Marselle Marmo Do Nascimento Silva

MARSELLE MARMO DO NASCIMENTO SILVA
BEBIDAS NÃO ALCOÓLICAS: AVALIAÇÃO DA QUALIDADE

MICROBIOLÓGICA E DO EMPREGO DE ADITIVOS
Rio de Janeiro
2020
Marselle Marmo do Nascimento Silva
BEBIDAS NÃO ALCOÓLICAS: AVALIAÇÃO DA QUALIDADE

Tese de Doutorado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em
Ciências de Alimentos, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como
requisito parcial à obtenção do título
de Doutor em Ciências de Alimentos
Orientadores: Profa. Dra. Maria Alice Zarur Coelho

Profa. Dra. Karen Signori Pereira
Prof. Dr. Daniel Perrone Moreira
Rio de Janeiro
2020
Marselle Marmo do Nascimento Silva
BEBIDAS NÃO ALCOÓLICAS: PANORAMA SOBRE QUALIDADE

Tese de Doutorado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em
Ciências de Alimentos, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como
requisito parcial à obtenção do título
de Doutor em Ciências de Alimentos
Aprovada por
_____________________________________________________
Presidente: Profª. DSc. Maria Alice Zarur Coelho (EQ/UFRJ)
_____________________________________________________
Orientadora: Profª. DSc. Karen Signori Pereira (EQ/UFRJ)
_____________________________________________________
Orientador: Prof. DSc. Daniel Perrone Moreira (IQ/UFRJ)
_____________________________________________________
Prof. DSc. Alexandre Guedes Torres (IQ/UFRJ)
_____________________________________________________
Prof. DSc. Lauro Luís Martins Medeiros de Melo (IQ/UFRJ)
_____________________________________________________
Prof. DSc. Marcelo Cristianini (FEA/ UNICAMP)
_____________________________________________________
Prof. DSc. Flávio Luis Schmidt (FEA/UNICAMP)
Rio de Janeiro
2020
AGRADECIMENTOS
Quando essa jornada começou, 4 anos atrás, eu não poderia ter ideia de
que sairia com muito mais do que uma tese. Foram anos de grandes, imensas
transformações. Hoje vejo que fui impulsionada a amadurecer e me tornar uma
pessoa muito diferente do que eu era. Aprendi, tropeçando em minhas
inseguranças, a ter que tomar decisões. Buscando direções, fui motivada a
orientar. De aluna, virei um pouquinho professora. Sem saber que eu era capaz,
comecei a atuar de verdade, modificar as coisas.
São tantas e tantas pessoas que viram tudo isso acontecer, tantas
pessoas que contribuíram, que não sei como vou expressar todo esse
sentimento.
No apoio diário, nos momentos de total descrença de que tudo isso seria
possível, está minha fortaleza, minha bússola, minha paz. Rafael, esse ano
completamos 10 anos de um casamento de parceria inegociável. Te dedico essa
tese, meu químico conselheiro.
Aos meus pais, Marcia e Iran, eu sempre agradeço pelo suporte
inabalável. Mesmo com tantas dúvidas sobre se seria possível, tanto psicológica
como financeiramente, continuar essa jornada, eu sempre tive um porto seguro
para aliviar esse peso. A menininha que eu fui ontem, entrega hoje essa tese
nas mãos de vocês como prova de que o esforço valeu a pena.
Felipe, meu irmãozinho, você sabe que essa tese também é sua. No dia
a dia do laboratório você sempre enxergou coisas boas onde eu só via caos.
Foram tantos puxões de orelhas para que eu aprendesse com meus erros!
Obrigada por sempre dizer o que eu precisava ouvir, doendo o quanto doesse.
Andressa e Tiago, essa amizade Sul-Sudeste-Nordeste me rendeu os
melhores momentos: os mais leves e ao mesmo tempo mais profundos. Até hoje
choro lágrimas nostálgicas e de agradecimento pelos momentos que tivemos.
Aquele nosso ditado nunca foi tão verdadeiro e eu cheguei até aqui.
Ariane, obrigada pelo tanto que você me ensinou como pessoa e como
pesquisadora. Você foi uma parceira e tanto em muitos momentos dentro e fora
do laboratório.
Mariana, sua alegria e seu carinho fizeram diferença para mim em
inúmeros momentos. Você secou minhas lágrimas muitas vezes e sempre disse
que ia passar. E passou mesmo, obrigada.
Júlio e Larissa, quantas risadas maravilhosas na mesa de almoço! Vocês
são pessoas inesquecíveis e únicas (mas se parecem mesmo com aqueles
popstars). Obrigada por me encherem de alegria mesmo nos dias nublados.
Bia, eu não imaginava que fosse achar alguém tão parecida comigo
assim. Olhando para você, eu entendi várias coisas sobre mim. Acho que o
mesmo aconteceu na volta. Obrigada pelos abraços e pelas conversas. Haja chá
de mulungu pra essa dupla!
A todos que são e foram do BIOSE, representados aqui por esses mais
próximos, eu agradeço eternamente pelo clima de ajuda mútua e compreensão.
Participar desse grupo foi um grande privilégio.
Thaís, você é uma das melhores parceiras de trabalho que já tive. Temos
sintonia e uma complementa a outra. Sorte a minha que vamos continuar juntas,
agora em outra jornada.
João, você é daquelas pessoas que silenciosamente colabora com os
outros. Todas as vezes que você me ajudou, na maioria das vezes pensando
que eu não vi, eu reparei. Sou grata a você.
A todos do MicrAlim, aqui representados pelos mais próximos, meu muito
obrigada.
Aos meus alunos Rafael, Daniele, Isabela, Danielle, Clarissa, Isabel,
Flávia, Aloysio e Aline por terem confiado em mim para ajuda-los. Eu desejo ter
contribuído de alguma forma para o crescimento de vocês.
Professora Maria Alice, por todos os momentos que entrei na sua sala
desesperada e sai com minha mente e meu coração calmos, eu agradeço. Sua
experiência de vida como mulher e como cientista me fizeram colocar muitas
coisas em perspectiva e ter um pouco mais de paciência, inclusive comigo
mesma.
Professora Karen, você foi o grande motor das minhas transformações.
Hoje eu vejo tudo que me trouxe tantas agonias e inseguranças no passado e
só consigo sentir gratidão. Obrigada por acreditar em mim quando nem eu
mesma sabia acreditar.
Professor Daniel, você para mim é uma grande inspiração por sua vontade
de saber e de ensinar, sua organização e sua capacidade de gerenciar tantas
coisas ao mesmo tempo com tanta elegância. Obrigada por ser um exemplo para
a profissional que eu desejo ser um dia.
A todos os meus professores, representados aqui pelos meus três
orientadores de tese, eu deixo meu muito obrigada por cada gota de
conhecimento que matou minha sede ao longo dos meus anos de formação.
Aos meus amigos, Natália, Felipe, Daniela, Gabriel, Sara, Carina,
Guilherme, Mariana, Bruna e Hívio por terem sido minha fuga, por terem mantido
minha sanidade com tanto carinho e tantas risadas. Não é trivial terminar uma
tese, mas com vocês por perto ficou muito mais fácil.
A energia suprema do Universo, por te me permitido viver essa
experiência de autoconhecimento e ter contribuído de alguma forma para a
sociedade.
“A menos que modifiquemos a nossa maneira de
pensar, não seremos capazes de resolver os problemas
causados pela forma como nos acostumamos a ver o
mundo” Albert Einstein
RESUMO
SILVA, Marselle Marmo do Nascimento. Bebidas não alcoólicas: avaliação da

qualidade microbiológica e do emprego de aditivos. Rio de Janeiro, 2020.
Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos) – Instituto de Química, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2020.
O mercado de bebidas não alcoólicas é um nicho a ser explorado, com potencial

crescimento devido a fatores como o crescimento populacional e a procura por
diversificação de produtos. Neste trabalho, foram realizadas análises
microbiológicas em bebidas não alcoólicas de uma marca brasileira e uma marca
boliviana. No caso da indústria brasileira, amostras de matérias-primas e
amostras ambientais foram obtidas. Como resultado, foram isoladas bactérias
Gram positivas, Gram negativas, leveduras e fungos filamentosos. Estes
resultados apontam para a falta de controle de processo e de padronização das
matérias-primas utilizadas.
A grande maioria das bebidas não alcoólicas possui aditivos em suas

formulações, visando impedir o crescimento microbiano, para aumento da
validade comercial do produto. Os principais aditivos utilizados são o ácido
benzóico e o ácido ascórbico, conservante e acidulante, respectivamente.
Contudo, durante o tempo de validade comercial do produto, estes compostos
tendem a reagir, formando benzeno, um composto de potencial carcinogêneo.
Soluções sintéticas contendo ácidos benzóico (500 mg.L-1) e ascórbico
(300 mg.L-1) nas concentrações usualmente empregadas pela indústria de
bebidas foram avaliadas durante 20 semanas, à 4, 25 e 40 °C. A formação de
benzeno aumentou conforme o aumento da temperatura e ademais, outros
compostos como fenol foram formados; também com potencial carcinogênico.
Ao longo do tempo e com o uso indiscriminado, diversas linhagens de micro-

organismos têm sido selecionadas e vêm se tornando resistentes a esses
aditivos. Este trabalho avaliou a atividade inibitória de seis ácidos orgânicos
(benzóico, sórbico, cítrico, ascórbico, málico e gálico) frente a micro-organismos
isolados de produtos comerciais deteriorados. Como busca de compostos
alternativos aos ácidos orgânicos, a capacidade antimicrobiana de seis
peptídeos sintéticos (FEFR, FEFEFRFK, FEFKFEFKK, FEFRFEFK,
FEFRFEFKK e FEFKFEFKGGGRGDS) também foi avaliada frente a micro-
organismos de importância na indústria alimentícia.
Palavras-chave: benzeno, deterioradores, bactérias acidófilas, conservantes,

peptídeos antimicrobianos
ABSTRACT
SILVA, Marselle Marmo do Nascimento. Non-alcoholic beverages: evaluation

of microbiological quality and use of additives. Rio de Janeiro, 2020. Tese
(Doutorado em Ciência de Alimentos) – Instituto de Química, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2020.
The soft drinks market is a niche to be explored, with potential growth due to
factors such as population growth and demand for product diversification. In this
work, microbiological analyses were performed on non-alcoholic beverages of a
Brazilian brand and a Bolivian brand. In the case of the Brazilian industry,
samples of raw materials and environmental samples were obtained. As results,
Gram positive, Gram negative, yeast and filamentous fungi were isolated. These
findings point to the lack of process control and standardization of raw materials
used.
The vast majority of non-alcoholic beverages have additives in their formulations,

aimed at preventing microbial growth, to increase the shelf life of the product. The
main ones used are benzoic acid and ascorbic acid, preservative and acidulate,
respectively. However, during the shelf life, these compounds tend to react,
forming benzene, a compound with carcinogenic potential. Synthetic solutions
containing benzoic (500 mg.L-1) and ascorbic (300 mg.L-1) acids in the
concentrations usually employed by the beverage industry were evaluated for 20
weeks, at 4, 25 and 40°C. The formation of benzene increased as the
temperature increased and in addition, compounds such as phenol were formed;
also with carcinogenic potential.
Over time and with indiscriminate use, several strains of microorganisms have
been selected and have become resistant to these additives. This work evaluated
the inhibitory activity of six organic acids (benzoic, sorbic, citric, ascorbic, malic
and gallic) against microorganisms isolated from deteriorated commercial
products. As a search for alternative compounds to organic acids, the
antimicrobial capacity of six synthetic peptides (FEFR, FEFRFK, FEFRFK,
FEFRFKK and FEFKFFKGGRGDS) was also evaluated against microorganisms
of importance in the food industry as pathogens or spoilage.
Keywords: benzene, spoilage, acidophilic bacteria, preservatives, antimicrobial
peptides
PUBLICAÇÕES RELACIONADAS A ESTA TESE
Resumos em congresso
PEREIRA, K. S.; SILVA, M. M. N; HOLANDA, V. L.; COELHO, M. A. Z. Case

Studies of Spoilage in Soft-drinks. In: Simpósio Latino Americano de Ciência de
Alimentos, 2019, Campinas. Anais do 13º Simpósio Latino Americano de Ciência
de Alimentos, 2019.
PEDROSA, L.; LOURENCO, H. S.; SILVA, M. M. N; PEREIRA, K. S; COELHO,

M. A. Z. Identificação de leveduras contaminantes em sucos e polpa de fruta
industrializados. In: 10ª Semana de Integração Acadêmica da UFRJ, 2019, Rio
de Janeiro. Anais do 10ª Semana de Integração Acadêmica da UFRJ, 2019.
ALMEIDA, D. M. M.; Souza, C. R.; SILVA, M. M. N.; PEREIRA, K. S. Avaliação

microbiológica de refrescos de frutas em embalagens estufadas: estudo de caso
em uma indústria de bebidas. In: 9ª Semana de Integração Acadêmica da UFRJ,
2018, Rio de Janeiro. Anais da 9ª Semana de Integração Acadêmica da UFRJ,
2018.
SILVA, M. M. N; SILVA, R. S.; CRUZ, T. A.; PINHO, M. B.; PEREIRA, K. S.;

COELHO, M. A. Z. Spoilage growth and benzene evaluation of Brazilian non-
carbonated guarana (Paullinia cupana) soft drinks. In: XI Congreso
Iberoamericano de Ingeniería de Alimentos (CIBIA 2017), 2017, Valparaíso. XI
Congreso Iberoamericano de Ingeniería de Alimentos, 2017.
Trabalhos completos em congresso
SILVA, M. M. N; PEREIRA, K. S; COELHO, M. A. Z. Benzoic acid and benzene

quantification in non-carbonated guarana (Paullinia cupana) soft drinks
commercialized in Rio de Janeiro. In: XXII Congresso Brasileiro de Engenharia
Química, 2018, São Paulo. Blucher Chemical Engineering Proceedings. São
Paulo: Editora Blucher, 2018. p. 709.
Artigos publicados em revistas científicas
SILVA, M. M. N; SILVA, R. S.; CRUZ, T. A.; PINHO, M. B.; PEREIRA, K. S.;

COELHO, M. A. Z. Spoilage growth and benzene evaluation of non-carbonated
soft drinks. CHEMICAL ENGINEERING TRANSACTIONS, v. 75, p. 97-102,
2019.
SILVA, M. M. N; ALBUQUERQUE, T. L.; PEREIRA, K. S.; COELHO, M. A. Z.

Food additives used in non-alcoholic water-based beverages: a review. Journal
of Nutritional Health & Food Engineering, v. 9, p. 109-121, 2019.
OUTRAS PUBLICAÇÕES DURANTE O PERÍODO DO DOUTORADO
Resumos em congresso
SILVA, A. R. A.; SILVA, M. M. N., RIBEIRO, B. D. Nutritional and Color

Comparison of Cow's Milk and Plant Based Milk. In: Simpósio Latino Americano
de Ciência de Alimentos, 2019, Campinas. Anais do 13º Simpósio Latino
Americano de Ciência de Alimentos. Campinas, 2019.
Borges, T. J.; SILVA, M. M. N; PEREIRA, K. S. Identificação de Deterioradores

em Caldas para Sobremesa e Molhos Estufados. In: Simpósio Latino Americano
de Ciência de Alimentos, 2019, Campinas. Anais do 13º Simpósio Latino
Americano de Ciência de Alimentos, 2019.
Corrêa, D. S.; GULAO, E. S.; SILVA, M. M. N.; COELHO, M. A. Z.; ROCHA-

LEAO, M. H. M. Estabilidade de emulsões O/A obtidas a partir de goma arábica
e inulina. In: 9ª Semana de Integração Acadêmica da UFRJ, 2018, Rio de
Janeiro. Anais da 9ª Semana de Integração Acadêmica da UFRJ, 2018.
ALMEIDA, D. M. M.; SILVA, M. M. N; PEREIRA, K. S. Comparação de

metodologias para determinação de contaminantes na indústria cervejeira
utilizando Orange Serum Agar e Petrifilm Lactic Acid Bacteria Count Plates. In:
9ª Semana de Integração Acadêmica da UFRJ, 2018, Rio de Janeiro. Anais da
9ª Semana de Integração Acadêmica da UFRJ, 2018.
SALES, J. C. S.; SILVA, M. M. N; LAZARO, C. C.; PEREIRA, K. S.; RIBEIRO, B.

D.; COELHO, M. A. Z. Enzymes Production by Aspergillus versicolor via Solid-
State Fermentation. In: XIII Seminário Brasileiro de Tecnologia Enzimática, 2018,
Florianópolis. Anais do XIII Seminário Brasileiro de Tecnologia Enzimática, 2018.
ALMEIDA, D. M. M.; SILVA, M. M. N; PEREIRA, K. S. Comparação de

metodologias para determinação de contaminantes na indústria cervejeira
utilizando Plate Count Agar e Petrifilm Rapid Aerobic Count Plate. In: 9ª Semana
de Integração Acadêmica da UFRJ, 2018, Rio de Janeiro. Anais da 9ª Semana
de Integração Acadêmica da UFRJ, 2018.
Trabalhos completos em congresso
MORETTI, L. K.; ALMEIDA, D. M. M.; Borges, T. J.; SILVA, M. M. N; PEREIRA,

K. S. Microbiological contamination in brewing process: a case study in breweries
in Rio de Janeiro. In: XXII Simpósio Nacional de Bioprocessos, 2019, Uberlândia.
Anais do XXII Simpósio Nacional de Bioprocessos, 2019.
ALMEIDA, D. M. M.; SILVA, M. M. N.; PEREIRA, K. S. Análise comparativa de

metodologias para detecção de aeróbios mesófilos da indústria cervejeira. In:
XXVI Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 2018, Belém.
Anais do XXVI Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 2018.
Artigos publicados em revistas científicas
SILVA, ALINE R.A.; SILVA, M. M. N.; RIBEIRO, BERNARDO D. Health Issues

and Technological Aspects of Plant-based Alternative Milk. FOOD RESEARCH
INTERNATIONAL, v. 131, p. 108972, 2020.
Borges, T. J.; MORETTI, L. K.; SILVA, M. M. N; PEREIRA, K. S.; TONDO, E. C.

Salmonella sensitivity to sodium hypochlorite and citric acid in washing water of
lettuce residues. JOURNAL OF FOOD SAFETY, 2019.
Capítulo de livro
SILVA, M. M. N.; PEREIRA, K. S.; RIBEIRO, B. D. Grupos microbianos de

importância para a indústria de alimentos. In: RIBEIRO, B. D.; NASCIMENTO,
R. P.; PEREIRA, K. S.; COELHO, M. A. Z. (Org.). Microbiologia Industrial
Alimentos. 1ed.Rio de Janeiro: Elsevier, 2018, v. 2, p. 1-18.
Lista de Ilustrações e Tabelas
Revisão Bibliográfica
Figura 1. Categorias de bebidas atualmente adotadas (Fonte: ROETHENBAUGH,
2005). ......................................................................................................................... 22
Quadro 1. Classificação geral das bebidas não alcoólicas de acordo com o Codex
Alimentarius (Fontes: FAO/WHO, 2005 e FAO/WHO, 2016). ...................................... 24
Quadro 2. Segmentação do mercado brasileiro de bebidas não alcoólicas em 2017
(Fonte: ABIR, 2018). ................................................................................................... 26
Quadro 3. Receita, consumo per capita e volume por pessoa de bebidas não alcoólicas
em 2018 e perspectivas (2019-2021) (Fontes: STATISTA, 2018, baseado em FMI,
Banco Mundial, ONU e Eurostat). ............................................................................... 27
Figura 2. Estrutura do ácido ascórbico (RUSSEL, 1994). ........................................... 42
Figura 3. Estrutura do ácido benzóico (RUSSEL, 1994). ............................................ 42
Figura 4. Formação de radical hidroxila a partir de ácido ascórbico (H2Asc) em presença
do íon Cu+2 (Adaptado de HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1985). .............................. 43
Figura 5. Equilíbrio do ácido benzóico e seu sal conjugado (Adaptado de RUSSEL,
1994). ......................................................................................................................... 43
Figura 6. Mecanismo de formação do benzeno a partir da reação com radical hidroxila
(Adaptado de WIKIMEDIA COMMONS, 2016)............................................................ 44
Figura 7:Estrutura do fenol (RUSSEL, 1994). ............................................................. 45
Capítulo 1
Quadro 1. Origem, amostras analisadas e formas de apresentação das bebidas
estudadas. .................................................................................................................. 53
Figura 1. Esquema simplificado de identificação dos isolados através da espectrometria
Matrix Associated Laser Desorption-Ionization - Time of Flight (MALDI-TOF)...............55
Figura 2. Percentual de prevalência de tipos de micro-organismos distintos nas bebidas
não alcoólicas estudadas de aspecto normal.................................................................56
Figura 3. Percentual de prevalência de tipos de micro-organismos distintos nas bebidas
não alcoólicas estudadas estufadas e/ou com crescimento microbiano visível. .......... 57
Figura 4. Microscopia, com aumento total de 1000x, dos fungos filamentosos isolados
da indústria boliviana identificados através de características fenotípicas. ................. 60
Figura 4 cont. Microscopia, com aumento total de 1000x, dos fungos filamentosos
isolados da indústria boliviana identificados através de características fenotípicas.......62
Figura 5. Microscopia, com aumento total de 1000x, dos fungos filamentosos isolados
da indústria boliviana identificados através de características fenotípicas.....................63
Capítulo 2
Figura 1. Esquema simplificado da amostragem realizada para avaliação de soluções

