± 0,02 4,72 ± 0,17 5,25 ± 0,15 4,77 ± 0,15
*Valores representam a média da triplicata, acrescida do desvio-padrão.

Letras iguais representam ausência de diferença estatística, a um nível de 5% de significância, segundo o
teste de Tukey.
Os resultados da Tabela 1 mostram que, para a enzima Celluclast, o pH

igual a 3 foi o que menos favoreceu a reação. O pH não influenciou
significativamente as reações catalisadas pelas enzimas Ultrazym e
Viscozyme, mas o pH=5 foi considerado como ótimo para a Celluclast. Desta
forma, selecionou-se o pH igual a 5 para todas as reações enzimáticas para
obtenção de saponinas modificadas. Observa-se, também, que a enzima
Celluclast (pH=5) obteve a maior concentração final em açúcares redutores
dentre as enzimas utilizadas.
Em relação à hidrólise ácida da saponina na concentração de 1%, as

enzimas Celluclast 1.5L, Ultrazym AFPL e Viscozyme L apresentaram
percentuais de hidrólise iguais a 43, 34 e 37%, respecivamente, em um tempo
de reação igual a 24 horas. Esse intervalo de tempo foi adotado como tempo
mínimo de reação para a produção propriamente dita das saponinas
modificadas. O ponto final de reação foi determinado, observando-se a
variação da concentração de açúcares no meio reacional, por DNS.
5.3. CARACTERIZAÇÃO DAS SAPONINAS

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é uma das técnicas
mais indicadas na determinação de saponinas, entretanto a detecção por UV
se limita aos comprimentos de onda entre 200 e 210 nm e necessita da
utilização de padrões (Oleszek, 2002). A espectrometria de massas, acoplada
45
a HPLC, apresenta-se como mais uma ferramenta na elucidação de estruturas

dos compostos analisados.
Na espectrometria de massas, ocorre a ionização dos compostos, e os

íons gerados são agrupados de acordo com sua razão massa/carga (m/z), na
forma de um espectro que indica a abundância de cada íon formado, de acordo
com essa razão. Durante a ionização por electrospray (ESI), pode ocorrer a
formação de íons moleculares (pela perda ou ganho de elétrons), pseudo-
moleculares (pela protonação ou desprotonação da molécula) ou moléculas
cationizadas/anionizadas através de coordenação com íons metálicos (Na + , K+)
ou cloreto (Crotti et al., 2006).
O espectro UV das amostras no comprimento selecionado (203 nm) é

mostrado na Figura 11. Foram analisadas amostras liofilizadas da saponina do
juá não-modificada (curva azul), saponina modificada pelas enzimas Celluclast
(curva vermelha), Ultrazym (curva verde) e Viscozyme (curvas rosa e bege).
*DAD1 A, Sig=203,2 Ref=300,100 (SAPONINAS_1609\SAPONINAS 080916 2016-09-08 10-33-54\091-0103.D- SAPONINAS_1609\SAPONIN
mAU
80
60
40
20
0 10 20 30 40 50 min
Figura 11. Cromatograma das amostras de saponinas a 203 nm.
Através do cromatrograma da Figura 11, nota-se que as saponinas não-

modificadas e as modificadas pelas enzimas Celluclast e Ultrazym apresentam
cromatogramas muito semelhantes, enquanto as amostras modificadas pela
enzima Viscozyme praticamente não apresentaram picos no comprimento de
onda selecionado.
46
Apesar de não ter havido diferença em termos dos tempos de retenção,