sintéticas..................................................................................................................... 67
Figura 2. Esquema da adsorção do benzeno na fibra CAR-PMDS (Fonte: Elaboração
própria) ................................................................................... ....................................69
Figura 3. Concentração dos ácidos ascórbico e benzóico e formação de benzeno na
presença de Cu+2 e Fe+3 à 4 ºC (A), 25 ºC (B) e 40 ºC (C).............................................70
Figura 4. Cromatograma com os tempos de retenção do fenol (1) e do ácido benzóico
(2), identificados por GC/MS, para o tempo de estocagem 20 semanas à 40ºC de
solução sintética............................................................................................................72
Capítulo 3
Figura 1. Esquema para análise de Concentração Mínima Inibitória de compostos de
potencial antimicrobiano)...............................................................................................76
Tabela 1. Concentração mínima inibitória (CMI) relativa a seis ácidos orgânicos
distintos.........................................................................................................................78
Tabela 2. Concentração mínima inibitória (CMI) relativa a seis peptídeos distintos...... 80
SUMÁRIO
Introdução................................................................................................................... 20
Objetivos..................................................................................................................... 21
Revisão da Literatura .................................................................................................. 22
1. Bebidas não alcoólicas ........................................................................................ 22
2. Mercado mundial de consumo de bebidas não alcoólicas .................................... 27
3. Microbiologia de bebidas não alcoólicas .............................................................. 29
3.1. Bactérias lácticas e acéticas ................................................................................ 30
3.2. Leveduras e fungos filamentosos ......................................................................... 31
4. Aditivos alimentares utilizados em bebidas e suas funções ................................. 32
4.1. Conservantes ....................................................................................................... 32
4.1.1. Antioxidantes ................................................................................................ 33
4.1.2. Agentes antimicrobianos............................................................................... 34
4.1.3. Agentes anti-escurecimento ......................................................................... 35
4.2. Agentes de coloração .......................................................................................... 36
4.3. Agentes flavorizantes .......................................................................................... 38
4.4. Agentes texturizantes.......................................................................................... 39
4.5. Aditivos nutricionais ............................................................................................ 40
4.6. Legislação............................................................................................................ 41
5. Mecanismo de formação de benzeno a partir de aditivos ácidos ......................... 42
6. Desenvolvimento de novos aditivos ........................................................................ 45
6.1. Óleos essenciais .................................................................................................. 47
6.2. Peptídeos antimicrobianos ................................................................................... 49
6.3. Saponinas ............................................................................................................ 50
6.4. Flavonóides ......................................................................................................... 51
Capítulo 1 – Prevalência de micro-organismos em bebidas não alcoólicas comerciais..53
1. Introdução ............................................................................................................ 53
2. Materiais e métodos ............................................................................................. 54
2.1. Amostras.............................................................................................................. 54
2.2. Metodologias ....................................................................................................... 55
3. Resultados e Discussão....................................................................................... 57
4. Conclusões .......................................................................................................... 66
Capítulo 2 - Avaliação da dissociação de aditivos conservantes e da formação de
compostos de potencial carcinogênico e mutagênico em bebidas não alcoólicas ....... 67
1. Introdução ............................................................................................................ 67
2. Materiais e Métodos ............................................................................................. 68
2.1. Elaboração da solução sintética de bebidas não alcoólicas ................................. 68
2.2. Determinação da degradação dos ácidos orgânicos ............................................ 69
2.3. Determinação da formação de benzeno .............................................................. 69
2.4. Avaliação da formação de subprodutos de benzeno ............................................ 70
4. Conclusões .......................................................................................................... 74
Capítulo 3 - Concentração mínima inibitória de compostos com potencial antimicrobiano
frente a micro-organismos contaminantes na indústria de bebidas ............................. 75
1. Introdução ............................................................................................................ 75
2. Materiais e Métodos ............................................................................................. 76
2.1. Ácidos orgânicos.................................................................................................. 77
2.2. Peptídeos antimicrobianos ................................................................................... 77
4. Conclusões .......................................................................................................... 82
Conclusão geral .......................................................................................................... 82
Sugestões para trabalhos futuros ............................................................................... 84
Agradecimentos .......................................................................................................... 84
Referências ................................................................................................................ 85
ANEXO I Concentração máxima de aditivos permitida em bebidas não alcoólicas à base
de água, de acordo com o Codex Alimentarius (Adaptado de FAO/WHO, 2016) ...... 102
20
Introdução
Alimentos e bebidas são matrizes bioquímicas complexas que muitas vezes

são estudadas de forma fragmentada. Para que um alimento seja conhecido em
sua totalidade, é preciso compreender as interações dos compostos
naturalmente presentes, dos componentes adicionados intencionalmente com
funções específicas, dos compostos formados ao longo da vida comercial, da
microbiota natural, dos micro-organismos adicionados com funções específicas,
dos micro-organismos contaminantes e de outros tantos fatores, intrínsecos e
extrínsecos.
Estudar matrizes tão únicas abordando mais de uma vertente se prova um

trabalho desafiador, e por isso mesmo, de grande importância para responder a
questões referentes ao aperfeiçoamento de processos produtivos e ao
desenvolvimento de novos produtos.
Bebidas não alcoólicas são amplamente consumidas mundialmente e, por

si só, já possuem inúmeras formulações e variações de acordo com as matérias-
primas, motivação de consumo, e formas de armazenamento. Visando unir
aspectos biológicos e físico-químicos, o presente trabalho reuniu dados
microbiológicos sobre produtos, majoritariamente sobre os micro-organismos
deterioradores, e, também, relativos a interações de aditivos conservantes
usados com o objetivo de inibir tais deterioradores, questionando sua eficiência.
Ainda sobre os aditivos, foi demonstrado como se comportam ao longo da vida
comercial média das bebidas, identificando produtos e subprodutos das reações,
muitas vezes com potencial tóxico ao consumo humano.
Tal estudo, além de responder a questionamentos importantes sobre a

eficácia das atuais formulações empregadas nas bebidas não alcoólicas,
também leva a questionar outros tantos alimentos, que são matrizes ainda mais
complexas que as bebidas estudadas.
21
Objetivos
Geral
O objetivo deste trabalho foi avaliar a segurança química e a qualidade

microbiológica de bebidas não alcoólicas no que tange a presença de micro-
organismos deterioradores ou patógenos bem como a influência dos aditivos
ácidos na formação de compostos com potencial carcinogênico.
Específicos
Capítulo 1: Identificar os principais micro-organismos contaminantes de diversas

bebidas não alcoólicas comerciais.
Capítulo 2: Determinar os perfis de degradação dos ácidos orgânicos mais

empregados nas indústrias de bebidas, bem como a formação de compostos
com potencial carcinogênico.
Capítulo 3: Avaliar a capacidade antimicrobiana dos ácidos orgânicos já

empregados e de compostos alternativos.
22
Revisão da Literatura
1. Bebidas não alcoólicas
O grupo das bebidas é dividido em bebidas alcoólicas e não alcoólicas. O

grupo alcoólico inclui cerveja e bebidas de malte, sidra e perry, vinhos,
fermentados alcoólicos de frutas, hidromel, bebidas destiladas e bebidas
alcoólicas aromatizadas (FAO/WHO, 2016). As bebidas não alcoólicas são
subdivididas em bebidas quentes, refrigerantes e bebidas lácteas (na Figura 1
pode ser observada a divisão destas categorias). De acordo com o Codex
Alimentarius, bebidas não alcoólicas incluem águas e águas gaseificadas, sucos
e néctares de frutas e vegetais, bebidas à base de água, gaseificadas e não-
carbonatadas e bebidas como café e chá, conforme descrito no Quadro 1
(FAO/WHO, 2005 e FAO/WHO, 2016).
Bebidas
Não
alcoólicas Alcoólicas
Refrigerantes Quentes Lácteas Cerveja
Águas Chá Leite Vinho
Carbonatados Leite Destilados

Café
aromatizado
Concentrados Outras Outros

quentes alcoólicos
Sucos e
néctares
Figura 1. Categorias de bebidas atualmente adotadas (Fonte: ROETHENBAUGH, 2005).
No âmbito brasileiro, segundo o Decreto nº 6.871 de 2009, bebida não

alcoólica é a bebida com graduação alcoólica até 0,5 % em volume, à 20 °C, de
álcool etílico potável, podendo ou não ser fermentada. Nessa legislação, há a
23
segmentação e definição das bebidas não alcoólicas em sucos, polpas, água de

coco, néctar, refresco, refrigerante, água tônica de quinino, xarope, concentrado
líquido para refresco, concentrado líquido para refrigerante, preparado sólido
para refresco, chá pronto para consumo, preparado líquido para chá, bebida
composta de fruta, polpa ou extrato vegetal e extrato de guaraná (BRASIL,
2009).
Já a RDC nº 18 de 2010, que dispõe sobre alimentos para atletas,

apresenta isotônicos como produtos prontos para o consumo com osmolalidade
entre 270-330 mOsm.kg-1 água, pertencendo então ao grupo das bebidas não
alcoólicas (BRASIL, 2010). Em paralelo ao apresentado no Quadro 1, se
encaixam na categoria de bebidas à base de água desportivas, contendo
eletrólitos.
As bebidas à base de leite são geralmente incluídas nos produtos lácteos,

já que o leite é o componente majoritário (FAO/WHO, 2016). Roethenbaugh
(2005) considera o café e o chá como uma categoria diferente, separando as
bebidas quentes das demais não alcoólicas, uma vez que, de fato, têm
processos e procedimentos de armazenamento diferentes. Seguindo as
premissas da Organização das Nações Unidas para a Agricultura e a
Alimentação (FAO, sigla do inglês Food and Agriculture Organization), para este
trabalho, só serão consideradas as bebidas de café e chá prontas para beber,
que são classificadas como bebidas não-carbonatadas à base de água.
Devido ao ritmo de atividades que o mundo globalizado tem imposto às

pessoas, a necessidade de alimentos e bebidas mais convenientes (ou seja, fácil
acesso e preparação) está aumentando. Uma das principais áreas da Ciência e
Tecnologia de Alimentos visa preservá-los sem passar por processos que levem
a mudanças significativas em suas características sensoriais e nutricionais, ou
seja, estando o mais próximo possível de um alimento in natura.
24
Quadro 1. Classificação geral das bebidas não alcoólicas não lácteas de acordo com o Codex Alimentarius (Fontes: FAO/WHO, 2005 e FAO/WHO, 2016).
Bebidas não Descrição

alcoólicas
Águas 1. Águas minerais naturais e águas de nascente: naturalmente carbonatadas (com CO2 da fonte),
carbonatadas (com adição de CO2 de outra origem), descarbonatadas (com menos CO2 presente que na água da
fonte) ou fortificadas (com CO2 da fonte), e não-carbonatadas (não contêm CO2 livre).
2. Águas de mesa e águas gaseificadas: águas que não sejam águas de fonte natural que podem ser
carbonatadas por adição de CO2 e podem ser processadas por filtração, desinfecção ou outros meios adequados.
Estas águas podem conter sais minerais adicionados.
Sucos de frutas e de 1. Suco de fruta: líquido não fermentado, mas fermentável, obtido da parte comestível da fruta madura e fresca,
vegetais geralmente por extração mecânica
2. Suco de vegetais: líquido não fermentado, mas fermentável, obtido pela extração mecânica de vegetais
frescos.
3. Concentrados para sucos de fruta: preparados pela remoção física da água do suco de fruta para aumentar
o grau Brix. Pode ser vendido em forma líquida, em xarope e congelado para a preparação de suco pronto para beber,
por adição de água.
4. Concentrados para sucos de vegetais: preparados pela remoção física da água do suco de vegetais.
Vendido em forma líquida, xarope e congelado para a preparação de um suco pronto para beber, por adição de água.
Néctares de frutas e 1. Néctar de fruta: produto não fermentado, mas fermentável, obtido por adição de água com ou sem adição de
de vegetais açúcar, mel, xaropes e/ou edulcorantes ao suco de fruta, suco de fruta concentrado, puré de fruta ou puré de fruta
concentrado, ou uma mistura desses produtos.
25
2. Néctar vegetal: produto obtido por adição de água com ou sem adição de açúcar, mel, xaropes e/ou
edulcorantes ao suco de vegetais ou ao suco de vegetais concentrado, ou a uma mistura desses produtos.
3. Concentrados para néctar de fruta: preparados pela remoção física da água do néctar de fruta. Vendido em
forma líquida, xarope e congelado para a preparação de néctar pronto para beber, por adição de água.
4. Concentrados para néctar de vegetais: preparados pela remoção física da água do néctar de vegetais.
Vendido em líquido, xarope e formas congeladas para a preparação de néctares prontos para beber por adição de
água.
Bebidas à base de 1. Bebidas aromatizadas carbonatadas à base de água: inclui bebidas aromatizadas à base de água com
água adição de CO2, com edulcorantes nutritivos, não nutritivos e/ou intensos e outros aditivos alimentares permitidos. Inclui
as chamadas bebidas "energéticas" que são carbonatadas e contêm altos níveis de nutrientes e outros ingredientes
(por exemplo, cafeína, taurina, carnitina).
2. Bebidas aromatizadas não carbonatadas à base de água: inclui bebidas aromatizadas à base de água sem
adição de CO2, bebidas à base de sucos de frutas e vegetais (por exemplo, amêndoas, bebidas à base de coco),
bebidas de café e chá prontas para beber com ou sem leite ou sólidos de leite, bebidas à base de ervas e bebidas
"desportivas" contendo eletrólitos. Podem ser límpidas ou conter partículas (por exemplo, pedaços de fruta), e podem
ser não adoçadas ou adoçadas com açúcar ou um adoçante não-nutritivo de alta intensidade. Inclui as chamadas
bebidas "energéticas", que não são carbonatadas e contêm altos níveis de nutrientes e outros ingredientes (por
exemplo, cafeína, taurina, carnitina).
3. Concentrados (líquidos ou sólidos) para bebidas aromatizadas à base de água: inclui concentrados em
pó, xarope, líquidos e congelados para a preparação de bebidas carbonatadas ou não carbonatadas à base de água
26
sem álcool por adição de água ou água carbonatada. Exemplos incluem xaropes de fontes (por exemplo, xarope de
cola), xaropes de frutas para refrigerantes, concentrado congelado ou em pó para limonada e misturas de chá gelado.
27
2. Mercado mundial de consumo de bebidas não alcoólicas
Bebidas não alcoólicas comerciais estão disponíveis na maioria dos países

do mundo, uma vez que a sua produção é relativamente simples e uma grande
variedade de matérias-primas locais pode ser utilizada. Em geral, o registro do
consumo de bebidas em todo o mundo é baseado no controle das próprias
empresas, o que pode levar a erros na obtenção de dados, principalmente em
relação à variedade da natureza das bebidas consumidas dentro das populações
(ROTHWELL et al., 2018).
O Quadro 2 apresenta a segmentação desse setor por categoria de bebida,

elencando-as por ordem de volume de produção no ano de 2017. Constata-se
que refrigerantes, seguidos por águas minerais, refrescos em pó (volume
reconstituído), néctares e sucos prontos representam cerca de 96% do perfil de
consumo do brasileiro quando se trata de bebidas não alcoólicas.
Quadro 2. Segmentação do mercado brasileiro de bebidas não alcoólicas em 2017 (Fonte: ABIR, 2018).
Categoria de Volume de produção Produção em Consumo per capita

bebidas (bilhões de L) relação ao total (%) (L.habitante-1)
Refrigerantes 12,84 42,1 61,82

Águas minerais 11,26 36,9 54,22
Refrescos em pó 3,99 13,1 19,20
Néctares e sucos 1,10 3,61 5,31
prontos
Sucos 0,511 1,67 2,46
concentrados
Refrescos prontos 0,373 1,22 1,80
para beber
Bebidas à base de 0,124 0,41 0,60
soja
Chás prontos para 0,116 0,38 0,56
beber
Energéticos 0,098 0,32 0,47
Isotônicos 0,084 0,28 0,40
28
Segundo a Associação Brasileira das Indústrias de Refrigerantes e de

Bebidas não Alcoólicas (ABIR), o volume de produção do mercado brasileiro de
bebidas não alcoólicas foi de 30,5 bilhões de litros em 2017, um consumo de
146,84 L.habitante-1 (ABIR, 2018).
O Quadro 3 apresenta uma visão geral das estatísticas do mercado mundial

de bebidas não alcoólicas de 2018, que inclui águas engarrafadas, sucos e
outras bebidas não alcoólicas.
Quadro 3. Receita, consumo per capita e volume por pessoa de bebidas não alcoólicas em 2018 e
perspectivas (2019-2021) (Fontes: STATISTA, 2018, baseado em FMI, Banco Mundial, ONU e Eurostat).
Estatísticas do mercado de bebidas não alcoólicas em 2018
Crescimento
Receita (Milhões Consumo per Volume por
Região esperado até
de US$) capita (US$) pessoa (L)
2021 (%)
América do Norte 164,40 330,73 355,5 2,1

América do Sul 40,40 156,86 173,0 6,7
Europa 89,74 171,65 217,8 1,7
Australia 6,62 267,59 177,0 2,3
Ásia 144,82 41,34 82,7 7,7
Em relação à América do Norte, 80,4% da receita total foi proveniente dos

Estados Unidos, que por si só foi maior do que a da América do Sul, Europa e
Austrália. Na América do Sul, os dados disponíveis apresentados na tabela
foram compostos apenas por estatísticas do Brasil e da Argentina. Os dados da
Ásia foram obtidos de 11 países e da Europa, 27 países. Na América do Sul e
na Ásia, as perspectivas de crescimento anual foram superiores a 5% até 2021.
Todo o crescimento expressivo do mercado esperado até 2021 deve-se a

alta disponibilidade destes produtos em supermercados e estabelecimentos em
geral, serviços de alimentação e bebidas, lojas de conveniência e máquinas
automáticas de venda. Esses números mostram a relevância das bebidas não
alcoólicas no mundo, sugerindo que esse setor precisa de mais atenção com
relação à qualidade dos ingredientes e aditivos que são introduzidos diariamente
na alimentação humana (STATISTA, 2018).
29
O mercado global de alimentos e bebidas tem crescido substancialmente

nos últimos 10 anos. Segundo dados da Persistence Market Research (2019),
as bebidas não alcoólicas estão ganhando grande popularidade na Ásia-
Pacífico, devido ao grande consumo de chá e café na região, especialmente em
países como a Índia. O consumo de bebidas não alcoólicas na Ásia-Pacífico foi
de 200 bilhões de litros em 2016 e espera-se que atinja 301 bilhões de litros até
2027.
Em retrospectiva ao Quadro 3, as projeções de crescimento do consumo

da Ásia (7,7%) e da América Latina (6,7%) até 2021 são próximas, reforçando o
potencial do setor de bebidas no quadro econômico brasileiro. Nessa mesma
tendência, os consumidores norte-americanos estão buscando hábitos
alimentares mais saudáveis e, portanto, aumentaram o consumo de bebidas
energéticas, sendo esperado um aumento de aproximadamente 150% até 2027.
Já a Europa é considerada o terceiro maior mercado de bebidas não alcoólicas,
depois da Ásia-Pacífico e América do Norte, especialmente dada a crescente
popularidade do chá em toda a região (PERSISTENCE MARKET RESEARCH,
2019).
3. Microbiologia de bebidas não alcoólicas
O crescimento de micro-organismos em alimentos está relacionado a

fatores inerentes ao mesmo, chamados intrínsecos, como pH e atividade de
água, e fatores extrínsecos, como temperatura, umidade relativa e presença de
gases. A alteração de um ou mais fatores interfere diretamente na microbiota
que irá se desenvolver no alimento, que pode ser contaminante ou até mesmo
necessária para as características do produto, como é o caso de alguns
alimentos e bebidas fermentados (LEISTNER e GORRIS, 1995; BARTH et al.,
2009).
A contaminação de bebidas por micro-organismos patogênicos geralmente

reflete condições precárias de higiene durante a produção, armazenamento,
distribuição e/ou manuseio, tanto em nível industrial, quanto doméstico. Em
alimentos ácidos (pH ≤ 4,6), como é o caso das bebidas estudadas neste
trabalho, micro-organismos patogênicos tendem a ter seu desenvolvimento
30
suprimido ou reduzido. Porém, devido à elevada atividade de água e presença

de vitaminas e minerais, já que a maioria das bebidas é a base de frutas, essas
matrizes alimentares constituem um ambiente atrativo para contaminação
microbiológica por deterioradores (SIMPSON e TAORMINA, 2015). Nestas
matrizes são geralmente encontrados fungos filamentosos e leveduras, além de
bactérias lácticas e acéticas (HALL et al., 2015). Tais micro-organismos,
considerados deterioradores de bebidas não alcoólicas de base aquosa, são
responsáveis por mudanças sensoriais, como formação de aroma e sabor
desagradáveis, tornando o produto indesejável ao consumo humano.
A seguir serão apresentados os micro-organismos de maior destaque entre

os deterioradores de bebidas não alcoólicas.
3.1. Bactérias lácticas e acéticas
Bactérias ácido-lácticas (BAL) pertencem ao grupo das bactérias Gram

positivas, em forma de cocos ou bastonetes curtos, anaeróbias, mas
aerotolerantes, e não possuem a capacidade de esporular. Realizam as vias
homofermentativa, que produz apenas o ácido láctico a partir de açúcares, e
heterofermentativa, que produz, além do ácido láctico, quantidades
consideráveis de ácido acético e álcool. Os gêneros representativos das BAL
são Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus e Streptococcus, micro-
organismos que se desenvolvem bem na faixa ligeiramente ácida de pH
(HALASZ, 2009; BINTSIS, 2018).
Algumas bactérias lácticas dos gêneros Lactobacillus e Leuconostoc

podem se reproduzir em bebidas não alcoólicas como sucos de frutas e são
reconhecidas por sua resistência aos ácidos sórbico e benzóico, usuais
conservantes usados em bebidas. Ao metabolizar açúcar, essas bactérias
podem seguir a via heterofermentativa e formar ácido láctico e compostos como
etanol, acetato, succinato e formato, que conferem características sensoriais
muitas vezes desagradáveis (KREGIEL, 2015).
Bactérias acéticas (AAB, sigla do inglês Acetic Acid Bacteria) são bactérias
Gram negativas ou Gram variáveis, estritamente aeróbias, com formas variando
entre elipsoides e bastonetes. São mesófilas, crescendo bem entre 25-30 ºC, e
31
o pH ótimo de crescimento é entre 5,0-6,5, podendo também se desenvolver em

valores de pH mais ácidos. Os gêneros mais comumente relatados em alimentos
são Acetobacter, Gluconacetobacter, Gluconobacter e Komagataeibacter
(GOMES et al., 2018).
AAB são capazes de oxidar etanol a ácido acético, também produzindo

compostos como os ácidos glucônico, láctico e succínico, além de aldeídos e
cetonas, dependendo do substrato disponível. Por serem estritamente aeróbias,
geralmente se desenvolvem em bebidas embaladas em plásticos permeáveis ao
oxigênio, como garrafas de poli tereftalato de etileno (PET). Sua presença é
menos comum em bebidas não alcoólicas do que a das bactérias lácticas, e pode
causar estufamento da embalagem, alterações no sabor e formação de
sedimentos. Muitas espécies possuem a capacidade de formar biofilmes nas
superfícies de produção e nos materiais da embalagem (KREGIEL, 2015;
SIMPSON e TAORMINA, 2015).
3.2. Leveduras e fungos filamentosos
As leveduras podem ser definidas como fungos unicelulares, nos quais a

reprodução vegetativa (assexuada) ocorre principalmente pelo brotamento. A
grande maioria das leveduras, como as do gênero Saccharomyces, exibe a
gemulação multilateral, que se inicia com um pequeno crescimento lateral à
célula-mãe e posterior divisão do núcleo da célula-mãe, fato que possibilita a
formação de uma nova levedura. As células de leveduras são geralmente
arredondadas, ovoides, ou cilíndricas (DEAK, 2007).
Micro-organismos úteis e muito importantes na produção de alimentos por

fermentação, as leveduras são essenciais para a produção de pães, cerveja e
vinho. Entretanto, em bebidas não alcoólicas de base aquosa, como sucos e
refrescos, são indesejáveis por consumirem os açúcares presentes e gerarem
produtos como etanol, descaracterizando o produto. Proliferam-se
preferencialmente em temperaturas em torno de 25 °C e umidade acima de
70 %, condições usuais de processamento e armazenamento (TOURNAS et al.,
2006; SIMPSON e TAORMINA, 2015).
32
De acordo Pitt e Hocking (2009), cerca de dez espécies de leveduras são