é possível perceber que alguns picos sofreram mudança de intensidade após a
reação enzimática. A saponina modificada por Celluclast apresentou picos
ligeiramente mais intensos nos tempos 28-29 e 33 minutos. Já no tempo de
retenção igual a 39 minutos, a saponina não-modificada apresenta um pico
ligeiramente mais intenso, indicando a possibilidade da reação ter modificado a
substância em questão. Entre 40 e 44 minutos, a saponina modificada com a
enzima Celluclast apresenta picos de maior intensidade que as demais, como
se observa na Figura 12.
mAU
35
30
25
20
15
10
-5
30 32 34 36 38 40 42 44 46 min
Figura 12. Cromatograma em escala aumentada, do tempo 30 a 48 minutos.
Analisaram-se, então, nos modos positivo e negativo, os espectros de

massas dos picos que apresentaram tais variações de intensidade, bem como
daqueles que, apesar de não apresentarem mudança de intensidade entre as
três amostras, foram os mais significativos para todas elas (picos com tempos
de retenção 17, 20 e 24,5 minutos). Os dados das razões m/z das saponinas
da literatura e das suas respectivas agliconas encontram-se no Quadro 3.
47
Quadro 3. Dados de m/z de saponinas de jua
m/z m/z
Saponina Denominação Referência
(saponina) (aglicona)
Jujubogenina 3-O-α-L-arabinofuranosil- Higuchi et al.,

1 (12)-[β-D-glicopiranosil (13)]-α- 897 472 1984; Schühly
arabinopiranosídeo et al., 2000
Jujubogenina 3-O-α-L-arabinofuranosil-
Higuchi et al.,
2 (12)-[β-D-glicopiranosil-4-O-sulfato 977 472
1984
(13)]-α-arabinopiranosídeo
Jujubogenina 3-O-α-L-arabinofuranosil-
Higuchi et al.,
3 (12)-[β-D-glicopiranosil-4-O-sulfato 1055 472
1984
(13)]-α-arabinopiranosídeo-3-O-sulfato
Schühly et al.,
4 Joazeirozídeo A 666 504
2000
Schühly et al.,
5 Joazeirozídeo B 1092 504
2000
Schühly et al.,
6 Lotosídeo A 1078 487
2000
Os picos de tempos de retenção 17 e 20 minutos possuem intensidades

bem próximas para as três amostras. O espectro de massas (Figuras 13)
mostra a presença de um pico de razão m/z 1078, que pode representar a
saponina 6 (Schühly et al., 2000), no tempo de retenção de 17 minutos. Os
íons de m/z maiores podem indicar a presença de outra saponina
(desconhecida) com mesmo tempo de retenção.
*MSD2SPC, time=17.175of C:\CHEM32\1\DATA\SAPONINAS_1609\SAPONINAS0809162016-09-0810-33-54\091-0103.D ES-API, Ne
100 Max: 568299

1077.4
80
1078.4
60
1113.4
40
1191.4
20
1140.4
1080.4
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
Figura 13. Espectro de massa do pico de tr=17,117 no modo negativo.

48
N tr igual a 20 minutos (Figura 14), o pico de m/z 1092 pode representar

a saponina 5 (Schühly et al., 2000), enquanto os demais podem representar
saponinas maiores até então desconhecidas. Nota-se que, tanto no pico de tr
igual a 17 minutos como no de 20 minutos, a diferença entre o íon de maior m/z
e o pico de massa correspondente à da saponina da literatura (1078 e 1092,
respectivamente) é igual a 113. Daí pode surgir a hipótese de que estes picos
poderiam conter também saponinas com estruturas semelhantes às das
saponinas 5 e 6, com um grupamento a mais.
100 Max: 570025
1091.4
80
1092.4
60
40 1127.4
20
1205.4
1130.4
1094.4
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
Figura 14. Espectro de massas do pico de tr=20,496 no modo negativo.
Para o tempo de retenção de 24,5 minutos, no modo negativo (Figura

15), o pico m/z 977,2 pode representar a saponina 2, também identificada no
trabalho de Ribeiro (2012).
100
977.2
Max: 1.50877e+006
80
978.2
60
40
979.2
535.2
20
980.2
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

49
Até aqui, pode-se sugerir que os três maiores picos do cromatograma, t r

17, 20 e 24,5 minutos, referem-se às saponinas 6, 5 e 2, respectivamente. Tal
conclusão é fortalecida pela análise da polaridade das moléculas, que
evidencia que, quanto menos polar, maior o seu tempo de retenção.
Observando a maior intensidade de picos após os 24 minutos para a enzima
Celluclast, pode-se inferir que ela produziu compostos menos polares, que
poderiam ser saponinas com menos açúcares.
O espectro de massas no modo negativo do pico de t r= 29,354 minutos