responsáveis pela deterioração de alimentos que tenham sido processados e
embalados de acordo com os padrões normais de Boas Práticas de Fabricação
(BPFs), a maioria pertencentes aos gêneros Brettanomyces, Candida,
Pichia/Komagataella, Rhodotorula, Saccharomyces e Zygosaccharomyces.
Fungos são micro-organismos eucariontes que possuem a capacidade de

exportar enzimas hidrolíticas que quebram biopolímeros, que então podem ser
absorvidos para nutrição celular. Essa característica faz com que se
desenvolvam em uma determinada matriz e ali permaneçam até que ela esteja
completamente exaurida de nutrientes (SAMSON, 2015). A maioria dos
problemas de deterioração de alimentos devido a fungos filamentosos ocorre em
condições aeróbicas, ou pelo menos em ambientes onde a tensão de oxigênio é
próxima à atmosférica. Dentre os gêneros mais reconhecidos, estão Penicillium,
Paecilomyces, Aspergillus e Fusarium (PITT e HOCKING, 2009).
Por formarem esporos de reprodução, podem contaminar o produto em

qualquer fase da produção industrial. Assim como as leveduras, se desenvolvem
preferencialmente em produtos com alta atividade de água e valores ácidos de
pH. Porém são de difícil controle e eliminação quando contaminam plantas
industriais, pois pode ocorrer a disseminação dos esporos no ar (KREGIEL,
2015; SIMPSON e TAORMINA, 2015).
4. Aditivos alimentares utilizados em bebidas e suas funções
Os aditivos são geralmente divididos em cinco grupos de acordo com as

suas propriedades: conservantes, corantes, aromatizantes, texturizantes e
aditivos nutricionais (BRANEN e HAGGERTY, 2001). Suas funções serão
discutidas neste tópico em função da importância dos aditivos nas propriedades
das bebidas não alcoólicas.
4.1. Conservantes
Os conservantes podem ser classificados como qualquer substância capaz

de inibir ou desacelerar o crescimento de micro-organismos e dissimular
evidências de qualquer tipo de deterioração, sejam elas causadas por micro-
33
organismos ou não. Em alimentos e bebidas, os conservantes são amplamente

utilizados para restringir a contaminação microbiana e prevenir a
desestabilização, podendo ser divididos em três tipos: antimicrobianos,
antioxidantes e agentes anti-escurecimento (BRANEN e HAGGERTY, 2001;
TAYLOR, 2005).
4.1.1. Antioxidantes
Antioxidantes são moléculas capazes de inibir processos de oxidação

agindo previamente ou durante uma reação em cadeia de radicais livres em
qualquer ponto: iniciação, propagação, terminação, decomposição e sobre
produtos de oxidação já formados, evitando a deterioração de sabores e cores.
Dependendo da molécula e em que estágio da reação em cadeia ela atuará,
diferentes mecanismos podem ser atribuídos aos antioxidantes. Os mais
importantes são a inativação do metal, que atua na iniciação geralmente usando
quelantes metálicos, e a inibição da formação de hidro peróxidos (GERMAN,
2001; TAYLOR, 2005).
Em bebidas não alcoólicas, o ácido ascórbico (INS 300) é amplamente

utilizado como antioxidante para retardar a deterioração dos sabores e cores.
Geralmente, as bebidas não alcoólicas são embaladas em garrafas e caixas
permeáveis ao oxigênio, que fazem dos antioxidantes um aditivo chave para
reduzir a perda na qualidade da bebida (KREGIEL, 2015). Quanto à adição de
ácido ascórbico como antioxidante, é importante salientar que este não constitui,
por si só, uma alegação de vitamina C, uma vez que para tal alegação a adição
deve respeitar a dose diária recomendada (FAO/WHO, 2005).
Nas quantidades geralmente utilizadas na produção de alimentos, os

antioxidantes são geralmente não tóxicos mas, em excesso, a utilização pode
promover a peroxidação lipídica em alimentos contendo cobre e ferro, como
carnes (DANIEL, 1986; REDDY e LOKESH, 1992).
34
4.1.2. Agentes antimicrobianos
Os agentes antimicrobianos são substâncias utilizadas para preservar os

alimentos, evitando o crescimento de micro-organismos e a deterioração
subsequente (CFR, 2018), prolongando a validade comercial. Os ácidos
orgânicos são normalmente utilizados pela indústria de bebidas como
antimicrobianos ou acidulantes em uma variedade de produtos.
O ácido sórbico (INS 200), por exemplo, é eficaz contra leveduras, fungos
filamentosos e bactérias menos resistentes. Trata-se de um ácido carboxílico
insaturado com pKa= 4,76, que tem a vantagem de não ter aroma ou sabor
quando utilizado nas concentrações adequadas. Este aditivo é empregado em
inúmeros alimentos, incluindo bebidas alcoólicas e não alcoólicas, frutas e
legumes em conserva, geleias, produtos cárneos e molhos. Normalmente, por
conta da maior solubilidade em água, em vez do ácido sórbico, os seus sais
sorbato de sódio (INS 201), sorbato de potássio (INS 202) e sorbato de cálcio
(INS 203) são utilizados pela indústria (SILVA e LIDON, 2016; AMIT et al., 2017).
A ação antimicrobiana do ácido benzóico (INS 210) prevalece em leveduras

e fungos filamentosos e, em menor grau, em bactérias. Sais de ácido benzóico,
em particular benzoato de sódio (INS 211), benzoato de potássio (INS 212) e
benzoato de cálcio (INS 213), são normalmente aplicados como conservantes
em sucos de frutas e refrigerantes, maioneses, picles e preparações a base de
frutas. O ácido benzóico, ácido carboxílico com pKa = 4,19, é usado
frequentemente em combinação com outros aditivos, especialmente em
alimentos ácidos (pH 4 - 4,5) devido à sua forte dependência do pH (WHO, 2000;
SILVA e LIDON, 2016). Este composto antimicrobiano foi testado in vitro e foi
relatado como não tóxico; entretanto, alguns autores observaram alguma
toxicidade com efeitos mutagênicos e citotóxicos nos linfócitos periféricos
(ZHANG e MA, 2013).
De um modo geral, os sais destes ácidos orgânicos são mais estáveis, mais
solúveis em água e têm a ação antimicrobiana mais eficaz em níveis de pH < 4,5,
em que a forma não dissociada está em maior concentração porque o pH está
abaixo do pKa desses compostos. Sorbatos e benzoatos são frequentemente
35
utilizados em combinação, especialmente em bebidas com elevada acidez

(DOORES, 1993; KREGIEL, 2015).
4.1.3. Agentes anti-escurecimento
Escurecimento pode ocorrer pela ação de enzimas, geralmente envolvendo

a enzima polifenol oxidase (PPO, sigla do inglês polyphenol oxidase), ou reações
não enzimáticas, como a reação de Maillard e a caramelização. Os agentes anti-
escurecimento podem prevenir o surgimento da coloração castanha, agindo na
enzima ou nos intermediários da formação do pigmento.
Os antioxidantes podem prevenir o início do processo de escurecimento

reagindo com oxigênio. O ácido ascórbico, já discutido devido à sua atividade
antioxidante, também tem ação anti-escurecimento porque é um agente redutor.
Hexilresorcinol (4-HR), ácido eritórbico (ou ácido isoascórbico), N-acetil cisteína
e glutationa foram relatados por causa da capacidade antioxidante, mas não são
comumente usados na indústria de bebidas, onde o ácido ascórbico é
amplamente empregado (IOANNOU e GHOUL, 2013). Se a bebida for
pasteurizada ou tratada termicamente após a adição de ácido ascórbico, seu
efeito pode ser destruído, e esse ácido pode iniciar sua própria reação química
de escurecimento (TAYLOR, 2005).
Os sais derivados de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) e os

compostos à base de fosfato podem atuar como agentes quelantes,
complexando o cobre disponível na estrutura das enzimas polifenol oxidases
(PPO). Os agentes à base de fosfato são comumente usados em níveis de 0,5-
2% (p/v) e, como EDTA e outros agentes quelantes, são usados em combinação
com outros agentes anti-escurecimento (IYENGAR e MCEVILY, 1992).
A enzima PPO é normalmente inativada a pH abaixo de 4, portanto os

acidulantes também podem agir para evitar o escurecimento, e o mais
comumente utilizado é o ácido cítrico. O ácido cítrico tem uma ação dupla em
relação ao anti-escurecimento, pois pode ainda quelar o íon de cobre presente
na estrutura proteica. Ácidos orgânicos como málico, tartárico e malônico, e
ácidos inorgânicos como fosfórico também podem ser utilizados como
acidulantes mas, devido ao seu custo mais elevado e/ou impacto negativo no
36
sabor, são menos utilizados do que o ácido cítrico (IOANNOU e GHOUL, 2013;
IYENGAR e MCEVILY, 1992).
4.2. Agentes de coloração
A cor é um dos atributos mais importantes em alimentos e bebidas, pois é

a primeira característica que os consumidores observam e pode influenciar
positiva ou negativamente a escolha do produto. Segundo a Food and Drugs
Administration (FDA), os corantes são substâncias utilizadas para conceder,
preservar ou realçar a cor dos alimentos, e podem incluir estabilizadores,
fixadores e agentes de retenção (CFR, 2018). Nas bebidas não alcoólicas, estas
classes de aditivos são importantes para tornar o produto mais atraente
esteticamente e para corrigir variações naturais de cor ou alterações durante o
processamento ou armazenamento, padronizando as características pelas quais
a bebida é reconhecida. Os corantes podem ser divididos em corantes naturais
e corantes artificiais.
Apesar da crescente demanda por bebidas naturais, o uso de corantes

artificiais ainda é amplamente utilizado para proporcionar coloração de fruta a
bebidas com baixa concentração de suco. Assim, o objetivo industrial é tornar
estes produtos mais aceitos pelos consumidores e padronizar a cor durante a
armazenagem, incluindo a reprodução de cores que se referem à presença de
substâncias funcionais, como as antocianinas (FALLICO et al., 2010).
Os corantes orgânicos sintéticos são amplamente utilizados como aditivos

em alimentos processados, sendo o uso dessas substâncias responsável por
danos à saúde dos consumidores, especialmente em crianças (DOELL et al.,
2016). Estudos demonstraram que existem possíveis ligações entre o consumo
de alguns corantes alimentares com efeitos nocivos para a saúde das crianças,
entre eles: Amarelo crepúsculo, Ponceau 4R, Carmoisina, Amarelo Quinolina e
Vermelho Alura AC (McCANN et al., 2007). Durante o século XX, nos Estados
Unidos, foram utilizados 80 corantes diferentes nos alimentos; no entanto, ao
longo dos anos a maioria foi retirada do mercado devido a preocupações com a
segurança dos alimentos, reduzindo-os a 9 corantes, que são atualmente
permitidos pela Food and Drug Administration (STEVENS et al., 2014).
37
Os corantes naturais são os extraídos de plantas, frutas e legumes, ou

ainda, produzidos por via microbiana e enzimática. Normalmente, variam do
amarelo ao laranja quando são carotenoides ou do vermelho vivo ao roxo quando
são antocianinas (KREGIEL, 2015). Scotter (2011), baseado na legislação da
União Europeia, divide os corantes naturais em 9 grupos: curcumina (E100),
riboflavinas (E101i-ii), cochonilha - incluindo ácido carmínico (E120), clorofilas -
incluindo clorofilinas e compostos de cobre (E140-141), caramelos - classes I-IV
(E150a-d), carotenoides - (E160a-f, E161b, E161g), vermelho beterraba,
betanina (E162), antocianinas (E163), e outros: carbono vegetal (E153),
carbonato de cálcio (E170), dióxido de titânio (E171) e óxidos e hidróxidos de
ferro (E172).
Outro corante muito utilizado na indústria de alimentos, especialmente em

bebidas e confeitaria, é o caramelo, que é uma mistura complexa de glóbulos de
gordura rodeada por uma solução de açúcar de alta concentração. Normalmente
é produzido aquecendo uma mistura de xarope de glicose, leite e gordura vegetal
a uma temperatura entre 118 e 130ºC (SENGAR e SHARMA, 2014). Existem 4
tipos diferentes de corantes caramelo que satisfazem os diferentes requisitos
para utilização em alimentos e bebidas: Caramelo Classe I (também conhecido
como caramelo simples), Caramelo Classe II (caramelo sulfito-cáustico),
Caramelo Classe III (caramelo amônia ou de cerveja, caramelo de padeiro e
confeitaria) e Caramelo Classe IV (conhecido como caramelo sulfito, caramelo
de refrigerante, ou caramelo à prova de ácidos) (CODEX, 1996). Este corante
classe IV tem sido destacado como benéfico contra o escurecimento não
enzimático quando adicionado a alimentos. Outra vantagem é que, em
comparação com outros corantes naturais, o caramelo não se degrada sob altas
temperaturas e pressões, permitindo a sua adição em alimentos que passam
pelo processo de extrusão (KAMUF et al., 2003). Apesar de ser considerado um
aditivo natural para corar alimentos e bebidas, alguns estudos têm demonstrado
a existência de compostos que podem ser tóxicos para a saúde do consumidor
tais como 2-metilimidazol, 4-metilimidazol, 1,2,3,4-tetrahidroxibutil-THI e 5-
hidroximetilfurfural, que têm sido encontrados em bebidas gaseificadas podendo
afetar a saúde dos consumidores (XU et al., 2015).
38
4.3. Agentes flavorizantes
Os agentes flavorizantes são substâncias adicionadas, em pequenas

quantidades, para suplementar, realçar ou modificar o sabor e/ou aroma original
dos alimentos, sem lhes conferir um sabor ou aroma característico próprio (CFR,
2018). O aroma pode ser definido como um único ou uma mistura de produtos
químicos de origem natural ou sintética, capaz de fornecer todo ou parte do sabor
de qualquer alimento ou outro produto. Ao contrário de outros aditivos
adicionados às bebidas, os aromas são utilizados em pequenas quantidades, de
modo que a exposição do consumidor a estas substâncias é relativamente baixa.
A legislação da União Europeia define os diferentes tipos de aromas como
naturais, idênticos ao natural e artificiais, e tais definições são empregadas
mundialmente (KREGIEL, 2015).
Vários regulamentos e diretivas europeias relativas a aromas e fragrâncias

foram adotadas, especialmente no que diz respeito a óleos e extratos,
impactando diretamente não apenas na União Europeia, mas também em todo
o mundo. Algumas das principais substâncias consideradas naturais
regulamentadas para uso como aromatizantes em alimentos e bebidas são ácido
agárico, β-asarona, cumarina, hipericina, quassina, pulegona, tujona, aloína,
ácido cianídrico e santonina. Uma substância aromatizante natural pode ser
obtida diretamente da planta, animal ou fermentação microbiana e usada no
estado bruto ou após o processamento para consumo humano
(DEMYTTENAERE, 2012).
No passado, os óleos essenciais eram amplamente utilizados nas

indústrias de perfumaria, alimentícia e farmacêutica, e mais recentemente têm
sido utilizados na indústria de bebidas, sendo várias substâncias utilizadas como
agentes aromatizantes. O capim-limão e o limão, por exemplo, são algumas das
fontes naturais mais exploradas para estes aditivos e têm propriedades
antioxidantes e antimicrobianas comprovadas. Kieling e Prudencio (2019)
desenvolveram uma mistura de derivados do capim-limão (extrato aquoso,
extrato liofilizado e óleo essencial) e suco de limão para a preparação de bebidas
mistas, avaliando as características físico-químicas e antioxidantes. Além disso,
foi analisada a aceitação sensorial e foram obtidos resultados satisfatórios. Outra
39
substância amplamente utilizada como aromatizante é o metil eugenol,

comumente encontrado em muitas plantas e vegetais. A UE determina níveis
máximos para o uso desta substância nos alimentos e no caso de bebidas não
alcoólicas a quantidade permitida é de até 1 mg.kg-1 (LI et al., 2018).
4.4. Agentes texturizantes
Outro grande grupo de substâncias utilizadas em bebidas são os agentes

texturizantes, que podem ser adicionados como emulsificantes, estabilizantes,
espessantes e agentes de volume e são amplamente utilizados para modificar a
sua textura. Esta classe de aditivos tem uma utilização extensa, especialmente
na indústria de alimentos líquidos e bebidas, já que em muitos casos é essencial
manter a textura dos alimentos processados mais atrativa para os consumidores.
Os espessantes, por exemplo, quando adicionados às misturas, aumentam a
viscosidade sem modificar outras propriedades, enquanto os agentes de volume
aumentam o volume sem afetar seu valor nutricional. Por outro lado, os
emulsionantes permitem que a água e o óleo permaneçam misturados numa
emulsão (FAUSTINO et al., 2019).
Matta e colaboradores (2006) estudaram possíveis alterações sensoriais

devido ao uso de espessantes comerciais à base de amido no preparo de
algumas bebidas (café, leite, suco de maçã e suco de laranja). Em geral, os
espessantes não apresentaram diferenças entre si em relação a sabor e textura;
por outro lado, todos os espessantes suprimiram o sabor original das bebidas e
transferiram gostos estranhos (azedo, amargo, metálico ou adstringente),
indicando que ainda há necessidade de mais estudos para empregar estes
aditivos no setor de bebidas não alcoólicas.
Os principais agentes modificadores de textura são os oligossacarídeos

ricos em mananas, substâncias amplamente distribuídas na natureza e isoladas
de uma variedade de fontes. O mananol é utilizado em muitos produtos
alimentares, especialmente fluidos. Na indústria de bebidas, alguns
oligossacarídeos, como a goma guar, são adicionados para modificar ou ajustar
suas propriedades físico-químicas, equilibrando as características sensoriais
desses produtos (SINGH et al., 2018). A resistência desta goma à degradação
40
em condições de baixo pH e sua elevada solubilidade em água fria a torna

aplicável na indústria de bebidas, sendo utilizada como agente de controle de
viscosidade e espessante, devido às suas características reológicas. A utilização
desta goma para ajustar a viscosidade e o espessamento em produtos como
cafés (HAMDANI e WANI. 2018), mistura de suco de cereja azeda (TEIMOURI
et al., 2018) e bebidas não alcoólicas (STEINBACH et al., 2014) é relatada.
4.5. Aditivos nutricionais
Estas substâncias incluem aquelas necessárias para os processos

nutricionais e metabólicos do organismo (CFR, 2018), como tais antioxidantes,
e têm sido amplamente adicionadas a certas bebidas para melhorar a sua
qualidade nutricional. As bebidas fortificadas com vitaminas e/ou minerais estão
sendo continuamente desenvolvidas, levando a um aumento na diversificação
desses produtos, contribuindo para uma maior ingestão de nutrientes, o que
pode ser uma ferramenta eficaz para melhorar as condições de saúde pública
(SICIŃSKA et al., 2013).
Os consumidores de hoje estão mais exigentes não só quanto a qualidade

sensorial dos alimentos, mas também quanto ao seu valor nutricional. As
condições ambientais (fatores extrínsecos) e a composição dos alimentos
(fatores intrínsecos) interferem diretamente no seu estado de conservação, o
que é essencial para a manutenção da segurança dos alimentos. Contudo, cada
vez mais, além de alimentos seguros e microbiologicamente estáveis, os
consumidores exigem a disponibilidade no mercado de alimentos e bebidas com
elevado valor nutricional (MARONE et al., 2016).
Uma das principais classes de aditivos introduzidos em bebidas com valor

nutricional são os antioxidantes, como o hidroxianisol (BHA), o butil-
hidroxiquinona (BHT), a tertbutil-hidroxiquinona (TBHQ) e o propil galato (PG)
que têm sido utilizados em sistemas alimentares anti-oxidativos. Tocoferóis e
ácido ascórbico ou seus derivados estão sendo usados como alternativas ao
BHA, BHT, TBHQ e PG como antioxidantes naturais (SHAHIDI e NACZK, 2004).
Alguns estudos também estão sendo conduzidos visando a produção de

bebidas com a adição de substâncias que aumentam a biodisponibilidade dos
41
compostos presentes e, consequentemente, o seu valor nutricional. Blanco-

Morales e colaboradores (2018) avaliaram o impacto da adição de
galactooligossacarídeos (GOS) sobre a bioacessibilidade dos esteróis numa
bebida à base de fruta (tangerina e banana) enriquecida com esteróis vegetais.
Os resultados indicam que esta bebida pode ser bem empregada como matriz
alimentar para enriquecimento simultâneo com GOS e esteróis vegetais,
tornando-a uma opção de bebida mais funcional no mercado devido às
propriedades que estes aditivos proporcionam. Muitos micro-organismos
também têm sido utilizados em bebidas à base de vegetais a fim de melhorar o
valor nutricional das bebidas fermentadas de fruta. Neste contexto, Peerajan e
colaboradores (2016) desenvolveram um suco de erva fermentada (Phyllanthus
emblica fruit) para produzir um produto funcional. O uso de Lactobacillus
paracasei como cultura inicial forneceu uma bebida com alto teor fenólico e
propriedades antioxidantes.
Um ponto a ser considerado na determinação da qualidade nutricional das

bebidas são os métodos de análise que podem ser eficazes na quantificação de
componentes nutricionais adicionais. Existem alguns estudos na literatura
relativos, por exemplo, a medida da concentração das vitaminas contidas nas
bebidas. Neste contexto, Kakitani e colaboradores (2014) avaliaram a
determinação simultânea de vitaminas solúveis em água de bebidas dietéticas e
suplementos através do método de cromatografia líquida associada a
espectrometria de massas. As vitaminas avaliadas em um total de 8 bebidas
energéticas foram tiamina (B1), riboflavina (B2), ácido nicotínico (NA),
nicotinamida (NAD), pantotenato (B5), piridoxina (B6), biotina (B9),
cianocobalamina (B12), ácido ascórbico (AA), ácido desidroascórbico (DHA),
tiamina dibenzoyl (DBT), bisbentiamina (BBT), tetrabutilato de riboflavina (RFT)
e ácido ascórbico 2-glucósido (AAG).
4.6. Legislação
Vários institutos internacionais, como a European Food Safety Authority

(EFSA), têm revisto a segurança dos aditivos alimentares. A Comissão Europeia
está também revendo a legislação que regula a autorização de aditivos. Entre
outros itens, a revisão da EFSA considera a ingestão potencial de aditivos acima
42
das doses diárias aceitáveis. Desta forma, é oportuno desenvolver um

conhecimento dos atuais padrões de uso e consumo destas substâncias
(TENNANT, 2008; ZHANG et al., 2020).
O Sistema Internacional de Numeração de Aditivos Alimentares (INS, sigla

do inglês International Numbering System) foi adotado pelo Comitê do Codex
Alimentarius sobre Aditivos e Contaminantes Alimentares em 1989 com o
objetivo de consolidar todos os aditivos autorizados atualmente e fornecer uma
designação curta para ser usada em todo o mundo. O INS é uma lista aberta à
inclusão de aditivos adicionais ou remoção de aditivos existentes, sendo
frequentemente revista conforme as exigências propostas.
Águas gaseificadas ou não, sucos de frutas e vegetais e seus

concentrados, néctares de frutas e vegetais e seus concentrados, bebidas
aquosas gaseificadas e não gaseificadas, e bebidas à base de água fermentadas
ou infusionadas são as categorias que compõem as bebidas à base de água sem
álcool nas Normas Gerais para Aditivos Alimentares do Codex Alimentarius. A
concentração máxima permitida de cada aditivo é apresentada no Anexo I.
De acordo com o Codex Alimentarius, todos os aditivos submetidos aos

padrões das Boas Práticas de Fabricação devem ter qualidade e ser preparados
e manuseados da mesma forma que um ingrediente alimentar. Além disso, a
adição deve ser limitada ao nível mais baixo possível necessário para atingir o
efeito desejado (FAO/WHO, 2016).
5. Mecanismo de formação de benzeno a partir de aditivos

ácidos
O ácido ascórbico (INS 300) (Figura 2) é o antioxidante mais empregado

em bebidas. A legislação brasileira permite um limite máximo de 300 mg.L-1 de
ácido ascórbico em bebidas não alcoólicas não carbonatadas (BRASIL, 2007).
43
Figura 2. Estrutura do ácido ascórbico (RUSSEL, 1994).
O ácido benzóico (INS 211) (Figura 3) possui ação antimicrobiana tanto em

organismos procariontes, quanto eucariontes, e isso se deve à sua ampla
capacidade de ação em diferentes frentes, não existindo um único mecanismo
que explique sua atuação. A legislação brasileira permite um limite máximo de
500 mg.L-1 de ácido benzóico em bebidas não alcoólicas não carbonatadas
(BRASIL, 2007).
Figura 3. Estrutura do ácido benzóico (RUSSEL, 1994).
Os ácidos podem agir na redução do pH do meio, o que inibe o crescimento

de bactérias não acidófilas, e agem em conjunto com tratamentos térmicos, pois
a resistência dos micro-organismos ao calor é reduzida em meio ácido (RUSSEL
e GOULD, 2003).
O benzeno pode contaminar alimentos de diversas formas, como através

da migração do material da embalagem, uso de água contaminada na
preparação, decomposição térmica de componentes da matriz alimentar e
através da interação dos aditivos empregados (VARNER et al., 1991; SANTOS
et al., 2015).
Gardner e Lawrence (1993) foram os primeiros a demonstrar a formação

de benzeno a partir do ácido benzóico em presença do radical hidroxila, que por
44
sua vez tem origem da reação entre o ácido ascórbico e íons metálicos, como
por exemplo Cu+2 e Fe+3 (Figura 4), em matrizes alimentares ácidas.
Figura 4. Formação de radical hidroxila a partir de ácido ascórbico (H2Asc) em presença do íon Cu+2
(Adaptado de HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1985).
É permitida a adição do conservante tanto como ácido benzóico, quanto

na forma de seus sais, sendo o mais comum o benzoato de sódio por sua
solubilidade ser maior do que a forma não dissociada. Nas bebidas nas quais
adiciona-se conservante na forma de sal, ocorre o equilíbrio de dissociação
conforme ilustrado na Figura 5, convertendo a maior parte do sal em ácido
benzóico.
Figura 5. Equilíbrio do ácido benzóico e seu sal conjugado (Adaptado de RUSSEL, 1994).
De acordo com a Equação de Henderson-Hasselbalch (Equação 1,

RUSSEL, 1994) e supondo-se pH da bebida em torno de 3,0, o cálculo das
concentrações no equilíbrio indica que 94% do íon benzoato é convertido em
ácido benzóico (pKa do ácido = 4,19 à 25 ºC, LIDE e MILNE, 1994), que é a
forma que possui atividade antimicrobiana. O ácido benzóico, na presença do
radical hidroxila, sofre descarboxilação e forma benzeno (Figura 6), que é
conhecido por sua carcinogenicidade. A exposição crônica a esse composto
causa supressão do sistema imunológico, podendo levar a anemia, leucemia e
efeitos no trato gastrointestinal (FISPQ, 2012).
45
[𝐴− ]
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + 𝑙𝑜𝑔10 ([𝐴𝐻]) (1)
Figura 6. Mecanismo de formação do benzeno a partir da reação com radical hidroxila (Adaptado de
WIKIMEDIA COMMONS, 2016).
Além da formação do benzeno, há a possibilidade da formação de fenol

(Figura 7) a partir do radical hidroxila regenerado livre (KNISPEL et al., 1990;
BERNDT e BÖGE, 2006). O fenol apresenta toxicidade aguda oral, dérmica e
por inalação, sendo suspeito de causar mutagenicidade (FISPQ, 2011).
Figura 7. Estrutura do fenol (RUSSEL, 1994).
6. Desenvolvimento de novos aditivos
Os aditivos alimentares podem estar presentes numa variedade de

alimentos, e os consumidores estão expostos à sua ingestão desde a infância, o
que pode causar danos à saúde ao longo dos anos; contudo, os aditivos
46
alimentares são, agora, considerados essenciais nos alimentos modernos. Os

edulcorantes, conservantes, corantes e aromatizantes são adicionados aos
alimentos durante o processamento e quase todos os alimentos processados
contêm aditivos alimentares (YAMASHITA et al., 2017). A maioria dos países ou
regiões estabeleceu critérios de segurança para os aditivos alimentares.
Entretanto, alguns relatórios mostram que os aditivos alimentares estão
associados a riscos acrescidos de doenças imunológicas como o câncer (nitratos
e nitritos) (SONG et al., 2015) e alergias (edulcorantes artificiais) (MASLOVA et
al., 2013). Alguns aditivos foram considerados diretamente responsáveis por
causar várias doenças além daquelas supostamente atribuíveis ao consumo
excessivo de alimentos não saudáveis (SULLIVAN et al., 2009). Embora
algumas das associações possíveis sejam provavelmente infundadas, há fortes
evidências para algumas alegações. Vários grupos de interesse público
elaboraram listas de aditivos que geralmente devem ser evitados ou usados com
cautela, especialmente por indivíduos imunocomprometidos.
Como já mencionado, aditivos alimentares são ingredientes adicionados a

alimentos para modificar características físicas, químicas, biológicas ou
sensoriais durante a fabricação, processamento, preparação, tratamento,
embalagem, armazenamento, transporte ou distribuição. Contudo, eles devem
ter como principal característica a segurança dos consumidores. Nos últimos
anos novas substâncias têm sido utilizadas como aditivos alimentares, incluindo
para as bebidas. Os consumidores de todo o mundo exigem ingredientes
naturais nos produtos. Na indústria de bebidas, muitos fabricantes estão
respondendo com a remoção de corantes, mas os custos e problemas de
estabilidade podem criar barreiras contra esta mudança (MEPHAM, 2011,
PRESSMAN et al., 2017).
Muitas classes de substâncias, como conservantes químicos e ácidos

orgânicos, são utilizadas para conservar alimentos, especialmente bebidas. No
entanto, a demanda por conservantes químicos sintéticos está diminuindo
gradualmente devido aos possíveis efeitos colaterais que têm sido
demonstrados à medida que as pesquisas avançam, causando pressão da
sociedade por alimentos seguros, forçando a redução ou restrição da aplicação
47
dessas substâncias. Assim, conservantes naturais que possam substituir os

sintéticos têm sido cada vez mais estudados (CHOI et al., 2018).
Desde os tempos antigos, o homem tem usado plantas tanto como alimento
quanto como fontes de vários compostos bioativos valiosos. Atualmente,
extratos de ervas medicinais e aromáticas são usados como aditivos alimentares
e de cosméticos (como óleos essenciais, ácido rosmarínico, vanilina), corantes
naturais (como betaínas, antocianinas), biopesticidas (como nicotina, rotenona,
rinidina) e medicamentos fitoterápicos (terpenos), ácidos, ácidos fenólicos,
alcalóides (vinblastina, vincristina, cafeína, nicotina, efedrina) (VRANCHEVA et
al., 2018). Mesmo com a grande variedade de compostos já conhecidos e
utilizados com propriedades conservantes nos alimentos, a ciência e a
tecnologia dos alimentos ainda procuram substâncias inócuas para os
consumidores e que possam ser utilizadas com o propósito de preservar ou
melhorar algumas das propriedades dos alimentos. Nesta seção, procurou-se
abordar os aditivos alimentares que têm sido utilizados mais recentemente na
indústria alimentícia.
6.1. Óleos essenciais
Os óleos essenciais são compostos aromáticos naturais com atividades

biológicas de amplo espectro. Muitas destas substâncias têm fortes atividades
antibacterianas, antivirais e antifúngicas, favorecendo a sua aplicação também
como antimicrobianos naturais em alimentos e bebidas (DONSÌ et al., 2016).
Para alcançar uma aplicação tecnológica adequada dos óleos essenciais como
conservantes no processamento de alimentos, é necessário estabelecer
condições ideais de aplicação, tais como conhecer a sensibilidade do micro-
organismo e as melhores concentrações do composto ativo utilizado. Algumas
substâncias que têm sido destacadas em relação ao uso como conservantes são
os óleos essenciais extraídos da árvore do chá. O Tea Tree Oil (TTO) é extraído
por destilação a vapor das folhas da Melaleuca alternifolia (pertencente à família
das Myrtaceae), que é uma planta nativa da Austrália, e seu óleo comumente
chamado de Australian tea tree oil (um líquido incolor a amarelo pálido com um
forte odor a cânfora) (HAMMER, 2015). O TTO tem sido amplamente utilizado
como agente antimicrobiano e anti-inflamatório, o que se deve especialmente ao
48
terpinen-4-ol e 1,8-cineole, o principal componente deste óleo (FURNERI et al.,

2006). Este extrato tem propriedades antibacterianas, anti-inflamatórias,
antivirais, inseticidas e imunológicas e é utilizado em técnicas de aromaterapia
com diversas misturas, como limão, lavanda, eucalipto, gengibre e outras, no
tratamento de várias doenças (ALI et al., 2015).
Vários estudos apresentam resultados positivos sobre a ação da TTO

contra alguns micro-organismos. Neto e colaboradores (2019) avaliaram a ação
de alguns óleos essenciais contra o crescimento de Penicillium expansum, um
patógeno cosmopolita que pode representar vários danos em alguns frutos.
Todos os óleos avaliados apresentaram efeitos promissores, incluindo o TTO,
conseguindo 100% de inibição da germinação fúngica, causando danos na
membrana plasmática e levando a perda do DNA. Hammer e colaboradores
(2004) investigaram o mecanismo de ação do TTO e seus componentes contra
Candida albicans, C. glabrata e Saccharomyces cerevisiae e concluíram que
estes micro-organismos foram inibidos usando doses de 0,2% de óleo de
melaleuca, provando a atividade antifúngica destas substâncias. A maioria dos
estudos considerou o encapsulamento dos óleos essenciais de forma a reduzir
o impacto nas propriedades sensoriais dos alimentos, tornando possível o uso
destas substâncias em alimentos ou bebidas. Lin e colaboradores (2018)
investigaram a síntese de microesferas de TTO com propriedades
antibacterianas e concluíram que este óleo tinha maior estabilidade na forma
encapsulada desenvolvida durante os estudos (utilizando metacrilato de butilo
(BMA) e estireno (St) como suporte), sendo completamente decomposto à
medida que a temperatura aumentava de 110 °C para 150 °C. Além disso, foram
realizados testes para avaliar a atividade antimicrobiana contra a bactéria
Escherichia coli, através da análise das zonas de inibição, que foram maiores
proporcionalmente à quantidade de TTO utilizada.
A utilização desta substância como conservante alimentício é uma

ferramenta promissora para a indústria dada a necessidade de aplicar produtos
considerados naturais e que causam menos efeitos nocivos para a saúde dos
consumidores. O uso de óleos essenciais como uma técnica de preservação
branda na indústria alimentícia tem recebido muita atenção nos últimos anos,
49
especialmente devido à percepção negativa dos consumidores sobre o uso de

conservantes sintéticos (SEOW et al., 2014, CAROCHO et al., 2014).
6.2. Peptídeos antimicrobianos
Normalmente, a indústria de alimentos depende de produtos químicos para

sua conservação e para o aumento da vida comercial dos produtos. O uso de
conservantes químicos como nitritos e dióxido de enxofre pode causar efeitos
adversos na saúde humana, uma vez que em muitos casos a adição excessiva
de certas substâncias tem resultado na adaptação e resistência dos micro-
organismos (RAI et al., 2016). O crescimento e a resistência das bactérias aos
antibióticos tradicionais levaram a busca de novas substâncias eficazes contra
esses micro-organismos, incentivando a pesquisa e o desenvolvimento de novos
antimicrobianos. Uma área promissora neste campo é o desenvolvimento de
peptídeos antimicrobianos (AMPs), que atuam como potenciais armas de defesa
contra um amplo espectro de patógenos bacterianos e fúngicos (LAVERTY et
al., 2011).
Os peptídeos ativos são fragmentos de proteínas específicas com

propriedades multifuncionais e muitos deles têm atividade biológica, entre os
quais podemos destacar: antimicrobianos, anti-hipertensivos,
imunomoduladores, opióides e antioxidantes (NIELSEN et al., 2017). Estes
peptídeos têm cadeias curtas (geralmente entre 12 e 100 resíduos de
aminoácidos) e exibem uma toxicidade eficaz contra uma grande variedade de
patógenos. A literatura relata mais de 1700 peptídeos antimicrobianos
endógenos isolados e um número ainda maior de análogos sintéticos relatados
(VAN’T HOF et al., 2001). As análises estruturais indicam que a atividade
antimicrobiana é governada principalmente pela carga e pela hidrofobicidade e
que o alvo inicial é a membrana celular carregada negativamente (POWERS e
HANCOCK, 2003). Os peptídeos antimicrobianos (AMPs) podem inibir o
crescimento bacteriano e fúngico matando células por vazamento citoplasmático
relacionado a perturbações da membrana e mecanismos de formação de poros
(MAKOVITZKI et al., 2008; GEE et al., 2013).
A indústria de bebidas também é susceptível à contaminação microbiana,
embora seu baixo pH evite a deterioração bacteriana, o crescimento fúngico
50
pode ocorrer. As leveduras são os contaminantes principais destes produtos

devido à sua capacidade de crescimento em bebidas carbonatadas e com baixo
pH (BATTEY et al., 2002, KREGIEL, 2015). O maior benefício do uso de
peptídeos antimicrobianos é a possibilidade de preservar os alimentos sem
alterar sua qualidade e, dadas as dificuldades que existem em manter seu estado
natural, o uso de micro-organismos e seus produtos antimicrobianos pode
prolongar a vida comercial e aumentar a segurança dos alimentos (CAROCHO
et al, 2014).
Alguns estudos mostraram o uso de peptídeos em filmes de

polissacarídeos com potencial atividade antibacteriana contra bactérias Gram-
positivas e Gram-negativas (SANTOS et al., 2018A; WU et al., 2019). Outros
estudos procuraram produzir peptídeos bioativos a partir de leite bovino e
caprino, que foram gerados a partir de produtos fúngicos de Aspergillus oryzae
e A. flavipes (ZANUTTO-ELGUI et al., 2019; BENKERROUM et al., 2010).
Abriouel e colaboradores (2010) estudaram o uso de bacteriocinas (chamadas
AS-48) em vários produtos vegetais, incluindo sucos de frutas, e concluíram que
este peptídeo antimicrobiano pode agir como um aditivo natural ou desinfetante.
Nestas bebidas, a bacteriocina demonstrou ser altamente ativa contra bactérias
que formam esporos, bactérias deterioradoras, assim como para bactérias
lácticas, tendo eficácia mesmo em baixas concentrações.
6.3. Saponinas
As saponinas são glicosídeos anfipáticos estruturalmente complexos de

esteróides e triterpenóides que são amplamente produzidos por plantas e por
certos organismos marinhos, como estrelas-do-mar e pepinos do mar (FAIZAL e
GEELEN, 2013). Estas substâncias têm elevado peso molecular e estão
amplamente distribuídas, especialmente em espécies vegetais, sendo os
glicosídeos que apresentam múltiplas propriedades biológicas e de
conservação, bem como atividades antioxidante, antimicrobiana, hipoglicêmica,
anti-inflamatória, citotóxica e antitumoral (MAN et al., 2010).
Alguns estudos foram publicados na literatura e demonstram o sucesso do

uso das saponinas com atividade antimicrobiana. Por exemplo, Chan e
51
colaboradores (2014) estudaram o potencial de resíduos agroindustriais

subutilizados como fonte de conservantes naturais, nutracêuticos e ingredientes
alimentares funcionais extraindo as saponinas das sementes. Choi e
colaboradores (2018) investigaram a aplicabilidade de extratos de sementes de
chá verde (contendo saponinas asaponina E1, assamsaponina A, e
assamsaponina B) como conservante natural com ação anti-leveduras em
molhos de soja. Para desenvolver conservantes alimentares naturais,
Gundewadi e colaboradores (2018) desenvolveram nanoemulsões à base de
óleo usando o extrato de pericarpo de Sapindusmukorossi e verificaram sua ação
inibidora contra fungos deteriorantes, como Penicillium chrysogenum e
Aspergillus flavus, conseguindo eficácia de 64-67% de atividade inibidora
quando comparado com o fungicida comercial Carbendazin.
Na América do Sul, há o alto consumo de bebidas à base de folhas de mate

(Ilex paraguariensis A. St. Hil.), que são ricas em saponinas, o que dá a essas
bebidas certas propriedades antioxidantes além de contribuir para a
conservação. Por outro lado, apesar da comprovada ação antioxidante e
antimicrobiana destes compostos, um estudo publicado por Morton e Murray
(2001) mostrou uma interação entre saponinas e proteínas presentes nas
bebidas carbonatadas formando flocos ácidos. Esses autores comprovaram sua
teoria mostrando que as saponinas e proteínas, quando misturadas em
condições ácidas (pH 2), e de matrizes complexas, aumentam a turbidez dessas
bebidas e dificultam seu uso em conjunto.
6.4. Flavonóides
Como mencionado, vários extratos vegetais contêm compostos

antimicrobianos de controle ou conservação e podem ser aplicados como
aditivos alimentares naturais em vários tipos de alimentos. Algumas plantas
medicinais e aromáticas são ricas em compostos como polifenóis, saponinas,
alcalóides e flavonóides (AL-HUQAIL et al., 2019). Os flavonóides são
compostos biologicamente ativos com alto potencial antioxidante e numerosos
benefícios à saúde (CHHIKARA et al., 2018). Estes são encontrados em diversas
plantas (em frutos, folhas e sementes) e muitos estudos têm buscado sua
52
extração para aplicações posteriores como antioxidantes naturais (MOHDALY et

al., 2010).
Os flavonóides são a classe de polifenóis mais amplamente estudada em

relação às suas atividades antioxidantes e biológicas, tendo alta atividade
antioxidante in vitro e sendo reativos com uma ampla gama de espécies reativas
de oxigênio e nitrogênio, tais como superóxido, hidroxila e radicais peroxila
(MAQSOOD et al., 2013).
Peanparkdee e Iwamoto (2019) publicaram uma revisão sobre a extração

e aplicação de compostos bioativos a partir de subprodutos de culturas e
processamento de arroz e sua aplicação em alimentos e produtos farmacêuticos.
Segundo este estudo, os flavonóides estão entre estes compostos e possuem
capacidade antioxidante. Portanto, a sua utilização pode melhorar a estabilidade
no armazenamento de alimentos. El-Maati e colaboradores (2016) estudaram a
extração de compostos bioativos de dentes de alho em relação ao seu conteúdo
fenólico e ao seu potencial antioxidante e antibacteriano, devido ao amplo
espectro de atividade bioquímica e biológica, incluindo a atividade anti-radical.
Esses autores observaram que a água era o melhor solvente para a extração de
flavonóides (17,5 mg/g de extrato).
Baseado nos conceitos e dados vistos anteriormente, serão apresentados

a seguir, em capítulos, os estudos realizados durante essa tese de doutorado.
53
Capítulo 1 – Prevalência de micro-organismos em bebidas não

alcoólicas comerciais
1. Introdução
O mundo moderno tem imposto às pessoas que os alimentos e bebidas

sejam cada vez mais práticos, com fácil acesso e preparo. O hábito de consumir
bebidas não alcoólicas prontas para consumo aqueceu o nicho de mercado
desse setor industrial por ser relativamente fácil de produzir e a baixo custo.
Dados de consumo mundial demonstram expectativa de crescimento do setor
em todos os continentes até 2021 (STATISTA, 2018).
A produção, muitas vezes sem controle adequado de processo, levanta o
problema da falta de qualidade microbiológica, com o surgimento principalmente
de micro-organismos deterioradores os quais alteram o perfil sensorial e
comprometem a imagem da empresa produtora. O pH de bebidas não alcoólicas,
carbonatadas ou não, é normalmente menor que 4,0 e, portanto, abaixo da faixa
para crescimento de grande parte das bactérias, principalmente as patogênicas
(LAWLOR et al., 2009).
O maior foco de estudos sobre o crescimento de micro-organismos nessa
matriz alimentar é naqueles com potencial deteriorador, como bactérias lácticas,
acéticas, fungos filamentosos e leveduras (KREGIEL, 2015). Sabores
indesejáveis e estufamento das embalagens são os únicos parâmetros que os
produtores têm para detectar a deterioração quando, em muitas ocasiões, a
reputação da marca já foi abalada.
Tendo em vista a difusão desse tipo de produto e o surgimento de novas
indústrias no setor, este trabalho visou identificar os principais micro-organismos
contaminantes de indústrias de bebidas não alcoólicas, gerando um panorama
dos principais agentes a nível microbiológico que possam servir de base para o
controle não somente das indústrias estudadas, como para indústrias correlatas,
apresentando um cenário real. Sendo assim, compilaram-se dados de diversas
análises microbiológicas em bebidas não alcoólicas distintas produzidas por
duas indústrias diferentes, uma da região sudeste do Brasil e outra da Bolívia,
que foram analisadas em busca de contaminantes.
54
2. Materiais e métodos
2.1. Amostras
Todas as amostras de bebidas, agrupadas no Quadro 1, foram recebidas das

indústrias parceiras em suas embalagens originais e analisadas de forma que
nenhuma contaminação externa, não representativa do cenário real, fosse
incorporada.
Quadro 1. Origem, amostras analisadas e formas de apresentação das bebidas estudadas.
Origem Amostras Forma de apresentação
Refresco de limão Copo PP*, 290 mL, normal

Refresco de limonada suíça Copo PP, 290 mL, normal
Refresco de maracujá Garrafa PET**, 510 mL, estufada
Copo PP, 290 mL, estufada
Refresco de açaí com guaraná
Brasil Garrafa PET, 510 mL, estufada
Garrafa PET, 510 mL, normal e estufada
Refresco de uva com maçã
Garrafa PET, 1 L, normal
Refresco de pêssego com maçã Garrafa PET, 510 mL, normal
Refresco de frutas tropicas Garrafa PET, 510 mL, normal
Suco de laranja Garrafa PET, 300 mL, deteriorada
Isotônico de morango Garrafa PET, 500 mL, deteriorada
Bolívia
Isotônico de uva Garrafa PET, 500 mL, deteriorada
Água mineral sem gás Garrafa PET, 500 mL, deteriorada
*PP: polipropileno; **PET: politereftalato de etileno
As amostras, todas não carbonatadas, eram recebidas e analisadas

conforme a demanda das indústrias estudadas. Além dos produtos acabados,
diversas polpas de frutas e amostras ambientais, de origem da indústria
brasileira, foram analisadas em meios de cultivo adequados.
Algumas das amostras de bebidas foram analisadas após estufamento e a
presença de micro-organismos e de deterioração era visível, mesmo estando
todas dentro da validade comercial.
55
2.2. Metodologias
Os meios de cultura Ágar Soro de Laranja (OSA, do inglês Orange Serum