(Figura 16) detecta a presença do íon de razão m/z 991, que Ribeiro (2012)
analisou por MS/MS, sugerindo a possível presença de uma pentose e um
grupo sulfato. O íon molecular com m/z igual a 845 possui a massa da
saponina 2 menos a massa do anel arabinofuranosil. A presença de uma
saponina parcialmente hidrolisada neste pico explicaria a maior intensidade
deste para a saponina tratada com a enzima Celluclast.
100
845.2
Max: 374716
991.2
80
60
846.2
992.2
40
1049.2
535.2
977.2
20
1051.2
848.2
979.2
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
O pico de tr igual a 30,5 minutos não representa uma substância pura,

uma vez que apresenta bifurcação, o que dificulta a sua identificação.
Entretanto, através de seu espectro de massas no modo positivo (Figura 17), a
presença do íon com m/z igual a 487 pode indicar a aglicona da saponina 6 do
juá (lotosídeo A), que é a única da literatura que apresenta esse tipo de
aglicona. Se considerado o íon de m/z igual a 895, tem-se uma diferença de
180 em relação à massa da saponina 6, o que pode representar a saída de
uma glicose da cadeia de açúcares. Essa possível saponina 6 parcialmente
hidrolisada, entretanto, estaria presente já na amostra original.
50
*MSD1SPC, time=30.471of C:\CHEM32\1\DATA\SAPONINAS_1609\SAPONINAS0809162016-09-0810-33-54\091-0103.D ES-API, Po
100
429.2
487.2
Max: 71674
80
60
545.4
488.2
430.0
40
733.4
619.4
355.0
399.2
546.2
20
895.4
782.4
751.4
588.4
471.2
304.8
621.4
951.2
251.2
438.0
506.2
0
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
Figura 17. Espectro de massas do pico de tr=30,5 minutos no modo positivo.
No tempo igual a 33,5 minutos (Figura 18), tem-se íons com m/z
semelhante à das agliconas das saponinas 2 e 6, e o íon mais abundante (m/z
587) representaria a aglicona de alguma saponina desconhecida.
*MSD1SPC, time=33.626of C:\CHEM32\1\DATA\SAPONINAS_1609\SAPONINAS0809162016-09-0810-33-54\091-0103.D ES-API, Po
100
587.4
Max: 332588
80
60
588.4
40
487.4
20
589.4
473.2
225.2
288.2
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
Figura 18. Espectro de massas do pico de tr=33,5 minutos no modo positivo.
Logo, observa-se que houve, após a reação enzimática com Celluclast,

um aumento na proporção de saponinas hidrolisadas e de agliconas. Fato este
observado de forma menos intensa para a enzima Ultrazym. A Celluclast
contem celulases capazes de hidrolisar ligações do tipo β-1,4, presentes no
ineterior das cadeias de açúcares das saponinas do juá, o que explica a
produção de compostos parcialmente hidrolisados. Com relação à Viscozyme,
esse complexo enzimático possui hemicelulases capazes de hidrolisar ligações
do tipo α-1,3, que é justamente o tipo de ligação entre a aglicona e a cadeia de
açúcares. Desta forma, é possível que esse complexo enzimático tenha
hidrolisado toalmente as saponinas do juá.
51
5.4. CONCENTRAÇÃO MICELAR CRÍTICA
As Figuras 19 a 22 mostram os resultados do método turbidimétrico para

determinação da CMC. A partir da variação da transmitância das soluções de
saponinas pela concentração, determinou-se a concentração em que as
moléculas iniciam a formação de micelas.
O início da formação de micelas, para todas as saponinas testadas, se

deu em concentração próxima a 1 g/L, sendo 1,2 g/L para a não-modificada,
0,8 para a modificada pela enzima Viscozyme, 1,6 g/L para a Ultrazym e 1,3
g/L para a Celluclast. Não houve, portanto, variação significativa na CMC
devido ao tratamento enzimático.
CMC Saponina não-modificada