Agar) e Ágar Dicloran Rosa Bengala Cloranfenicol (DRBC) foram empregados
respectivamente, para contagem de aeróbios mesófilos totais e para fungos
filamentosos e leveduras em todos os produtos analisados da indústria brasileira
(PITT e HOCKING, 2009).
As análises usando Ágar Soro de Laranja (pH=5,5), muito empregado em
análises de rotina na indústria de bebidas, são indicadas para o isolamento de
micro-organismos aeróbios totais em frutas cítricas e derivados (PETTIPHER et
al, 1997; BARTH et al., 2009). Através do método pour plate, em duplicata de
cada diluição, inoculou-se 1 mL de cada amostra em OSA e incubou-se em
estufa a 35 ºC por 72 horas (ENTIS et al., 2015).
O Agar Dicloran Rosa Bengala Cloranfenicol (DRBC, pH=5,6) foi usado
para isolamento de leveduras e fungos filamentosos das amostras. Esse meio
se caracteriza pela presença de antibióticos, que inibem o crescimento de
bactérias, auxiliando o isolamento das colônias-alvo, já que possuem
crescimento mais lento (PITT & HOCKING, 2009).
Nas colônias identificadas como leveduras, realizou-se o teste de
fermentação da glicose em caldo Yeast Extract Peptone Dextrose (YEPD,
pH=6,5) com tubos de Durham invertidos. Os tubos foram incubados à 25ºC por
72 horas (BEUCHAT & PITT, 2015). A fermentação dos isolados foi confirmada
pela formação de gás nos tubos de Durham.
Para estas mesmas leveduras foi realizado o teste de resistência a
conservantes inoculando-se os isolados do meio DRBC em meio Tryptone
Glucose Yeast Extract suplementado com ácido acético glacial (TGYA, pH=3,5)
e incubando-se à 25 °C por 72 horas (PITT & HOCKING, 2009, BEUCHAT &
PITT, 2015).
As amostras da indústria boliviana, por apresentarem crescimento visível
de micélios fúngicos flutuantes, foram analisados com o meio Ágar Extrato de
Malte (MEA, do inglês Malt Extract Agar, pH=5,5), mas específico para o
isolamento de fungos filamentosos, em substituição ao DRBC e, também no
meio OSA. A análise dos micélios foi feita pela técnica de ponto de inóculo, além
56
do plaqueamento direto em superfície (PITT & HOCKING, 2009; LAWLOR et al.,

2009).
O meio de cultivo Malt Extract Agar (MEA) é um meio ácido usado para o
cultivo de fungos filamentosos e leveduras, geralmente inibindo o crescimento
de bactérias. Todas as placas foram incubadas em temperatura de 25 °C por
30 dias, com observações periódicas de crescimento (PITT; HOCKING, 2009).
Todas as colônias isoladas foram submetidas à coloração de Gram ou por
Azul de Lactofenol a observação microscópica foi realizada com aumento total
de 1000x em microscópio óptico Eclipse E200 Nikon® acoplado a uma câmera
Evolution VF Media Cybernetics® ligado a um computador com software Image-
Pro Plus® 5.0. Posteriormente, os isolados foram identificados por Ionização por
Dessorção a Laser de Matriz Associada – Tempo de Voo (MALDI-TOF, do inglês
Matrix Associated Laser Desorption-Ionization - Time of Flight), como
apresentado de forma simplificada na Figura 1.
Os fungos filamentosos isolados não identificados por MALDI-TOF foram
encaminhados ao Laboratório de Pesquisas Micológicas (LAPEMI) da
Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), para identificação fenotípica.
Coloração
Microscópio óptico
25oC/48h para leveduras

e fungos filamentosos
35oC/24h para bactérias
(nos meios específicos)
MALDI-TOF
Figura 1. Esquema simplificado de identificação dos isolados através da espectrometria Matrix Associated
Laser Desorption-Ionization - Time of Flight (MALDI-TOF).
57
3. Resultados e Discussão
A Figura 2 apresenta um gráfico da população microbiana e o percentual

de prevalência, categorizado em fungos filamentosos, leveduras, bactérias Gram
positivas, Gram negativas e Gram variáveis, de todas amostras de bebidas não
alcoólicas de aspecto normal que foram analisadas. No total, foram isolados 13
micro-organismos dessas bebidas, e sete foram identificados com sucesso por
espectrometria MALDI-TOF.
7,7%
23,1%
23,1%
Fungo filamentoso
Bactéria Gram +
Bactéria Gram -
Bactéria Gram +/-
46,1%
Figura 2. Percentual de prevalência de tipos de micro-organismos distintos nas bebidas não alcoólicas
estudadas de aspecto normal.
Na Figura 3, apresenta-se o mesmo gráfico de percentual de prevalência

dos tipos de micro-organismos estudados, porém das bebidas estufadas e/ou
com crescimento microbiano visível. Dos 16 isolados, todos foram identificados,
mas alguns fungos filamentosos somente puderam ser conhecidos através da
identificação fenotípica, por não estarem presentes no banco de dados do
MALDI-TOF.
Avaliando-se cada bebida isoladamente, observou-se que sempre que
houve crescimento de leveduras, micro-organismos reconhecidos como
potenciais fermentadores, as embalagens das bebidas estavam notadamente
estufadas. Porém, nem sempre que as embalagens estavam estufadas isolaram-
58
se leveduras, sendo relevante ressaltar que uma gama de bactérias é capaz de

produzir gás como coproduto de seu metabolismo.
12,5%
25,0%
12,5%
Fungo filamentoso
Levedura
Bactéria Gram +
Bactéria Gram -
31,25% Bactéria Gram +/-
18,75%
Figura 3. Percentual de prevalência de tipos de micro-organismos distintos nas bebidas não alcoólicas
estudadas estufadas e/ou com crescimento microbiano visível.
Na indústria da região Sudeste, localizada em São Paulo, além dos

produtos acabados, amostras de polpas de frutas e ambientais também foram
analisadas. Da polpa de açaí foram isoladas bactérias, tanto Gram positiva
quanto Gram negativa, além de leveduras e fungos filamentosos. Na polpa de
maracujá, uma bactéria Gram negativa foi isolada. Das amostras ambientais,
coletadas com swabs de superfícies da indústria, uma bactéria Gram positiva e
outra Gram negativa foram isoladas. Desses sete micro-organismos, cinco foram
identificados por MALDI-TOF.
As bactérias que foram identificadas por espectrometria de massas nas
bebidas com embalagens estufadas foram Bacillus sp., Brevibacillus sp. e
Staphylococcus sp., gêneros reconhecidos por fermentar açúcares (RAMOS et
al., 2000; PANDA et al., 2014; MAINAR et al., 2016). Em uma das embalagens
estufadas, do refresco sabor uva e maçã, isolou-se um fungo filamentoso
identificado como Penicillium sp.. Porém, de acordo com a literatura, não foi
possível associar a produção de gás a esse micro-organismo, e sim aos demais
identificados da mesma amostra: Brevibacillus agri e Staphylococcus sp..
Bactérias do gênero Staphylococcus sp., que foram isoladas apenas de
refrescos com embalagens estufadas, são bactérias Gram positivas, anaeróbias
59
facultativas e com espécies patogênicas produtoras de toxinas, que não são

inativadas por processos térmicos.
Os micro-organismos Staphylococcus spp. coagulase negativa possuem
baixa virulência e são comuns na pele humana. Staphylococcus spp. coagulase
positiva, que são comumente classificados como S. aureus, são responsáveis
pela síndrome emética, por conta da produção de suas toxinas, e são um dos
grandes responsáveis por intoxicações alimentares em seres humanos. A
higienização adequada das mãos dos manipuladores e dos equipamentos é
essencial para o controle da disseminação desses micro-organismos nos
produtos acabados (LE LOIR et al., 2003; SOUSA et al., 2018; BOHRZ et al.,
2019). A Figura 4A mostra a imagem da microscopia do micro-organismo isolado
da bebida de maracujá com embalagem estufada. Todas as imagens foram feitas
com aumento total de 1000x para melhor observação das estruturas.
O fungo filamentoso Penicillium sp. vive naturalmente no solo, e é isolado
principalmente de frutas, grãos, vegetais e raízes. Produz micotoxinas, no
entanto não é reconhecido por causar doenças em humanos, salvo por algumas
espécies e apenas em indivíduos imuno comprometidos. Por ser capaz de
esporular, pode ser encontrado no ar, onde precisa encontrar um substrato viável
e condições adequadas para se desenvolver (FILTENBORG et al., 1996;
RAWAT, 2015). A Figura 4B mostra a microscopia do micro-organismo isolado
da bebida de uva e maçã com embalagem estufada.
Em relação às bebidas acondicionadas em embalagens de aspecto normal,
a população é 92,3% de bactérias (Figura 2), e nem todas foram passíveis de
identificação por espectrometria de massas, o que pode ser associado ao banco
de dados do software, que ainda é muito restrito e voltado para micro-organismos
de interesse clínico (CROXATTO et al., 2012; STEIN et al., 2018).
Alguns resultados foram interessantes, como o isolamento de Roseomonas
mucosa na bebida sabor limão zero, que é uma bactéria Gram negativa, em
forma de coco-bacilos, de crescimento lento, aeróbia, não fermentadora, e de
baixa patogenicidade. A Figura 4C apresenta a microscopia do isolado da bebida
sabor limão zero. Bactérias do gênero Roseomonas spp. estão amplamente
distribuídas no solo, na água e no ar e, como possuem baixa patogenicidade,
somente causam complicações a imuno deprimidos, como bacteremia em
indivíduos sujeitos à quimioterapia (KIM et al., 2016).
60
Bactérias do gênero Bacillus sp., e mais especificamente das espécies B.

cereus e B. megaterium, foram isoladas tanto a partir de bebidas com
embalagens de aspecto normal e estufado, quanto de amostras de polpas. Esse
gênero é composto por bactérias Gram positivas, anaeróbias facultativas e com
capacidade de esporular quando submetidas a condições de estresse, e tem
como ambiente primário o solo (RAMOS et al., 2000; VALAPPIL et al., 2007).
Nem todas as espécies são patogênicas, porém B. cereus é reconhecido por ser
responsável por doenças de origem alimentar em que o paciente apresenta
síndrome diarreica e/ou emética, ambas decorrentes da produção de toxinas por
esse micro-organismo (ARNESEN et al., 2008). Bacillus megaterium é uma
espécie de bactéria não patogênica muito encontrada no solo por sua ação
fertilizante, visto que é capaz de solubilizar fosfatos naturais, aumentando a
disponibilidade de fósforo para as plantas. A Figura 4D apresenta a imagem da
microscopia de Bacillus sp. isolado da polpa de açaí.
Brevibacillus spp. são bactérias aeróbias, Gram positivas e, assim como
Bacillus spp., são capazes de esporular quando submetidas a condições de
estresse. São de vida livre, sendo comumente encontradas em água, solo, ar e
matéria orgânica em decomposição. Raramente causam infecções, sendo
consideradas não-patogênicas, salvo pela exposição da espécie B. brevis em
indivíduos imuno comprometidos. Brevibacillus agri é uma espécie não
patogênica muito associada ao solo, onde é responsável por degradação de
matéria orgânica (PANDA et al., 2014). Na Figura 4E observa-se a microscopia
de Brevibacillus sp. isolado da bebida sabor pêssego e maçã.
Nas embalagens analisadas de produtos sem sinais visíveis de
deterioração, as bactérias Gluconacetobacter liquefaciens e Brevibacillus agri
foram isoladas. Gluconacetobacter liquefaciens pertence à família
Acetobacteraceae, assim como o gênero encontrado em estudo anterior (SILVA
et al., 2019A) reforçando a relevância das bactérias acéticas como
deterioradoras das bebidas não alcoólicas a base de frutas. Esse gênero foi o
mesmo isolado no trabalho de Moore e colaboradores (2002), que analisaram
água flavorizada de frutas.
Pseudomonas fluorescens foi isolada a partir da bebida sabor pêssego e
maçã, acondicionada em embalagem com aspecto normal. A Figura 4F mostra
a imagem da microscopia desse micro-organismo. Trata-se de uma bactéria
61
Gram negativa, flagelada, e com formato de bastonete. É comumente isolada em

amostras de solo e água e não é usualmente conhecida por causar doenças
(DEL OLMO et al., 2018).
A B
C D
E F
Figura 4. Microscopia, com aumento total de 1000x, dos isolados identificados por
espectrometria de massas MALDI-TOF.
A) Staphylococcus sp. isolado de bebida sabor maracujá em embalagem estufada.
B) Penicillium sp. isolado de bebida sabor uva e maçã em embalagem estufada.
C) Roseomonas mucosa isolada de bebida sabor limão zero.
D) Bacillus sp. isolado de polpa de açaí.
E) Brevibacillus sp. isolado de bebida sabor pêssego e maçã.
F) Pseudomonas fluorescens isolada de bebida sabor pêssego e maçã.
O fungo filamentoso Aspergillus sp. foi isolado a partir da polpa de açaí e

a Figura 4G mostra sua imagem de microscopia. Fungos do gênero Aspergillus
62
sp. são amplamente encontrados na natureza, como no solo, ar e matéria

orgânica, e são importantes deterioradores de alimentos. Podem causar
infecções subcutâneas e aspergilose em indivíduos imuno comprometidos
(FILTENBORG et al., 1996; RAWAT, 2015).
Nas amostras ambientais analisadas foi possível identificar dois micro-
organismos: Mycobacterium mucogenicum e Pseudomonas putida. As
micobactérias são organismos estritamente aeróbios e, apesar de não corarem
adequadamente pela técnica do Gram, assemelham-se às bactérias Gram
positivas. São patogênicas e diversas espécies já foram encontradas em
amostras de água, solo e alimentos. Mycobacterium mucogenicum já foi isolada
em indivíduos com bacteremia, sepse e pneumonia (CERNA-CORTES et al.,
2009), mas infecções por micobactérias geralmente só acometem imuno
comprometidos, salvo exceções com as espécies M. tuberculosis e M. leprae,
que causam, respectivamente, tuberculose e hanseníase. A Figura 4H mostra a
imagem da microscopia de M. mucogenicum isolado de amostra do ambiente.
Pseudomonas putida é uma bactéria Gram negativa, saprófita, que vive
no solo. As infecções por Pseudomonas spp. geralmente ocorrem em indivíduos
imuno comprometidos, e a espécie P. aeruginosa é considerada a mais
patogênica, comumente associada a infecções hospitalares. A presença desse
gênero já foi relatada em águas minerais (TIMMIS et al., 2002, COELHO, 2010).
A Figura 4I mostra a imagem da microscopia de P. putida isolada de amostra do
ambiente.
Em relação às leveduras, Zygosaccharomyces bisporus (Figura 4J) foi
isolada de copos e garrafas de bebida estufados sabor açaí com guaraná e uva
com maçã. As leveduras são consideradas os principais deterioradores em
bebidas carbonatadas, devido a sua capacidade de resistir a alta concentração
de CO2 e baixos níveis de pH (KREGIEL, 2012; SHARMA e SHARMA, 2020), e
nas bebidas não carbonatadas que foram estudadas, seu crescimento foi ainda
mais favorecido.
Dentre os gêneros de leveduras deterioradoras comumente isolados de
bebidas não alcoólicas encontram-se Saccharomyces spp., Brettanomyces spp.,
Hanseniaspora spp., Hansenula spp., e Pichia spp. (LAWLOR et al., 2009;
SPERBER et al., 2009). Zygosaccharomyces é um gênero muito relatado como
deteriorador em potencial da indústria de alimentos (LOUREIRO e MALFEITO-
63
FERREIRA, 2003; LOUREIRO e QUEROL, 1999) por sua resistência aos

métodos usuais de conservação, como alta concentração de açúcares, de
etanol, de ácido acético e até de conservantes como ácido sórbico e ácido
benzóico.
G H
I J
Figura 4 cont. Microscopia, com aumento total de 1000x, dos isolados identificados por
espectrometria de massas MALDI-TOF.
G) Aspergillus sp. isolado de polpa de açaí.
.
H) Mycobacterium mucogenicum isolado de amostras ambientais.
I) Pseudomonas putida isolada de amostras ambientais.
J) Zygosaccharomyces bisporus isolada de bebidas sabor uva e maçã / açaí com guaraná em
embalagens estufadas.
Nas análises das bebidas oriundas da Bolívia, quatro fungos foram

encontrados (Figura 5), isolados por meio da técnica de repique, e identificados
através de observação e descrição de suas características macro e
microscópicas, segundo a técnica de Pitt e Hocking (2009).
Fungos filamentosos Aspergillus flavus (Figura 5A) e Penicillium citrinum
(Figura 5B) encontrados no suco de laranja foram isolados em ambos meios de
cultura (MEA e OSA), demostrando que os mesmos encontravam-se não
somente na forma de micélio visível, mas também com estruturas dispersas na
64
bebida. Esse resultado é corroborado pelo estudo de Santos e colaboradores

(2018B), que isolaram fungos Aspergillus spp. na linha de processo de suco de
laranja. Em 2019, Obasi e colaboradores também detectaram a presença do
gênero Aspergillus em uma de suas amostras, quando a segurança
microbiológica de sucos de laranja processados e comercializados estava sendo
avaliada.
A B
C D
Figura 5. Microscopia, com aumento total de 1000x, dos fungos filamentosos isolados da indústria
boliviana identificados através de características fenotípicas.
A) Aspergillus flavus isolado de suco de laranja.
B) Penicillium citrinum isolado de suco de laranja.
C) Paecilomyces niveus isolado de isotônico de morango.
D) Paecilomyces variotii isolado de isotônico de uva.
No isotônico de morango foi isolado um gênero diferente dos até então

encontrados nesse trabalho. Paecilomyces niveus (Figura 5C), que tem como
teleomorfo Byssochlamys nivea (BEUCHAT; RICE, 1979), já foi isolado em
morangos enlatados na Holanda (PITT; HOCKING, 2009). É comum encontrar
fungos em morangos, devido a sua alta perecibilidade quando in natura, e
mesmo quando são minimamente processados para consumo, podem ainda ter
a presença de fungos, como Fusarium spp. e Cladosporium spp. (PONCE et al.,
2010). Giowanella e colaboradores (2010) monitoraram a produção de
65
morangos, identificando fungos Acremonium spp., Aspergillus spp.,

Cladosporium spp. e Penicillium spp., sugerindo que boas práticas de higiene na
colheita, embalagem e armazenamento poderiam minimizar a contaminação da
fruta.
Aspergillus spp. e Cladosporium spp. são comumente encontrados em
uvas, assim como Acremonium spp., Alternaria spp., Fusarium spp. e Penicillium
spp. (ABDEL-AAL et al., 2018). Embora o fungo Paecilomyces variotii (Figura 5D)
não seja comum em produtos derivados de uva, este foi isolado na amostra
analisada de isotônico sabor uva, possivelmente por contaminação cruzada
dentro da própria indústria. Esses dados mostram a amplitude de gêneros
fúngicos que podem colonizar frutas, como as uvas, caso não sejam aplicadas
as BPFs ao longo do processo.
Da amostra de água mineral analisada, foram isolados dois gêneros de
bactérias Gram negativas, Methylobacterium rhodinum e Pantoea dispersa,
ambas são habitantes de solo e água e não são reconhecidas por causar
doenças em humanos, salvo em indivíduos imuno comprometidos (CHAUDHRY
et al., 2016; JIANG et al., 2019).
Boas Práticas de Fabricação são importantes desde o início do processo,
com a correta higienização de tudo que é recebido e da linha de produção, com
utilização de produtos adequados, combinando limpeza física e química quando
necessário. As BPFs, que incluem correta assepsia das mãos e superfícies que
entram em contato com o alimento e adequado armazenamento, estocagem e
higienização de matérias-primas, são capazes de assegurar a redução da carga
microbiana do produto final. Para os micro-organismos que forem capazes de
sobreviver a essas medidas, o tratamento térmico deve ter o adequado binômio
“tempo x temperatura” capaz de tornar o alimento seguro para o consumo, ou
ainda, devem ser implementados aditivos antimicrobianos. A presença dessa
população de micro-organismos isolados nas bebidas não alcoólicas
basicamente reflete falha no processo de higienização das matérias-primas,
visto que a principal origem desses contaminantes é o solo e a água.
É imperativo evitar a contaminação cruzada de produtos processados e não
processados e treinar os colaboradores para que compreendam tanto a
importância da própria higiene, quanto a do processo, de modo a serem
66
comprometidos com a qualidade dos produtos e tendo consciência de que

podem causar desagrado sensorial ao consumidor, e também doenças.
Dentre as espécies isoladas e identificadas nesse trabalho, existem
aquelas com potencial de formar biofilmes bacterianos nas superfícies
industriais, que provavelmente abrigam, protegem e perpetuam contaminações
por outros micro-organismos, majoritariamente oriundos da própria matéria-
prima, mas que em determinadas concentrações deterioram os produtos,
causando estufamento de embalagens, sabores indesejáveis e turbidez.
Biofilmes são estruturas tão complexas e resistentes que alguns estudos
mostram que mesmo tratamentos térmico e químico (ozônio e cloro) podem não
ser eficientes (DOSTI et al., 2005). É preciso que as indústrias de alimentos
estejam mais atentas aos biofilmes e à sua capacidade de comprometer o
produto final, mesmo após processamento térmico.
4. Conclusões
Nas bebidas estudadas de aspecto normal, sem sinais de deterioração

visível, 92,3% da população microbiana isolada foi de bactérias e 7,7% de fungos
filamentosos, com ausência de leveduras na amostragem realizada. Apesar da
ausência de características visuais de alterações, a presença desses micro-
organismos causa degradação da matriz alimentar, principalmente relacionadas
a formação de sabores indesejáveis.
Já nas bebidas estufadas e/ou com visível crescimento microbiano, 56,25%
da população microbiana foi de bactérias, 25,0% de fungos filamentosos e
18,75% de leveduras, e a presença destas últimas demonstra correlação direta
com o estufamento das embalagens.
A base da contaminação encontrada é proveniente de solo e água,
indicando que, provavelmente, matérias primas mal higienizadas podem ser
responsáveis pela origem das contaminações. Alguns dos micro-organismos
isolados são patógenos oportunistas, podendo causar enfermidades em
indivíduos imunocomprometidos, o que desperta atenção para a relevância do
trabalho em investigar a prevalência de micro-organismos nas bebidas não
alcoólicas.
67
Capítulo 2 - Avaliação da dissociação de aditivos conservantes

e da formação de compostos de potencial carcinogênico e
mutagênico em bebidas não alcoólicas
1. Introdução
O consumo de bebidas não alcoólicas intensificou-se ao longo dos anos,

principalmente devido às mudanças nos hábitos alimentares e à procura de uma
dieta mais saudável por parte da população (STATISTA, 2018; SILVA et al.,
2019B). Com esse aumento, preocupações inerentes à segurança de alimentos
vieram à tona, pois esses produtos são consumidos com frequência.
A presença de micro-organismos que afetam o produto e a saúde humana
precisa ser frequentemente avaliada e controlada, visto que uma gama de
contaminantes como fungos filamentosos, leveduras e bactérias podem tanto
alterar a qualidade sensorial das bebidas quanto causar doenças em
consumidores imunocomprometidos (HALL et al., 2001; KREGIEL et., 2015).
Para redução da carga microbiana, além de medidas de Boas Práticas de
Fabricação, tratamento térmico e aditivos podem ser empregados. Na indústria
de bebidas não alcoólicas, os principais grupos de aditivos utilizados são os
conservantes e os antioxidantes. Porém, ainda que em níveis considerados
seguros, tais aditivos podem reagir e formar compostos com potencial
carcinogênico (GARDNER E LAWRENCE, 1993; SILVA et al., 2019A).
Tendo em vista que na literatura já foi relatada a presença de benzeno em
bebidas não alcoólicas (FABIETTI et al., 2001; SANCHEZ et al., 2012), é
imperativo tentar compreender melhor como ocorre essa formação e do que ela
depende, de modo a tentar impedi-la ou mesmo consolidar que o uso desses
aditivos ácidos em conjunto não é viável. Este trabalho visou compreender a
influência de dois aditivos ácidos, o ácido ascórbico e o ácido benzoico, na
formação de compostos de potencial carcinogênico e seu impacto na segurança
química das bebidas não alcoólicas
68
2. Materiais e Métodos
2.1. Elaboração da solução sintética de bebidas não alcoólicas
Para avaliar a formação do benzeno e sua codependência com a

degradação de ácidos orgânicos, uma série de sistemas modelo foi elaborada e
analisada. O branco do processo consiste em uma solução de água ultrapura
adicionada de sulfato cúprico (CuSO4) e cloreto férrico (FeCl3), que simula as
concentrações máximas permitidas dos íons Cu+2 e Fe+3 (2mg/L e 0,3mg/L,
respectivamente) na água utilizada para a produção de bebidas não alcoólicas
(BRASIL, 2011), além de serem catalisadores da reação de formação de
benzeno em água. Para os ensaios cinéticos de formação de benzeno, a mesma
solução de água ultrapura com CuSO4 e FeCl3, adicionada de ácido ascórbico e
ácido benzóico (300mg/L e 500mg/L, respectivamente - BRASIL, 2007), foi
avaliada. Todas as análises foram realizadas em duplicata experimental e
analítica, por 20 semanas, nas temperaturas de 4, 25 e 40 ºC, totalizando
128 frascos de ensaios destrutivos (Figura 1).
 Branco
 Ensaio cinético à 4 ºC
Ensaio A Ensaio B
Figura 1. Esquema simplificado da amostragem realizada para avaliação de soluções sintéticas.
A temperatura de 4 ºC foi escolhida por simular a temperatura de

refrigeração comumente usada na indústria de alimentos, reduzindo a atividade
bioquímica e, consequentemente, a degradação do ácido ascórbico. Já a
temperatura de 25 ºC, por ser a temperatura ambiente sob a qual as bebidas não
alcoólicas são normalmente comercializadas. A análise à 40 ºC foi realizada para
simular condições extremas de armazenamento e comercialização, mas, ao
mesmo tempo, comum em cidades de clima quente, como o Rio de Janeiro.
69
2.2. Determinação da degradação dos ácidos orgânicos
A análise dos ácidos orgânicos foi realizada utilizando cromatógrafo

líquido de alta performance Shimadzu® com detector de índice de refração (IR)
e módulo de controle de temperatura. A metodologia consistiu em análise em
coluna de fase reversa Aminex® HPX-87H (300 x 7,8 mm), com fase móvel
composta por H2SO4 5 mM a uma vazão de 0,6 mL.min-1. O volume de injeção
foi de 20 μL e a temperatura de análise foi de 55 °C. Os padrões foram soluções
dos ácidos em água ultrapura, com concentrações variando de 0,1 a 5 gL-1. A
degradação foi determinada avaliando-se as diferenças na concentração ao
longo das 20 semanas.
2.3. Determinação da formação de benzeno
A determinação de benzeno foi realizada através de cromatografia gasosa

associada à microextração em fase sólida de headspace (HS-SPME-GC, do
inglês Headspace Solid-phase Microextraction coupled to Gas Chromatography-
Mass Spectrometry) seguindo a metodologia proposta por Sanchez e
colaboradores (2012), com modificações. O cromatógrafo usado, do modelo GC-
2010 Plus, da marca Shimadzu, foi associado a dois detectores: espectrômetro
de massas (MS, do inglês Mass Spectrometry) usado para a identificação e o
detector de ionização em chama (FID, do inglês Flame Ionization Detector),
usado para a quantificação do benzeno. A coluna empregada foi a RTX-1
(Restek®) de fase apolar.
A fibra CAR-PMDS (carboxi-polidimetilsiloxano) foi empregada para a
adsorção do benzeno da matriz e posterior dessorção no injetor do GC a 300 °C
por 5 minutos. Os padrões foram soluções com concentrações variando de 0,5
até 1000 g L-1 de benzeno em água preparados a partir de uma ampola de
benzeno em metanol (200 g mL-1). Por falta de linearidade adequada para a
ampla faixa de concentração analisada, foram construídas duas curvas
analíticas distintas, uma para valores de 0-50 g L-1 e outra para valores de 50-
1000 g L-1 de benzeno.
Um volume de 7,5 mL da solução sintética foi adicionado a 2,25 g de cloreto
de sódio (NaCl) e colocado em vials de 15 mL. Os vials foram submetidos a um
70
banho de gelo (0ºC) por 15 minutos enquanto a fibra era exposta a fase vapor
do vial, rica em benzeno (Figura 2). A formação foi determinada avaliando-se as
diferenças na concentração ao longo das 20 semanas.
Figura 2. Esquema da adsorção do benzeno na fibra CAR-PMDS (Fonte: Elaboração própria).
2.4. Avaliação da formação de subprodutos de benzeno
A determinação da presença de subprodutos de benzeno foi realizada

através de cromatografia gasosa associada a detector de espectrometria de
massas (GC-MS, do inglês Gas Chromatography Mass Spectrometry, GC-2010
Plus, Shimadzu). A temperatura de injeção foi de 300 ºC, a temperatura da
coluna (RTX-1, Restek®) inicia em 40 ºC por 1 minuto, seguindo para 100 ºC com
uma taxa de 10ºC/minuto e depois para 180 ºC com taxa de 15ºC/minuto,
mantendo por 10 minutos.
A identificação dos compostos presentes ocorreu injetando 3 µl da solução
sintética apenas nos pontos inicial, intermediário e final de estocagem para as
três temperaturas estudadas, 4, 25 e 40 ºC.
A Figura 3 apresenta os perfis de consumo dos ácidos orgânicos e

formação de benzeno em diferentes temperaturas.
71
4,0
Ácidos orgânicos (10-3 mol/L) A 12,0
Benzeno (10-6 mol/L)

3,0 10,0
8,0
2,0
6,0
4,0
1,0
2,0
0,0 0,0
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (dias)
4,0
Ácidos orgânicos (10-3 mol/L)
B 12,0

3,0 10,0
8,0
2,0
6,0
4,0
1,0
2,0
0,0 0,0
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (dias)
4,0
C
Ácidos orgânicos (10-3 mol/L)
12,0
3,5
3,0 10,0
2,5 8,0
2,0
6,0
1,5
4,0
1,0
2,0
0,5
0,0 0,0
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (dias)
Figura 3. Concentração dos ácidos ascórbico e benzóico e formação de benzeno na presença de Cu+2 e
Fe+3 à 4 ºC (A), 25 ºC (B) e 40 ºC (C). ( - ácido ascórbico,  - ácido benzóico,  - benzeno, barras
verticais - desvio padrão)
72
No que se refere à temperatura de 4°C, não foi observada modificação nas

concentrações de ácidos benzóico e ascórbico ao longo dos 120 dias de análise
(Figura 3A). Em relação ao benzeno, o método permitiu a quantificação do
composto em até três ordens de grandeza menor do que a quantidade de ácido
benzóico utilizada no ensaio, mostrando-se um método sensível na detecção de
concentrações na ordem de 10-6 mol/L.
Nota-se na Figura 3A a formação de uma pequena quantidade de benzeno
em até 14 dias, diminuindo a partir de então. A formação inicial do benzeno pode
ser justificada vista a existência do desvio padrão das medidas encontradas para
os ácidos benzóico e ascórbico. Apesar dos valores serem constantes, fica claro
que a quantidade máxima de benzeno detectada (3,31±0,78x10-6 mol/L), por ter
uma grandeza 1000 vezes inferior, é comparável ao desvio padrão da análise
dos ácidos orgânicos, que está na ordem de 10 -3. Sendo assim, apesar de o
benzeno ser formado pela degradação do ácido benzóico em presença do radical
hidroxila, não é possível fazer essa associação quantitativamente. O gráfico
mostra ainda que a partir do dia 21, a quantidade de benzeno diminuiu
gradativamente até quantidades desprezíveis. Uma explicação para esse
comportamento é a formação de compostos secundários a partir do benzeno.
Na temperatura de 25 ºC, não houve modificação na concentração de ácido
benzóico após 120 dias de estocagem e, em contrapartida, todo o ácido
ascórbico foi consumido após 21 dias (Figura 3B). Para o benzeno, o
comportamento obtido à 4 ºC se repetiu, com a formação de uma pequena
quantidade de benzeno em até 14 dias, não sendo mais observado a partir de
então.
Como demostrado na Figura 3C, para a análise realizada sob a
temperatura de 40 ºC, foi observado um consumo de 24% do ácido benzóico no
tempo total da reação (120 dias). Para o ácido ascórbico, o consumo total foi
observado em sete dias de estocagem, degradações já esperadas pelo aumento
da temperatura. Novamente, o benzeno apresentou o mesmo comportamento
das reações anteriores, porém com formação de quantidades consideravelmente
maiores.
Através da análise dos gráficos é possível observar a influência da
temperatura de estocagem na formação de benzeno. Nos ensaios à 4 ºC, o
máximo formado foi de 3,31±0,78x10-6 mol/L, à 25 ºC foi 4,75±0,75x10-6 mol/L e
73
nos ensaios à 40 ºC, 9,25±1,76x10-6 mol/L. É de suma importância ressaltar que

o máximo de benzeno permitido para água potável é de 6,40x10 -8 mol/L
(equivalente a 5 µg de benzeno/L) (BRASIL, 2011), ou seja, à 4 ºC foi formado
52 vezes mais benzeno, à 25 ºC, 74 vezes e à 40 ºC, 145 vezes que o máximo
permitido pela legislação.
Para todas as temperaturas, observa-se que a máxima formação de
benzeno é alcançada em até 14 dias de estocagem, e depois é
consideravelmente reduzida. Em ensaios de avaliação, em GC-MS, da presença
de subprodutos nos tempos inicial, intermediário e final dos ensaios, foi
observada a presença do composto secundário fenol, embasando a teoria da
formação de subprodutos.
Como descrito anteriormente, a hipótese é de que subprodutos, como fenol,
são formados a partir do benzeno. Ela é embasada pelo baixo rendimento da
reação de formação do benzeno, que está na faixa de 0,1% para todas as
temperaturas. Através das análises de espectrometria de massas confirmou-se
essa hipótese, conforme pode ser observado na Figura 4. O pico 1 destacado foi
identificado com 97% de confiabilidade como fenol em todas as análises
realizadas. Não foi possível quantificar, com confiabilidade, o composto através
da metodologia empregada.
Figura 4. Cromatograma com os tempos de retenção do fenol (1) e do ácido benzóico (2),
identificados por GC/MS, para o tempo de estocagem 20 semanas à 40ºC de solução sintética.
Os dados apresentados estão de acordo com a teoria de Gardner e

Lawrence (1993) sobre a formação de benzeno a partir da descarboxilação do
ácido benzóico na presença de ácido ascórbico e de metais de transição, e vão
ainda além, demonstrando o efeito da temperatura e a possibilidade da formação
de subprodutos. Como os ensaios foram realizados usando-se concentrações
74
de aditivos e temperaturas de transporte e estocagem usualmente empregadas

na indústria de bebidas, é de extrema preocupação e relevância a exposição
crônica a qual os consumidores estão sujeitos. É imperativo, então, encontrar
compostos alternativos para substituir o ácido benzóico como conservante em
bebidas não alcoólicas.
4. Conclusões
A partir dos ensaios de avaliação da formação de benzeno e consumo dos

ácidos orgânicos foi possível confirmar que houve formação de benzeno e de
fenol, compostos com potencial carcinogênico e mutagênico, respectivamente.
Os ensaios foram realizados com as concentrações usualmente empregadas
nas indústrias para esses aditivos, simulando ainda as temperaturas de
distribuição e estocagem, fornecendo um cenário preocupante. Essa conclusão
reforça teorias anteriores de que o benzeno pode não estar presente nas bebidas
apenas por migração do material da embalagem ou por contaminação na água
usada na preparação.
Além de demonstrar a importância do controle de temperatura na logística

dos produtos, esse trabalho evidencia que novos compostos com potencial
antimicrobiano precisam ser cada vez mais estudados de modo a propor
alternativas para o emprego do ácido benzóico.
75
Capítulo 3 - Concentração mínima inibitória de compostos com

potencial antimicrobiano frente a micro-organismos
contaminantes na indústria de bebidas
1. Introdução
A maioria das bebidas não alcoólicas possui aditivos em suas formulações,

visando à prevenção do crescimento microbiano, para aumentar a vida útil do
produto. Ao longo do tempo e com o uso indiscriminado, diversas linhagens de
micro-organismos podem ter se tornado resistentes a esses aditivos.
Como os consumidores procuram produtos menos processados e
contendo uma quantidade menor de aditivos, é um desafio atual para a indústria
de alimentos encontrar melhores alternativas. Em busca de novos aditivos com
potencial antimicrobiano, a avaliação da Concentração Mínima Inibitória (CMI)
desses compostos é uma etapa primordial para avaliar se os mesmos possuem
a ação desejada, e a partir de qual concentração devem ser empregados para
inibir o crescimento de micro-organismos alvo.
Alguns ácidos orgânicos, como sórbico e benzóico, são tradicionalmente
conhecidos pela indústria de alimentos como aditivos com potencial
antimicrobiano, mas outros compostos ácidos também podem ser avaliados em
busca de tal característica.
Os peptídeos são um grupo de moléculas dividido em subgrupos com base
na sua composição e estrutura de aminoácidos. Resíduos catiônicos como lisina
(K) e arginina (R) podem interagir com as paredes celulares dos micro-
organismos causando a morte celular (HUTCHINSON et al., 2017). A
possibilidade de usar peptídeos, em substituição ou em conjunto aos ácidos
orgânicos como conservantes em alimentos e bebidas é importante, podendo
ser um passo à frente na busca por alternativas aos compostos químicos
usualmente empregados. Este trabalho visou avaliar o potencial antimicrobiano
de seis ácidos orgânicos, dois deles, sórbico e benzóico, já amplamente
utilizados com esse apelo, e de seis peptídeos sintéticos, em busca de
alternativas ao uso de ácido benzóico pela indústria de bebidas.
76
2. Materiais e Métodos
A Concentração Mínima Inibitória foi determinada seguindo a metodologia

padrão internacional do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), que
é descrita para leveduras, fungos filamentosos e bactérias aeróbias. Os ensaios
foram realizados em placas estéreis de 96 poços de fundo plano e, após o
período de incubação de cada micro-organismo, a CMI foi determinada
visualmente pela presença de turvação e pela diferença no padrão de cores da
resazurina (Figura 1).
Figura 1. Esquema para análise de Concentração Mínima Inibitória de compostos de potencial

antimicrobiano (Adaptado de SANTOS et al., 2014).
O controle positivo, pela presença de micro-organismos viáveis,

geralmente varia da cor rosa até vermelha devido a redução da resazurina à
resofurina, enquanto o controle negativo, pela ausência de micro-organismos,
permanece azul. As análises foram feitas comparando-se os controles positivos
e negativos, visualmente e por espectrofotometria em leitor de microplacas, com
os ensaios com compostos de potencial antimicrobiano. As leituras em
espectrofotômetro foram feitas à 530nm para leveduras e fungos filamentosos e
à 625nm para as bactérias, seguindo as metodologias padrão do CLSI. Através
desse teste foi possível determinar a melhor faixa de concentração onde os
compostos propostos inibem os micro-organismos estudados (CLSI, 2006;
NCCLS, 2002).
77
2.1. Ácidos orgânicos
As soluções de ácidos orgânicos, e suas concentrações propostas, foram:

soluções dos ácidos sórbico (2,5 g.L-1), benzóico (3,0 g.L-1), cítrico (10,0 g.L-1),
ascórbico (10,0 g.L-1), gálico (10,0 g.L-1) e málico (10,0 g.L-1) previamente
dissolvidos nos caldos específicos (RPMI-MOPS, pH=7,0, para leveduras e
fungos filamentosos e Mueller Hinton, pH=7,2, para bactérias). Quando a
recomendação de concentração máxima exigida pela legislação (BRASIL, 2007)
era quantum satis, padronizou-se 10 g.L-1 como concentração inicial. Para os
ácidos sórbico e benzóico, usou-se como concentração máxima a solubilidade
do composto em água à 25°C.
As bactérias selecionadas foram a Gram-positiva Brevibacillus agri, isolada

de uma garrafa estufada de refresco misto de uva e maçã e a Gram-negativa
Komagataeibacter sp., isolada de vários copos de refresco de guaraná. Além
disso, foi selecionada a levedura Zygosaccharomyces bisporus, conhecida por
ser uma levedura resistente a conservantes, isolada de polpa de açaí e garrafas
estufadas de bebidas mistas de açaí e guaraná, e os fungos filamentosos
Penicillium glabrum e Aspergillus sydowii. P. glabrum também foram isolados de
uma garrafa estufada de refresco de uva e maçã e A. sydowii, isolado de polpa
de açaí.
2.2. Peptídeos antimicrobianos
Esta parte do trabalho foi realizada em parceria com The University of

Manchester, na Inglaterra. Os professores responsáveis foram os doutores Aline
Miller, do Manchester Institute of Biotechnology, e Gavin Humphreys, da Faculty
of Biology, Medicine and Health. Seis peptídeos geralmente reconhecidos como
seguros (GRAS) quimicamente sintetizados (FEFR, FEFEFRFK, FEFKFEFKK,
FEFRFEFK, FEFRFEFKK e FEFKFEFKGGGRGDS) (Biomatik Corporation,
Canada), todos na concentração de 5000 µg.mL-1, tiveram sua CMI testada
frente aos micro-organismos Salmonella enterica subsp. enterica sorovar
Enteritidis (ATCC 13076), Staphylococcus aureus e Candida albicans (ambos
isolados clínicos do banco de cepas da Faculty of Biology, Medicine and Health,
em Manchester). Os isolados estudados foram distintos dos empregados nas
análises dos ácidos orgânicos pois os micro-organismos enviados do Brasil para
78
a Inglaterra não puderam ser recuperados e, à época do trabalho, nem todos os

isolados haviam sido identificados.
A Tabela 1 mostra a CMI de seis diferentes ácidos orgânicos frente à

bactéria Gram positiva Brevibacillus agri, à bactéria Gram negativa
Komagataeibacter sp., à levedura Zygosaccharomyces bisporus, e aos fungos
filamentosos Penicillium glabrum e Aspergillus sydowii. Todas as análises foram
realizadas em duplicata experimental e triplicata analítica.
Dentre os resultados, o que mais chama a atenção é a incapacidade do
ácido benzóico, notadamente o conservante mais empregado na indústria de
bebidas, de inibir, nas faixas de concentrações estudadas, o crescimento de
todos os micro-organismos testados. Para esse ácido, testamos as
concentrações variando de 2,72 g.L-1 até 0,02 g.L-1 nos ensaios com bactérias e
de 1,5 g.L-1 até 0,01 g.L-1 para leveduras e fungos filamentosos. Estes valores
se devem a limitações da solubilidade do composto e do método, onde há
diluições maiores para os ensaios com as leveduras e com os fungos
filamentosos. As diluições para fungos e leveduras são maiores pois, para esses
micro-organismos, adicionam-se 100 µL de suspensão aos 100 µL de meio de
cultura com agente antimicrobiano, enquanto para as bactérias, são 10 µL de
suspensão. A legislação preconiza que a concentração máxima usada de ácido
benzóico seja de 0,5 g.L-1 (BRASIL, 2007), ou seja, mesmo com as limitações
do método, as faixas de concentração testadas para esse ácido orgânico foram
adequadas. Para as bactérias Brevibacillus agri e Komagataeibacter sp. a faixa
estudada não foi capaz de inibir o crescimento, mesmo na máxima concentração,
que é 5,4 vezes superior à máxima aplicada atualmente pela legislação vigente.
Para a levedura Zygosaccharomyces bisporus e para os fungos filamentosos
Penicillium glabrum e Aspergillus sydowii também foi observada a ineficácia do
ácido benzóico, mesmo na maior concentração testada, que nesse caso é 3,0
vezes superior ao máximo permitido pela legislação.
Já o ácido sórbico é usualmente empregado na indústria na concentração
de 0,8 g.L-1 (BRASIL, 2007). Este foi testado nas concentrações de 2,27 até 0,02
g.L-1 para os ensaios com bactérias e de 1,25 até 0,01 g.L -1 para leveduras e
fungos filamentosos.
79
Tabela 1. Concentração mínima inibitória (CMI) relativa a seis ácidos orgânicos distintos.
CMI (g L-1)
Micro-organismos Ácido benzóico Ácido sórbico Ácido cítrico Ácido málico Ácido gálico Ácido ascórbico
Bactéria Gram +
Brevibacillus agri > 2,72 1,14 2,27 2,27 4,55 4,55
Bactéria Gram -
Komagataeibacter sp. > 2,72 0,57 1,14 1,14 4,55 4,55
Levedura
Z. bisporus >1,50 >1,25 >5,00 >5,00 >5,00 >5,00
Fungos filamentosos
Penicillium glabrum >1,50 >1,25 >5,00 >5,00 >5,00 >5,00
Aspergillus sydowii >1,50 >1,25 >5,00 >5,00 >5,00 >5,00
80
Frente à bactéria B. agri, esse ácido teve ação inibitória a partir da

concentração de 1,14 g.L-1, sendo ineficiente, pelo método utilizado, na
concentração logo inferior (0,57 g.L-1). Com isso, esse ensaio não pôde concluir
sobre a inibição de B. agri na concentração intermediária de 0,8 g.L-1. Quanto à
bactéria Komagataeibacter sp., o ácido sórbico inibiu a partir da concentração
mínima de 0,57 g.L-1, demonstrando, então, que a concentração máxima
determinada pela legislação está adequada. Para a levedura
Zygosaccharomyces bisporus e para os fungos filamentosos Penicillium glabrum
e Aspergillus sydowii foi observada ineficácia do ácido sórbico em inibir o
crescimento, mesmo na máxima concentração testada, que é 1,6 vezes superior
ao máximo permitido pela legislação.
Os ácidos cítrico e málico apresentaram comportamentos semelhantes

frente aos micro-organismos estudados. Foram testados de 9,09 até 0,07 g.L-1
para os ensaios com as bactérias, e de 5,00 até 0,04 g.L -1 para leveduras e
fungos filamentosos. Frente à bactéria Gram positiva B. agri, esses ácidos
inibiram a partir da concentração de 2,27 g.L-1 e frente à bactéria Gram negativa
Komagataeibacter sp., a partir de 1,14 g.L-1, sendo então mais eficientes. Já para
a levedura Z. bisporus e para os fungos filamentosos P. glabrum e A. sydowii foi
observada ineficácia dos ácidos cítricos e málico em inibir o crescimento.
Já os ácidos gálico e ascórbico, testados nas mesmas faixas de

concentração dos ácidos cítrico e málico, tiveram desempenho inferior em
relação as bactérias, apenas inibindo-as a partir da concentração de 4,55 g.L-1.
Conforme visto para os demais ácidos, para a levedura Z. bisporus e para os
fungos filamentosos P. glabrum e A. sydowii foi observada ineficácia dos ácidos
em inibir o crescimento dentro da faixa testada.
A Tabela 2 mostra a CMI de seis diferentes peptídeos frente aos micro-

organismos S. aureus, Salmonella enterica e C. albicans, que são de grande
importância na indústria de alimentos como deterioradores e patogênicos.
A faixa de concentração de peptídeos variou de 2272,7 a 1,11 μg.mL-1 para

as bactérias e de 1250 a 0,61 μg.mL-1 para a levedura.
81
Tabela 2. Concentração mínima inibitória (CMI) relativa a seis peptídeos distintos.
CMI (µg mL-1)