100,0%
95,0%
90,0%
Transmitânca (%)
85,0%
80,0%
75,0%
70,0%
65,0%
60,0%
55,0%
50,0%
0,001 0,01 0,1 1 10
Concentração (g/L)
Figura 19. Determinação da CMC pelo método turbidimétrico para a saponina não-modificada.
52
CMC Saponina modificada Viscozyme

100,0%
90,0%
80,0%
Transmitância (%)
70,0%
60,0%
50,0%
40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
0,0%
0,00 0,01 0,10 1,00 10,00
Figura 20. Determinação da CMC pelo método turbidimétrico para a saponina modificada pela Viscozyme
CMC Saponina modificada Ultrazym

100,0%
95,0%
90,0%
Transmitânca (%)
85,0%
80,0%
75,0%
70,0%
65,0%
60,0%
55,0%
50,0%
0,001 0,01 0,1 1 10
Concentração g/L)
Figura 21. Determinação da CMC pelo método turbidimétrico para a saponina modificada pela Ultrazym.
53
CMC Saponina modificada Celluclast

100,0%
90,0%
80,0%
Transmitância (%)
70,0%
60,0%
50,0%
40,0%
30,0%
20,0%
0,001 0,01 0,1 1 10
Figura 22. Determinação da CMC pelo método turbidimétrico para a saponina modificada pela Celluclast.
5.5. ÍNDICE DE EMULSIFICAÇÃO (IE24)

Os resultados para o índice de emulsificação das saponinas a 0,1 e 1
g/L são mostrados na Figura 23. Os resultados indicaram que a modificação
enzimática não impactou o poder de emulsificação das saponinas, uma vez
que os valores encontrados não diferiram estatisticamente, segundo a análise
ANOVA, ao nível de significância de 5%.
IE24
60,0%
48,5%
50,0% 44,9% 46,1%
43,4% 42,4% 44,1%
42,6%
39,7%
40,0%
30,0% 0,1 g/L
20,0% 1 g/L
10,0%
0,0%
Saponina não- Saponina mod. Saponina mod. Saponina mod.
modificada Viscozyme Ultrazym Celluclast
Figura 23. Índice de emulsificação 24 horas para a saponina não-modificada e para as modificadas pelas
enzimas Viscozyme, Ultrazym e Celluclast, nas concentrações 0,1 e 1 g/L.
54
Os índices de emulsificação encontrados para as saponinas do juá são

ligeiramente inferiores aos encontrados por Ribeiro (2012) para os surfactantes
comerciais Span 20 e Tween 80, nas mesmas condições: 53%. O aumento de
concentração da saponina de 0,1 para 1 g/L também não resultou em um
melhor índice de emulsificação. Desta forma, as saponinas do juá, apesar de
reduzirem a tensão superfcial da água e serem capazes de formar espumas
persistentes, no que tange à estabilidade de emulsões, ainda neces sitariam ser
utilizadas em conjunto com outro surfactante. Entretanto, cabe ressaltar que o
volume emulsionado se manteve estável por mais de 96 horas.
5.6. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS SAPONINAS DO JUÁ

As saponinas do juá não-modificadas não apresentaram atividade
antibacteriana, uma vez que não foram capazes de inibir completamente o
crescimento das bactérias testadas em nenhuma das concentrações avaliadas.
Entretanto, pode-se dizer que as moléculas tiveram algum efeito no
crescimento bacteriano, uma vez que, ao se adicionar o corante resazurina,
identificou-se visualmente um gradiente de cor que indicou que, quanto maior a
concentração de saponina, mais lentamente o corante era oxidado. Uma vez
que o corante é oxidado pelo metabolismo dos micro-organismos, conclui-se
que havia uma menor concentração de células nos poços mais concentrados
em saponina. Esse efeito foi observado apenas para as bactérias E. coli e S.
choleraesuis.
As saponinas do juá apresentaram efeito antifúngico contra a levedura