Micro-organismos Peptídeo 1 Peptídeo 2 Peptídeo 3 Peptídeo 4 Peptídeo 5 Peptídeo 6
Bactéria Gram +
Staphylococcus aureus 2272,7 > 2272,7 2272,7 > 2272,7 2272,7 2272,7
Bactéria Gram -
Salmonella enterica > 2272,7 > 2272,7 > 2272,7 > 2272,7 > 2272,7 > 2272,7
Levedura
Candida albicans > 1250,0 > 1250,0 > 1250,0 39,06 > 1250,0 > 1250,0
Peptídeo 1: FEFEFRFK; Peptídeo 2: FEFR; Peptídeo 3: FEFKFEFKK, Peptídeo 4: FEFKFEFKGGGRGDS; Peptídeo 5: FEFRFEFK; Peptídeo 6:
FEFRFEFKK.
82
Para Salmonella enterica, na faixa testada, nenhum dos peptídeos

estudados foi capaz de inibir o crescimento. Para Candida albicans, o peptídeo
FEFKFEFKGGGRGDS apresentou CMI de 39,06 μg mL-1. A propriedade de
formar géis quando atingem concentrações mais elevadas tem uma aplicação
clara para uso industrial visto que, aplicada aos tanques e outras superfícies de
contato, pode evitar a formação de biofilme, reduzindo a carga microbiana final
no produto de interesse.
Unindo os conhecimentos adquiridos pelos dois experimentos, tanto dos
ácidos orgânicos quanto dos peptídeos, é possível observar que o ácido sórbico
teve melhor ação antimicrobiana frente às bactérias estudadas e, em ação
conjunta com um peptídeo antimicrobiano com potencial antifúngico, como o
FEFKFEFKGGGRGDS, poderia ser uma alternativa aos métodos usuais que
geralmente empregam somente o ácido benzóico, ou os ácidos benzóico e
sórbico combinados. Como visto no Capítulo 2, o uso do ácido benzóico precisa
ser evitado por conta das interações com ácido ascórbico formando benzeno e
outros produtos com potencial carcinogênico.
4. Conclusões
O ácido benzóico, um dos conservantes mais utilizados na indústria de

bebidas, se mostrou ineficaz para inibir todos os micro-organismos aplicados
neste estudo. Nenhum dos ácidos estudados foi capaz de inibir a levedura Z.
bisporus ou ambos os fungos filamentosos P. glabrum e A. sydowii. Nas
concentrações escolhidas, o ácido sórbico, dentre todos os ácidos estudados,
apresentou-se como a melhor opção para inibir as bactérias estudadas.
A possibilidade de usar peptídeos em conjunto com os ácidos orgânicos

como conservantes em alimentos e bebidas pode ser um caminho promissor na
diminuição do uso de conservantes ácidos.
Conclusão geral
A adição intencional de substâncias químicas sintéticas conservantes para

a industrialização de alimentos é hoje um fator crítico para a indústria. Da ampla
gama de aditivos existentes, depende uma grande variedade de alimentos e
83
bebidas disponíveis para atender à demanda da população. No caso da indústria

de bebidas não alcoólicas, os aditivos são utilizados especialmente com a
finalidade de manter as propriedades sensoriais e garantir a segurança dos
alimentos, tornando estes produtos microbiologicamente estáveis.
Com os resultados das análises microbiológicas, foi possível concluir que
a variedade da população microbiana gera um importante diagnóstico não
somente sobre as indústrias estudadas, mas também sobre indústrias de
bebidas à base de frutas em geral, visto que a base da contaminação microbiana
é oriunda do solo e da água.
A relativa simplicidade inerente à fabricação de bebidas não alcoólicas,
principalmente no caso dos refrescos, parece gerar uma sensação de que não é
preciso controle rígido de processo. Visto o crescente consumo dessas bebidas
no mercado mundial, é imperativo que as indústrias sigam as leis e instalem
medidas de controle mais eficazes, desde ferramentas como Boas Práticas de
Fabricação (BPF) até Análises de Perigos e Pontos Críticos de Controle
(APPCC).
Na intenção de ter esse controle por caminhos mais simplificados, o uso
indiscriminado de conservantes como o ácido benzóico se mostrou um
problema, pois além de ser responsável pela formação de benzeno e fenol,
mostrou-se ineficiente em inibir micro-organismos que são importantes
deterioradores na indústria de bebidas. Dito isso, é imprescindível dar passos à
frente na busca de compostos alternativos, e os peptídeos antimicrobianos
podem ter potencial.
Com isso, o presente trabalho apresentou conclusões sobre aspectos
microbiológicos, considerando os potenciais agentes deterioradores e químicos
pela evidência da formação de benzeno e fenol. Adicionalmente foi realizada
uma avaliação sobre uso de outros possíveis aditivos, a qual precisa ser
aprofundada em trabalhos futuros, para apresentar uma solução efetiva na
substituição do ácido benzóico. Este composto, que é atualmente o ácido
orgânico mais usado na indústria de bebidas, mostrou-se ineficiente como
agente antimicrobiano e com potencial de afetar negativamente a saúde dos
consumidores. Um caminho promissor pode ser o uso do ácido sórbico, que
apresentou bons resultados nesse trabalho, em combinação com peptídeos de
potencial antimicrobiano, visando reduzir o uso de conservantes ácidos.
84
Sugestões para trabalhos futuros
A partir das linhas de estudo desenvolvidas nessa tese, diversos outros

trabalhos seriam interessantes para agregar ainda mais ao tema. É possível
realizar cinéticas do conservante ácido benzóico juntamente com outros
antioxidantes para comparar como eles afetam a formação de benzeno. Uma
sugestão é usar o ácido gálico, que também tem propriedades antioxidantes.
Outra tema interessante, seguindo a tendência de consumo atual, é

explorar ainda mais novos compostos naturais com potenciais antimicrobiano e
antioxidante que possam ser incorporados às bebidas e a outros alimentos.
Destaco também a importância da Universidade cada vez mais trabalhar

em parceria com as indústrias, mapeando as demandas. Nesse sentido,
trabalhos ainda mais detalhados em relação a microbiologia de alimentos podem
agregar muito ao atual conhecimento na área.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Laboratório de Investigação em Microbiologia

Médica (LIMM) da UFRJ pelas análises no MALDI-TOF, à professora Marina
Venturini Copetti da UFSM pela identificação dos fungos filamentosos, e ao
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo
apoio financeiro.
85
Referências
ABDEL-AAL, H. M.; ABDEL-SATER, M. A.; SOLIMAN, Z. Biodiversity of

filamentous and yeast fungi in citrus and grape fruits and juices in Assiut area,
Egypt. The Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences, v.
7, n. 4, p. 353, 2018.
ABIR. Associação Brasileira das Indústrias de Refrigerantes e de Bebidas

não Alcoólicas: Dados do setor no Brasil. [2018]. Disponível em:
https://abir.org.br/o-setor/ dados/ Acesso em: 22 abril 2020.
ABRIOUEL, H.; LUCAS, R.; OMAR, N. B.; VALDIVIA, E.; GÁLVEZ, A. Potential
applications of the cyclic peptide enterocin AS-48 in the preservation of vegetable
foods and beverages. Probiotics and Antimicrobial Proteins, 2, 77–89, 2010.
AL-HUQAIL, A. A.; BEHIRY, S. I.; SALEM, M. Z. M.; ALI, H. M.; SIDDIQUI, M.

H.; SALEM, A. Z. M. Antifungal, antibacterial, and antioxidant activities of Acacia
saligna (Labill.) H. L. Wendl. Flower extract: HPLC analysis of phenolic and
flavonoid compounds. Molecules, 24, 1-4, 2019.
ALI, B., AL-WABEL, N. A., SHAMS, S., AHAMAD, A., KHAN, S. A., ANWAR, F.
Essential oils used in aromatherapy: A systemic review. Asian Pacific Journal of
Tropical Biomedicine, 5, 601–611, 2015.
AMIT, S. K., UDDIN, M. M., RAHMAN, R., ISLAM, S. R., KHAN, M. S. A review
on mechanisms and commercial aspects of food preservation and
processing. Agriculture & Food Security, 6(1), 51, 2017.
ARNESEN, L. P. S., FAGERLUND, A., & GRANUM, P. E. From soil to gut:

Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS microbiology reviews,
32(4), 579-606, 2008.
BARTH, M., HANKINSON, T. R., ZHUANG, H., BREIDT, F. Microbiological

spoilage of fruits and vegetables. Compendium of the microbiological
spoilage of foods and beverages. Springer, New York, NY. 135-183, 2009.
BATTEY, A.S., DUFFY, S., SCHAFFNER, D.W. Modelling yeast spoilage in cold-
filled ready-to-drink beverages with Saccharomyces cerevisiae,
Zygosaccharomyces bailii, and Candida lipolytica. Applied and Environmental
Microbiology, 68, 1901–1906, 2002.
86
BENKERROUM, N. Antimicrobial peptides generated from milk proteins: A

survey and prospects for application in the food industry. A review. International
Journal of Dairy Technology, 63, 320-338, 2010.
BERNDT, T; BÖGE, O. Formation of phenol and carbonyls from the atmospheric

reaction of OH radicals with benzene. Physical Chemistry Chemical Physics,
v. 8, n. 10, p. 1205-1214, 2006.
BEUCHAT, L. R.; PITT, J. I. Detection and enumeration of heat-resistant molds.

Compendium of methods for the microbiological examination of foods, 3,
251-263, 2015.
BEUCHAT, L. R.; RICE, STEPHEN L. Byssochlamys spp. and their importance

in processed fruits. In: Advances in Food Research. Academic Press, p. 237-
288, 1979.
BINTSIS, T. Lactic acid bacteria: their applications in foods. Journal of

Bacteriology & Mycology, v. 6, n. 2, p. 89-94, 2018.
BLANCO-MORALES, V.; LÓPEZ-GARCÍA, G.; CILLA, A.; GARCIA-LLATAS, G.;

BARBERÁ, R.; LAGARDA, M. J.; SÁNCHEZ-SILES, L. M.; ALEGRÍA; A. The
impact of galactooligosaccharides on the bioaccessibility of sterols in a plant
sterol-enriched beverage: adaptation of the harmonized INFOGEST digestion
method. Food and Function, 9, 2080–2089, 2018.
BOHRZ, D. D. A. S., WEBBER, B., VANCIN, F. R., DAROIT, L., PILOTTO, F.,
SANTOS, L. R. D., & RODRIGUES, L. B. Quantificação de Staphylococcus
aureus e bactérias mesófilas aeróbias para avaliar higienização de
equipamentos de ordenha. Acta Scientiae Veterinariae, Pub-1696, 2019.
BRANEN, A. L.; HAGGERTY, R. J. Introduction to food additives. In: Food

additives, Marcel Dekker, Inc. p. 1-10, 2001.
BRASIL, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução da Diretoria

Colegiada – RDC nº 5, de 15 de janeiro de 2007. Atribuição de Aditivos e seus
Limites Máximos para a Categoria de Alimentos 16.2: Bebidas Não Alcoólicas,
Subcategoria 16.2.2: Bebidas Não Alcoólicas Gaseificadas e Não Gaseificadas.
Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 17 jan. 2007.
87
_______, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução da Diretoria

Colegiada - RDC Nº 18, de 27 de abril de 2010. Dispõe sobre alimentos para
atletas. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 28
abril 2010.
_______, Ministério da Agricultura, Pecuária Abastecimento. Decreto nº 6.871,

de 4 de junho de 2009. Regulamenta a Lei no 8.918, de 14 de julho de 1994, que
dispõe sobre a padronização, a classificação, o registro, a inspeção, a produção
e a fiscalização de bebidas. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil,
Brasília, DF, 4 jun. 2009.
_______, Ministério da Saúde. Portaria MS nº 2914 de 12 de dezembro de 2011.

Dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água
para consumo humano e seu padrão de potabilidade. Diário Oficial [da]
República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 14 dez. 2011.
CAROCHO, M., BARREIRO, M. F., MORALES, P., & FERREIRA, I. C. Adding

molecules to food, pros and cons: A review on synthetic and natural food
additives. Comprehensive reviews in food science and food safety, 13(4),
377-399, 2014.
CERNA-CORTES, J. F., ESTRADA-GARCÍA, T., & GONZALEZ-Y-MERCHAND,

J. A. Isolation of Mycobacterium mucogenicum from street-vended chili sauces:
a potential source of human infection. Journal of food protection, 72(1), 182-
184, 2009.
CHAUDHRY, V., BAINDARA, P., PAL, V. K., CHAWLA, N., PATIL, P. B., &
KORPOLE, S. Methylobacterium indicum sp. nov., a facultative methylotrophic
bacterium isolated from rice seed. Systematic and applied
microbiology, 39(1), 25-32, 2016.
CHAN, K. W.; IQBAL; S. KHONG, N. M. H. OOI, D. J. MAZNAH ISMAIL, M.

Antioxidant activity of phenolics - saponins rich fraction prepared from defatted
kenaf seed meal. LWT - Food Science and Technology, 56, 181-186, 2014.
CHHIKARA, N.; DEVI, H. R.; JAGLAN, S.; SHARMA, P.; GUPTA, P.; PANGHAL,
A. Bioactive compounds, food applications and health benefits of Parkiaspeciosa
(stinky beans): a review. Agriculture & Food Security, 7, 1-9, 2018.
88
CHOI, J. H.; KIM, J. Y.; JEONG, E. T.; CHOI, T. H.; YOON, T. M. Preservative
effect of Camellia sinensis (L.) Kuntze seed extract in soy sauce and its
mutagenicity. Food Research International, 105, 982-988, 2018.
CLSI. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria

That Grow Aerobically; Approved Standard—Seventh Edition. CLSI document
M7-A7 [ISBN 1-56238-587-9]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940
West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2006.
CODE OF FEDERAL REGULATIONS (CFR). Title 21. Food and Drugs, Part 170,
Office of Federal Regulations, National Archives Records Services, General
Service Administration, Washington, D.C, 2018.
CODEX FOOD CHEMICALS, 4th ed. Food and Nutrition FCC IV/ Monograph
Specification for caramel colour. National Academy Press, Washington, DC,
1996. Disponível em: http://www.cqyulong.com.cn/fcc4.htm. Acesso em: 27 mar.
2019.
COELHO, M. I. S., MENDES, E. S., CRUZ, M. C. S., BEZERRA, S. S., &

PINHEIRO, R. P. Avaliação da qualidade microbiológica de águas minerais
consumidas na região metropolitana de Recife, Estado de Pernambuco. Acta
Scientiarum. Health Sciences, 32(1), 1-8, 2010.
CROXATTO, A., G.; PROD’HOM, G.; GREUB, G. Applications of MALDI-TOF

mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology
Review, v. 36(2): p. 380-407, 2012.
DANIEL, J. W. Metabolic aspects of antioxidants and preservatives.

Xenobiotica,16, 1073-8, 1986.
DEAK, T. Handbook of food spoilage yeasts. CRC press, 2007.
DEL OLMO, A., CALZADA, J., & NUÑEZ, M. The blue discoloration of fresh
cheeses: A worldwide defect associated to specific contamination by
Pseudomonas fluorescens. Food Control, 86, 359-366, 2018.
DEMYTTENAERE, J. C. R. The new European Union Flavouring Regulation and

its impact on essential oils: Production of natural flavouring ingredients and
maximum levels of restricted substances. Flavour and Fragrance Journal, 27,
3–12, 2012.
89
DOELL, D. L.; FOLMER, D. E.; LEE, H. S.; BUTTS, K. M.; CARBERRY, S. E.

Exposure estimate for FD&C colour additives for the US population. Food
Additives and Contaminants - Part A, 33, 782–797., 2016.
DONSÌ, F., FERRARI, G. Essential oil nanoemulsions as antimicrobial agents in

food. Journal of Biotechnology, 233, 106–120, 2016.
DOORES, S. Organic acids. In: Antimicrobials in Foods, 2nd ed. DAVIDSON,

P. M., BRANEN, A. L. (Eds.). Marcel Dekker, New York, 95, 1993.
DOSTI, B., GUZEL‐SEYDIM, Z. E. Y. N. E. P. GREENE, A. K. Effectiveness of

ozone, heat and chlorine for destroying common food spoilage bacteria in
synthetic media and biofilms. International journal of dairy technology. v. 58,
n. 1, 19-24, 2005.
EL-MAATI, M. F. A.; MAHGOUB, S. A.; LABIB, S. M.; AL-GABY, A. M. A.;

RAMADAN, M. F. Phenolic extracts of clove (Syzygiumaromaticum) with novel
antioxidant and antibacterial activities. European Journal of Integrative
Medicine, 8, 494–504, 2016.
ENTIS, P., FUNG, D.Y.C., GRIFFITHS, M., MCINTYRE, L., RUSSELL, S.,
SHARPE, A., & TORTORELLO, M.L. Rapid methods for detection, identification,
and enumeration. In Downes, F. P., & Ito, K. (eds.) Compendium of methods
for the microbiological examination of foods (4th ed., pp. 89–126).
Washington, DC: Am. Public Health Assoc, 2015.
FABIETTI, F.; DELISE, M.; BOCCA, A. P. Investigation into the benzene and
toluene content of soft drink. Food Control, v. 12, n. 8, p. 505–509, 2001.
FAIZAL, A.; GEELEN, D. Saponins and their role in biological processes in plants.
Phytochemistry Reviews, 12, 877-893, 2013.
FALLICO, B., ARENA, E., CHIAPPARA, E., BALLISTRERI, G. Colour and label
evaluation of commercial pasteurised red juices and related drinks. Food
Additives and Contaminants: Part B, 3, 201–211., 2010.
FAUSTINO, M., VEIGA, M., SOUSA, P., COSTA, E., SILVA, S., PINTADO, M.
Agro-Food Byproducts as a New Source of Natural Food Additives. Molecules,
24, 1056, 2019.
90
FILTENBORG, O., FRISVAD, J. C., & THRANE, U. Moulds in food spoilage.

International journal of food microbiology, 33(1), 85-102, 1996.
FISPQ. Ficha de informações de segurança de produtos químicos. Material de

referência certificado de BTEX, 2012. Disponível em:
http://www.inmetro.gov.br/metcientifica/mrc/fispq-8298.pdf. Acesso em: 15 jan.
2018.
FISPQ. Ficha de dados de segurança de acordo com a Regulamento (CE)

Nº. 1907/2006 - Fenol, 2011. Disponível
em: http://sites.ffclrp.usp.br/cipa/fispq/Fenol.pdf. Acesso em: 24 abril 2020.
FURNERI, P.M., PAOLINO, D., SAIJA, A., MARINO, A., BISIGNANO, G. In vitro
antimycoplasmal activity of Melaleuca alternifolia essential oil. Journal of
Antimicrobial Chemotherapy, 58, 706–707, 2006.
GARDNER, L. K.; LAWRENCE, G. D. Benzene production from decarboxylation

of benzoic acid in the presence of ascorbic acid and a transition-metal
catalyst. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 41, n. 5, p. 693-695,
1993.
GEE, M. L.; BURTON, M.; GREVIS-JAMES, A.; HOSSAIN, M. A.; MCARTHUR,

S.; PALOMBO, E. A.; WADE, J. D.; CLAYTON, A. H. Imaging the action of
antimicrobial peptides on living bacterial cells. Scientific reports, v. 3, 2013.
GERMAN, J. B. Antioxidants. In: Food additives. 2nd edition, New York: Marcel
Dekker, Inc., 523-542, 2001.
GIOWANELLA M; DALZOTO P.R.; PIMENTEL I.C.; ZAWADNEAK M.A.C.

Monitoramento microbiológico visando o alimento seguro. Horticultura
Brasileira 28: S227-S234, 2010.
GOMES, R. J.; BORGES, M. S; ROSA, M. F.; CASTRO-GÓMEZ, R. J .H.