Candida albicans, sendo possível se determinar a MIC igual a 0,313 mg/mL,
um resultado bastante próximo ao 0,156 mg/mL obtido por Ribeiro (2012). Essa
variação corresponde à diferença de concentração relativa a um poço (uma
diluição 1:2), o que encontra-se dentro do desvio aceitável pelo método.
De acordo com Aligiannis et al. (2001) e Duarte et al. (2005), valores de

MIC de até 0,5 mg/mL representam um forte poder antimicrobiano; entre 0,5 e
1,5 mg/mL, poder moderado; e, acima de 1,6 mg/mL, fraco. Sendo assim,
testes de diluições sucessivas com antimicrobianos geralmente partem de
55
concentrações iniciais baixas. Entretanto, no presente trabalho, foi utilizada

uma concentração inicial de saponina bastante elevada (20 mg/mL), o que
possibilitou a avaliação da atividade antimicrobiana em concentrações acima e
abaixo da CMC, já que a molécula em questão é também um surfactante.
É certo que a CMC influencia diretamente quase todas as propriedades

fisico-químicas das soluções de surfactantes, visto que as moléculas passam
de “livres” para a forma de micelas. A relação CMC/atividade antimicrobiana foi
estudada por Cornellas et al. (2011), que concluiu que havia uma relação linear
entre a MIC e o logaritmo da CMC para líquidos iônicos baseados nos cátions
imidazol e piridínio com diferentes comprimentos de cadeia carbônica.
Cornellas et al. (2011) observaram que, quanto maior a cadeia carbônica do
cátion imidazol ou piridínio, maior o seu poder surfactante e sua atividade
antimicrobiana. Os autores sugeriram que, uma vez que os valores de MIC
obtidos encontravam-se abaixo da CMC, as moléculas livres, e não a forma
micelar, seriam as responsáveis pelo efeito antimicrobiano dos compostos
surfactantes. Entretanto, o referido trabalho não avaliou como se comportaria a
atvidade antimicrobiana desses compostos acima da CMC.
No presente estudo, observou-se que não houve inibição do crescimento

desta levedura nas concentrações de saponinas de 20 até 5 mg/mL (acima da
CMC). A inibição começou a ocorrer na concentração de 2,5 mg/mL até a
concentração de 0,313 mg/mL (MIC). Esses resultados corroboram a hipótese
de que o poder antimicrobiano de uma molécula com caráter anfifílico dependa
não só da sua concentração, como também da forma em que ela se encontra
em solução: micelar ou livre.
As saponinas modificadas enzimaticamente pelas três enzimas

comerciais utilizadas não apresentaram melhora na atividade antibacteriana,
como também não apresentaram o efeito antifúngico relacionado com a CMC
observado para a saponina não-modificada contra a levedura Candida
albicans. Sendo assim, pode-se concluir que a diminuição da cadeia lateral de
açúcares das saponinas do juá dimunui a sua atividade inibitória de
crescimento microbiano.
O aumento da bioatividade com a diminuição da cadeia lateral

observado para saponinas de esqueleto oleanano (Santiago et al., 2005) não
56
foi observado no presente estudo. Os esqueletos oleananos das saponinas

avaliadas no estudo citado apresentavam efeito biológico larvicida, efeito esse
que aumentava na medida em que a molécula se aproximava da estrutura do
esqueleto isolado.
Esses resultados indicam que os efeitos biológicos esperados são

consequências tanto da estrutura do esqueleto lipofílico e de suas
singularidades, como presença de carboxilas livres e duplas ligações em
posições específicas, como da quantidade e tipo de açúcares presentes.
57
6. CONCLUSÕES E SUGESTÕES
Este trabalho avaliou as propriedades surfactantes e o poder
antimicrobiano das saponinas do juá. Como já havia sido reportado por Ribeiro
(2012), essas moléculas apresentam um conjunto de características que as
tornam alvos de interesse científico. Possuem aplicabilidade como
surfactantes, ainda que sozinhas não sejam capazes de estabilizar grandes
volumes emulsionados. Por outro lado, a fase emulsionada se manteve estável
por um longo período de tempo (superior a 96 horas).
Quanto ao poder antimicrobiano, as saponinas do juá se mostraram sem

atividade contra todas as bactérias testadas. Entretanto, apresentaram
atividade contra Candida albicans ATCC 10231, sendo identificada neste
trabalho uma relação entre o poder antimicrobiano e a CMC, mostrando que a
forma em que as moléculas do se encontram (livres ou em micelas) tem
impacto, não somente nas propriedades da solução, como também na possível
atividade biológica do biossurfactante.
A enzima comercial Celluclast 1,5L, foi mais eficiente na hidrólise das

saponinas do que a Ultrazym AFPL, indicando que celulases são mais
indicadas para a quebra das ligações presentes nas jujubogeninas do que as
pectinases. Não foi possível identificar os produtos da reação com a Viscozyme
L pelo método cromatográfico utilizado, o que pode ser indício de que essa
enzima provocou a hidrólise total das saponinas.
As modificações enzimáticas da saponina, com redução da cadeia

lateral de açúcares, não impactaram significativamente o poder surfactante.
Entretanto, houve diminuição na atividade contra C.albicans. Observou-se,
portanto, uma redução da atividade biológica com a redução da cadeia de
açúcares. Algumas sugestões seguindo esta linha de pesquisa podem ser
feitas. São elas:
 Estudo mais aprofundado da cinética das reações enzimáticas, com

avaliação da influência de diferentes concentrações enzima/substrato e
demais parâmetros;
 Aplicação de diferentes reações enzimáticas que possam modificar a
estrutura da aglicona, tornando-a mais lipofílica para aumentar seu
58
poder surfactante ou adicionando grupos funcionais que possam ter

algum efeito na bioatividade da molécula;
 Aplicação de técnicas que possam elucidar de forma detalhada a
estrutura dos produtos formados, como MS/MS ou RMN;
 Análises de toxicidade dos jujubosídeos;
 Testes de aplicação das saponinas em formulações alimentícias.
59
7. PERSPECTIVAS
A cultura da Química Verde, ao defender a aplicação de processos mais
limpos, com pouca ou nenhuma geração de subprodutos nocivos, uso de
catálise e de fontes renováveis de matéria-prima, impulsiona os bioprocessos,
que se utilizam de biocatalisadores, para a geração de produtos também
menos nocivos, menos tóxicos e mais biodegradáveis, que possam substituir
parcial ou totalmente os sintéticos convencionais.
Nesse sentido, este trabalho se encaixa e contribui para o conhecimento

acerca dos produtos naturais e suas potenciais aplicações tecnológicas, como
é o caso do uso das saponinas do juá como surfactantes de origem natural.
Essa procura por alternativas mais naturais é uma tendência em todos os
ramos industriais, em especial na área de alimentos, que, além da
preocupação ambiental que cabe a qualquer indústria química, ainda soma o
crescente anseio dos consumidores por uma alimentação mais saudável e
natural possível.
Sendo assim, a perspectiva é de um interesse crescente na área de

produtos naturais, que é uma das ciências mais antigas e também uma das
mais desconhecidas, devido ao imenso número de compostos presentes na
natureza. Estudar substâncias de origem natural, como as saponinas, através
da investigação de suas propriedades e da correlação destas com suas
estruturas, é o caminho para grandes descobertas científicas, e futuras
aplicações tecnológicas, das quais a humanidade poderá se beneficiar.
60
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Natalia Lyrio Dissertacao

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Universidade Federal do Rio de Janeiro

NATÁLIA NEY LYRIO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E DO PODER

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E DO PODER

Orientadora: Profa. Maria Alice Zarur Coelho, D.Sc.

Co-orientador: Prof. Bernardo Dias Ribeiro, D.Sc.

Avaliação da atividade antimicrobiana e do poder surfactante das

Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade Federal do Rio de

Orientadores: Maria Alice Zarur Coelho e Bernardo Dias Ribeiro.

1. saponinas. 2. juá. 3. enzimas. 4.antimicrobiano. 5. surfactante. I. Coelho, Maria

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E DO PODER

LYRIO, Natália Ney. Avaliação da atividade antimicrobiana e do poder

Palavras-chave: Saponinas, juá, hidrólise, enzimas, surfactantes,

LYRIO, Natália Ney. Antimicrobial and surfactant activities of jua (Ziziphus

Keywords: Saponins, jua, hydrolysis, enzymes, surfactants, antimicrobial.

Tabela 1. Concentração final (em µmols equivalentes em glicose/mL) de

Figura 1. Disposição preferencial dos surfactantes nas interfaces ................................. 19

ATCC American Type Culture Collection

CMC Concentração Micelar Crítica

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................... 17

2.1. SURFACTANTES ............................................................................................. 17

2.1.1. Classificação dos Surfactantes............................................................... 17

2.1.1.1. Quanto à Natureza da Parte Hidrofílica................................................... 17

2.1.1.2. Sintéticos x Naturais.................................................................................. 18

2.1.2. Comportamento dos Surfactantes em Solução ................................... 19

2.1.3 Emulsões ..................................................................................................... 21

2.1.4. Formação de espuma ................................................................................ 22

2.2. SAPONINAS ..................................................................................................... 22

2.2.1. Classificação ................................................................................................ 23

2.2.2. Fontes de Saponinas ................................................................................. 25

2.2.3. Propriedades ................................................................................................ 25

2.2.3.1. Poder Surfactante...................................................................................... 26

2.2.3.2. Interação com esteróis .............................................................................. 26

2.2.3.3. Atividade Antimicrobiana .......................................................................... 27

2.2.4. Saponinas do Juá ...................................................................................... 28

2.2.5. Modificação Estrutural das Saponinas........................................................ 31

2.2.5.1. Enzimas como Bioconversores ................................................................ 31

3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 34

4. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 35

4.1. MATERIAIS ....................................................................................................... 35

4.2. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS .......................................................... 35

4.2.1. Extração e Hidrólise Total das Saponinas ............................................ 35

4.2.1.1. Obtenção do Extrato Rico em Saponinas ............................................... 35

4.2.2. Modificação Enzimática das Saponinas ................................................. 37

4.2.3. Caracterização das Saponinas ................................................................. 38

4.2.4. Concentração Micelar Crítica (CMC) ....................................................... 39

4.2.5. Índice de Emulsificação (IE24) ................................................................... 39

4.2.6. Atividade Antimicrobiana das Saponinas do Juá ................................. 39

4.2.6.1. Cultivo e Preparo do Inóculo .................................................................... 40

5.1. EXTRAÇÃO E HIDRÓLISE TOTAL DAS SAPONINAS .............................. 42

5.1.1. Obtenção do Extrato Rico em Saponinas .............................................. 42

5.1.2. Hidrólise Total das Saponinas.................................................................. 42

5.2. MODIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DAS SAPONINAS ....................................... 43

5.3. CARACTERIZAÇÃO DAS SAPONINAS ....................................................... 44

5.4. CONCENTRAÇÃO MICELAR CRÍTICA ........................................................ 51

5.5. ÍNDICE DE EMULSIFICAÇÃO (IE24) .............................................................. 53

5.6. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS SAPONINAS DO JUÁ .................... 54

6. CONCLUSÕES E SUGESTÕES ............................................................................ 57

O nome “saponina” está relacionado à capacidade dessas substâncias

As saponinas, assim como os fosfolipídeos e algumas proteínas ou

Encontradas naturalmente em alguns alimentos, como alho-poró, cebola,

com outro surfactante, na estabilização de emulsões (Ribeiro, 2012).

A aplicação das saponinas, entretanto, vai além de sua atuação como

As propriedades funcionais, bem como as propriedades físico-químicas,