SPINOSA, W. A. Acetic acid bacteria in the food industry: Systematics,
characteristics and applications. Food technology and biotechnology, v. 56, n.
2, p. 139-151, 2018.
GUNDEWADI, G.; SARKAR, D. J.; RUDRA, S. G.; SINGH, D. Preparation of basil

oil nanoemulsion using Sapindusmukorossi pericarp extract: Physico-chemical
91
properties and antifungal activity against food spoilage pathogens. Industrial

Crops & Products, 125, 95-104, 2018.
HALASZ, A. Lactic acid bacteria. In: Food Quality and Standards, Volume 3,
pp. 70–82. Lásztity, R., Ed., EOLSS Publishers Company Limited, Oxford, UK,
2009.
HALL, P. A.; LEDENBACH, L.; FLOWERS, R. S. Acid-Producing

Microorganisms. Compendium of Methods for the Microbiological
Examination of Foods. 4ª ed. Washington, D. C. Cap. 19, 201-215, 2015.
HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J. M. C. The Importance of Free Radicals and

Catalytic Metal Ions in Human Disease. Molecular Aspects of Medicine, v. 8,
n. 2, p. 89-193, 1985.
HAMDANI, A. M.; WANI, I. A. Guar and Locust bean gum: Composition, total
phenolic content, antioxidant and antinutritional characterization. Bioactive
Carbohydrates and Dietary Fibre, 2018 (in press).
HAMMER, K. A. Treatment of acne with tea tree oil (melaleuca) products: a

review of efficacy, tolerability and potential modes of action. International
Journal of Antimicrobial Agents, 45, 106–110, 2015.
HAMMER, K. A.; CARSON, C. F.; RILEY, T. V. Antifungal effects of Melaleuca

alternifolia (tea tree) oil and its components on Candida albicans, Candida
glabrata and Saccharomyces cerevisiae. Journal of Antimicrobial
Chemotherapy, 53, 1081–1085, 2004.
HUTCHINSON, J. A.; BURHOLT, S.; HAMLEY, I. W. Peptide hormones and

lipopeptides: from self‐assembly to therapeutic applications. Journal of Peptide
Science, v. 23, n. 2, p. 82-94, 2017.
IOANNOU, I.; GHOUL, M. Prevention of enzymatic browning in fruit and

vegetables. European Scientific Journal, v. 9, n. 30, 2013.
IYENGAR, R.; MCEVILY, A. J. Anti-browning agents: alternatives to the use of

sulfites in foods. Trends in Food Science & Technology, v. 3, 60-64, 1992.
JIANG, L., JEONG, J. C., LEE, J. S., PARK, J. M., YANG, J. W., LEE, M. H., ...
& LEE, J. Potential of Pantoea dispersa as an effective biocontrol agent for black
rot in sweet potato. Scientific reports, 9(1), 1-13, 2019.
92
Joint FAO/WHO Codex Alimentarius Commission. General Standard for Food

Additives. Rome: World Health Organization: Food and Agriculture Organization
of the United Nations, 2016.
Joint FAO/WHO Codex Alimentarius Commission. Codex General Standard for

Fruit Juices and Nectars. Rome: World Health Organization: Food and
Agriculture Organization of the United Nations, 2005.
KAKITANI, A., INOUE, T., MATSUMOTO, K., WATANABE, J., NAGATOMI, Y.,
& MOCHIZUKI, N. Simultaneous determination of water-soluble vitamins in
beverages and dietary supplements by LC-MS/MS. Food Additives and
Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure and Risk
Assessment, 31, 1939–1948, 2014.
KAMUF, W.; NIXON, A.; PARKER, O.; BARNUM, G. C.; WILLAMSON, D. D.

Overview of caramel colours. Williamson. American Association of cereal
chemists, 48, 65–69, 2003.
KIELING, D. D., PRUDENCIO, S. H. Blends of lemongrass derivatives and lime

for the preparation of mixed beverages: antioxidant, physicochemical, and
sensory properties. Journal of the Science of Food and Agriculture, 99, 1302–
1310, 2019.
KIM, Y. K., MOON, J. S., SONG, K. E., & LEE, W. K. Two cases of bacteremia
due to Roseomonas mucosa. Annals of laboratory medicine, 36(4), 367-370,
2016.
KNISPEL, R., KOCH, R., SIESE, M., & ZETZSCH, C. Adduct formation of OH
radicals with benzene, toluene, and phenol and consecutive reactions of the
adducts with NOx and O2. Berichte der Bunsengesellschaft für physikalische
Chemie, 94(11), 1375-1379, 1990.
KREGIEL, D. Review Article: Health Safety of Soft Drinks: Contents, Containers,

and microorganisms. BioMed Research International, Article ID 128697, 2015,
2015.
KREGIEL, D., RYGALA, A., LIBUDZISZ, Z., WALCZAK, P., OLTUSZAK-

WALCZAK, E. Asaia lannensis–the spoilage acetic acid bacteria isolated from
93
strawberry-flavored bottled water in Poland. Food Control,v. 26, n. 1, 147-150,

2012.
LAVERTY, G.; GORMAN, S. P.; GILMORE, B. F. The Potential of antimicrobial

peptides as biocides. International Journal of Molecular Sciences, 12, 6566-
6596, 2011.
LAWLOR, K., SCHUMAN, J., SIMPSON, P., & TAORMINA, J. Microbiological

spoilage of beverages In: Sperber, WH, Doyle, MP (Eds.). Compendium of the
microbiological spoilage of foods and beverages, 2009.
LE LOIR, Y., BARON, F., & GAUTIER, M. Staphylococcus aureus and food
poisoning. Genetics and Molecular Research, 2(1), 63-76, 2003.
LEISTNER, L; GORRIS, L. G. M. Food preservation by hurdle

technology. Trends in Food Science & Technology, v. 6, n. 2, p. 41-46, 1995.
LI, J., LIU, H., WANG, C., YANG, J., & HAN, G. Stable isotope labelling-assisted
GC/MS/MS method for determination of methyl eugenol in food samples. Journal
of the Science of Food and Agriculture, 98, 3485–3491, 2018.
LIDE, D.R., MILNE, G.W.A. (eds.). Handbook of Data on Organic Compounds.

Volume I. 3rd ed. CRC Press, Inc. Boca Raton, FL. 1994.
LIN, G., CHEN, H., ZHOU, H., ZHOU, X., & XU, H. Preparation of tea tree
oil/poly(styrene-butyl methacrylate) microspheres with sustained release and
anti-bacterial properties. Materials, 11, 1-12, 2018.
LOUREIRO, V., & QUEROL, A. The prevalence and control of spoilage yeasts in
foods and beverages. Trends in Food Science & Technology. V. 10, n. 11,
356-365, 1999.
LOUREIRO, V., & MALFEITO-FERREIRA, M. Spoilage yeasts in the wine

industry. International journal of food microbiology. V.86, n. 1-2, 23-50, 2003.
MAINAR, M. S., XHAFERI, R., SAMAPUNDO, S., DEVLIEGHERE, F., & LEROY,
F. Opportunities and limitations for the production of safe fermented meats
without nitrate and nitrite using an antibacterial Staphylococcus sciuri starter
culture. Food Control, 69, 267-274, 2016.
94
MAKOVITZKI, A.; BARAM, J.; SHAI, Y. Antimicrobial lipopolypeptides composed

of palmitoyl di-and tricationic peptides: in vitro and in vivo activities, self-assembly
to nanostructures, and a plausible mode of action. Biochemistry, v. 47, n. 40, p.
10630-10636, 2008.
MAN, S., GAO, W., ZHANG, Y., HUANG, L., & LIU, C. Chemical study and
medical application of saponins as anti-cancer agents. Fitoterapia, 81, 703-714,
2010.
MASLOVA, E.; STROM, M.; OLSEN, S.F.; HALLDORSSON T.I. Consumption of

artificially-sweetened soft drinks in pregnancy and risk of child asthma and
allergic rhinitis. PLoS ONE, 8, 5726, 2013.
MAQSOOD, S., BENJAKUL, S., & SHAHIDI, F. Emerging role of phenolic

compounds as natural food additives in fish and fish products. Critical Reviews
in Food Science and Nutrition, 53, 162–179, 2013.
MARONE, P. A., BIRKENBACH, V. L., HAYES, A. W. Newer approaches to

identify potential untoward effects in functional foods. International Journal of
Toxicology, 35, 186–207, 2016.
MATTA, Z.; CHAMBERS, E.; GARCIA, J. M.; HELVERSON, J. M. Sensory

characteristics of beverages prepared with commercial thickeners used for
dysphagia diets. Journal of the American Dietetic Association, 106, 1049-
1054, 2006.
McCANN, D.; BARRETT, A.; COOPER, A.; CRUMPLER, D.; DALEN, L.;
GRIMSHAW, K.; KITCHIN, E.; LOK, K.; PORTEOUS, L.; PRINCE, E.; SONUGA-
BARKE, E.; WARNER, J. O.; STEVENSON, J. Food additives and hyperactive
behaviour in 3-year-old and 8/9-year-old children in the community: a
randomised, double-blinded, placebo-controlled trial. Lancet, 370, 1560–1567,
2007.
MEPHAM, B. Food additives: an ethical evaluation. British Medical Bulletin, 99,

7–23, 2011.
MOHDALY, A.A.A., SARHAN, M.A., SMETANSKA, I., MAHMOUD, A.

Antioxidant properties of various solvent extracts of potato peel, sugar beet pulp
95
and sesame cake. Journal of the Science of Food and Agriculture, 90, 218–
226, 2010.
MOORE, J. E., XU, J., HEANEY, N., & MILLAR, B. C. Spoilage of fruit-flavoured
bottled water by Gluconacetobacter sacchari. Food microbiology. V. 19, n. 4,
399-401, 2002.
MORTON, P. A. J.; MURRAY B. S. Acid beverage floc: protein–saponin

interactions and an unstable emulsion model. Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces, 21, 101–106, 2001.
NCCLS. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility

Testing of Yeasts; Approved Standard—Second Edition. NCCLS document
M27-A2 [ISBN 1-56238-469-4]. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400,
Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2002.
NETO, A. C. R.; NAVARRO, B. B.; CANTON, L.; MARASCHIN, M.; DI PIERO,

R. M. Antifungal activity of palmarosa (Cymbopogon martinii), tea tree (Melaleuca
alternifolia) and star anise (Illicium verum) essential oils against Penicillium
expansum and their mechanisms of action. LWT - Food Science and
Technology, 105, 385–392, 2019.
NIELSEN, S. D.; BEVERLY, R. L.; QU, Y.; DALLAS, D. C. Milk bioactive peptide
database: A comprehensive database of milk protein-derived bioactive peptides
and novel visualization. Food Chemistry, 232, 673–682, 2017.
OBASI B. C.; WHONG C. M. Z.; AMEH J. B.; ELLA E. E., 2019. Microbiological
Quality Assessment of Commercially and Laboratory Prepared Orange Juice.
Journal of Biotechnology Research, Academic Research Publishing Group,
vol. 5(2), pages 19-27, 02-2019.
PANDA, A. K., BISHT, S. S., DEMONDAL, S., KUMAR, N. S.,

GURUSUBRAMANIAN, G., & PANIGRAHI, A. K. Brevibacillus as a biological
tool: a short review. Antonie Van Leeuwenhoek, 105(4), 623-639, 2014.
PEANPARKDEE, M. IWAMOTO, S. Bioactive compounds from by-products of

rice cultivation and rice processing: extraction and application in the food and
pharmaceutical industries. Trends in Food Science & Technology, 86, 109-
117, 2019.
96
PEERAJAN, S.; CHAIYASUT, C.; SIRILUN2, S.; CHAIYASUT, K.; KESIKA, P.;
SIVAMARUTHI, B. Enrichment of nutritional value of Phyllanthus emblica fruit
juice using the probiotic bacterium, Lactobacillus paracasei HII01 mediated
fermentation. Food Science and Technology, 36, 116-123, 2016.
PERSISTENCE MARKET RESEARCH. Global market study on non-alcoholic

beverages: North America to Register a High-Value CAGR During the Forecast
Period 2017 – 2027. Disponível em:
https://www.persistencemarketresearch.com/market-research/non-alcoholic-
beverages-market.asp. Acesso em: 26 mar. 2019.
PETTIPHER, G. L.; OSMUNDSON, M. E.; MURPHY, J. M. Methods for the

detection and enumeration of Alicyclobacillus acidoterrestris and investigation of
growth and production of taint in fruit juice and fruit juice-containing drinks.
Letters in Applied Microbiology, v 24, 185-189, 1997.
PITT, J. I.; HOCKING, A. D. Fungi and Food Spoilage. 3ª ed. New York:
Springer Science and Bussiness Media, 2009.
PONCE, A. R.; BASTIANI, M. I. D.; MINIM, V. P.; VANETTI, M. C. D.

Características físico-químicas e microbiológicas de morango minimamente
processado. Ciênc. Tecnol. Aliment. [online]. 2010, vol.30, n.1, pp.113-118.
Epub Mar 12, 2010.
POWERS, J.P.; HANCOCK, R.E. The relationship between peptide structure and
antibacterial activity. Peptides, 24, 1681–1691, 2003.
PRESSMAN, P., CLEMENS, R., HAYES, W., & REDDY, C. Food additive safety:
A review of toxicologic and regulatory issues. Toxicology Research and
application, 1, 2397847317723572, 2017.
RAI, M.; PANDIT. R.; GAIKWAD, S.; KÖVICS, G. Antimicrobial peptides as

natural bio-preservative to enhance the shelf-life of food. Journal of Food
Science and Technology, 53, 3381-3394, 2016.
RAMOS, H. C., HOFFMANN, T., MARINO, M., NEDJARI, H., PRESECAN-

SIEDEL, E., DREESEN, O., ... & JAHN, D. Fermentative metabolism of Bacillus
subtilis: physiology and regulation of gene expression. Journal of Bacteriology,
182(11), 3072-3080, 2000.
97
RAWAT, S. Food Spoilage: Microorganisms and their prevention. Asian Journal

of Plant Science and Research, 5(4), 47-56, 2015.
ROETHENBAUGH, G. Trends in beverage markets. In: Chemistry and

technology of soft drinks and fruit juices. 2nd edition, Blackwell Publishing
Ltd, 15-34, 2005.
ROTHWELL, J. A., MADRID-GAMBIN, F., GARCIA-ALOY, M., ANDRES-

LACUEVA, C., LOGUE, C., GALLAGHER, A. M., ... & DRAGSTED, L. O.
Biomarkers of intake for coffee, tea, and sweetened beverages. Genes &
nutrition, 13(1), 15, 2018.
REDDY, A. C., LOKESH B.R. Studies on spice principles as antioxidants in the

inhibition of lipid peroxidation of rat liver microsomes. Molecular and Cellular
Biochemistry,111, 117-24, 1992.
RUSSEL, J. B. Química Geral. 2ª ed. Makron Books: São Paulo, 1994.
RUSSEL, N. J.; GOULD, G. W. Food preservatives. 2ª ed. New York: Kluwer

Academic, 2003.
SANCHEZ, A. B.; BUDZIAK, D.; MARTENDAL, E.; CARASEK, E. Determination

of benzene in beverages by solid-phase microextration and gas chromatography.
Scientia Chromatographica, 4, 209-216, 2012.
Santos, A. G., Ribeiro, B. D., Alviano, D. S., & Coelho, M. A. Z. Toxicity of ionic
liquids toward microorganisms interesting to the food industry. Rsc
Advances, 4(70), 37157-37163, 2014.
SANTOS, V. P. S., SALGADO, A. M., TORRES, A. G., PEREIRA, K. S. Benzene

as a Chemical Hazard in Processed Foods, International Journal of Food
Science, Article ID 545640, v. 2015, 2015.
SANTOS, J.C.P.; SOUSA, R.C.S.; OTONI, C.G.; MORAES, A.R.F.; SOUZA,

V.G.L.; MEDEIROS, E.A.A.; ESPITIA, P.J.P.; PIRES, A.C.S.; COIMBRA, J.S.R.;
SOARES, N.F.F. Nisin and other antimicrobial peptides: Production, mechanisms
of action, and application in active food packaging. Innovative Food Science
and Emerging Technologies, 48, 179-194, 2018A.
SANTOS, J. L. P.D.; SAMAPUNDO, S.; BIYIKLI, A.; IMPE, J.V.; AKKERMANS,

S.; HÖFTE, M.; ABATIH, E. N.; SANT'ANA, A. S.; DEVLIEGHERE, F.
98
Occurrence, distribution and contamination levels of heat-resistant moulds

throughout the processing of pasteurized high-acid fruit products. International
Journal of Food Microbiology 281, p. 72–81. 2018B.
SCOTTER M. J. Methods for the determination of European Union-permitted

added natural colours in foods: a review. Food Additives and Contaminants,
28, 527-596, 2011.
SENGAR, G.; SHARMA, H. K. Food caramels: a review. Journal of Food

Science and Technology, 51, 1686–1696, 2014.
SEOW, Y.X., YEO, C.R., CHUNG, H.L., YUK, H.-G. Plant essential oils as active
antimicrobial agents. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 54, 625–
644, 2014.
SHAHIDI, F. AND NACZK, M. Phenolics in Food and Nutraceuticals, pp. 576.

CRC Press, Boca Raton, FL, 2004.
SHARMA, A., & SHARMA, S. C. Salinity induced apoptosis in food spoilage yeast
Zygosaccharomyces bisporus. African Journal of Clinical and Experimental
Microbiology, 21(2), 149-155, 2020.
SICIŃSKA, E.; JERUSZKA-BIELAK, M.; MASALSKA, K.; WRONOWSKI, S. A

survey of foodstuffs fortified with vitamins available on the market in Warsaw.
RocznikiPanstwowegoZakladuHigieny, 64, 293-298, 2013.
SILVA, M. M., e LIDON, F. Food preservatives–An overview on applications and

side effects. Emirates Journal of Food and Agriculture, 366-373, 2016.
SILVA, M.M.N., SILVA, R.S., CRUZ, T.A., PINHO, M.B, PEREIRA, K.S.,
COELHO, M.A.Z. Spoilage Growth and Benzene Evaluation of Non-carbonated
Soft Drinks. Chemical Engineering Transactions. V. 75, 97-102, 2019A.
SILVA, M.M.N., ALBUQUERQUE, T.L., PEREIRA, K.S., COELHO, M.A.Z. Food

additives used in non-alcoholic water-based beverages– a review. J Nutr Health
Food Eng. 9(3):109‒121, 2019B.
SIMPSON, P.; TAORMINA, P. Bebidas não alcoólicas. Micro-organismos em

Alimentos 8: utilização de dados para avaliação do controle de processo e
aceitação do produto. 1ª ed. São Paulo: Blucher, cap. 20, 375-390, 2015.
99
SINGH, S.; SINGH, G.; ARYA, S. K. An overview of properties and application in

food products. International Journal of Biological Macromolecules, 119, 79-
95, 2018.
SONG, P.; WU, L.; GUAN, W. Dietary nitrates, nitrites, and nitrosamines intake
and the risk of gastric cancer: a meta-analysis. Nutrients, 7, 9872-9895, 2015.
SOUSA, T. M. G.; GOMES, L. M. D.; CARVALHO, J. T. F., BARBOSA, F. R., &

PEREIRA, D. E. Gênero Staphylococcus spp.: Presença e Transmissão Via
Manipuladores de Alimentos. International Journal of Nutrology, 11, 2018.
SPERBER, W. H. Introduction to the microbiological spoilage of foods and

beverages. Compendium of the Microbiological Spoilage of Foods and
Beverages. Food Microbiology and Food Safety. Springer, New York, NY,
USA. 1–39, 2009.
STATISTA, The Statistics Portal (2018). Disponível em: https://www.statista.com/

Acesso em 12 nov. 2018.
STEIN, M., TRAN, V., NICHOL, K. A., LAGACÉ‐WIENS, P., PIERONI, P., ADAM,
H. J., ... & PIARROUX, R. Evaluation of three MALDI‐TOF mass spectrometry
libraries for the identification of filamentous fungi in three clinical microbiology
laboratories in Manitoba, Canada. Mycoses, 61(10), 743-753, 2018.
STEINBACH, A.; GUTHRIE, B.; SMITH, S.; LINDGREN, T.; DEBON, S. Normal
force-controlled tribological measurement of soft drinks and lubrication additives.
Journal of Food Measurement and Characterization, 8, 142-148, 2014.
STEVENS, L. J.; BURGESS, J. R., STOCHELSKI, M. A., & KUCZEK, T. Amounts

of artificial food colours in commonly consumed beverages and potential
behavioural implications for consumption in children. Clinical Pediatrics, 53,
133–140, 2014.
SULLIVAN, C.; SAYRE. S. S.; LEON, J. B.; MACHEKANO, R.; LOVE, T. E.;
PORTER, D.; MARBURY, M.; SEHGAL, A. R. Effect of food additives on
hyperphosphatemia among patients with end-stage renal disease: a randomized
controlled trial. American Medical Association, 301, 629-635, 2009.
TAYLOR, B. Other beverage ingredients. In: Chemistry and technology of soft

drinks and fruit juices. 2nd edition, Blackwell Publishing Ltd, 90-128, 2005.
100
TEIMOURI, S.; ABBASI, S.; SCANLON, M.G. Stabilisation mechanism of various

inulins and hydrocolloids: Milk–sour cherry juice mixture. International Journal
of Dairy Technology, 71, 208-215, 2018.
TENNANT, D. R. Screening potential intakes of colour additives used in non-

alcoholic beverages. Food and Chemical Toxicology 46, 1985–1993, 2008.
TIMMIS, K. N. (2002). Pseudomonas putida: a cosmopolitan opportunist par

excellence. Environmental Microbiology, 4(12), 779-781.
TOURNAS, V. H.; HEERES, J.; BURGESS, L. Moulds and yeasts in fruit salads
and fruit juices. Food Microbiology, v. 23, 684- 688, 2006.
VALAPPIL, S. P., BOCCACCINI, A. R., BUCKE, C., & ROY, I. (2007).

Polyhydroxyalkanoates in Gram-positive bacteria: insights from the genera
Bacillus and Streptomyces. Antonie Van Leeuwenhoek, 91(1), 1-17.
VAN’T HOF, W.; VEERMAN, E.C.; HELMERHORST, E.J.; AMERONGEN, A.V.

Antimicrobial peptides: Properties and applicability. Journal of Biological
Chemistry, 382, 597–619, 2001.
VARNER, S. L., HOLLIFIELD, H. C., ANDRZEJEWSKI, D. Determination of

benzene in polypropylene food-packaging materials and food-contact paraffin
waxes. Journal of the Association of Official Analytical Chemists, v. 74, n.2.
p. 367–374, 1991.
SAMSON, R.A. Cellular constitution, water and nutritional needs, and secondary
metabolites. In: Environmental mycology in public health: fungi and
mycotoxins risk assessment and management. Academic Press, 2015
VRANCHEVA, R.; IVANOV, I.; ANEVA, I.; STOYANOVA, M.; PAVLOV, A. Food
additives and bioactive substances from in vitro systems of edible plants from the
Balkan peninsula. Engineering in Life Sciences, 18, 799-806, 2018.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Benzoic acid and sodium benzoate.

Concise International Chemical Assessment Document 26, Geneva, 2000.
WIKIMEDIA COMMONS. Descarboxilação do ácido benzóico. Disponível em:

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Benzoic_acid_decarboxylation.svg
Acesso em: 22 abril 2020.
101
WU, Y.; LI, Q.; ZHANG, X.; LI, Y.; LI, B.; LIU, S. Cellulose-based peptide
polysaccharides as cationic antimicrobial package films. International Journal
of Biological Macromolecules, 2019, in press.
XU, X-B; LIU, D-B; YU, S-J.; YU, P.; ZHAO, ZG. Separation and determination of
4-methylimidazole, 2-methylimidazole and 5-hydroxy- methylfurfural in
beverages by amino trap column coupled with pulsed amperometric detection.
Food Chemistry, 169, 224–229, 2015.
YAMASHITA, H.; MATSUHARA, H.; MIOTANI, S.; SAKO, Y.; MATSUI, T.;
TANAKA, H.; INAGAKI, N. Artificial sweeteners and mixture of food additives
cause to break oral tolerance and induce food allergy in murine oral tolerance
model for food allergy. Clinical & Experimental Allergy, 47, 1204–1213, 2017.
ZANUTTO-ELGUI, M, R. VIEIRA, J. C. S.; PRADO, D. Z.; BUZALAF, M. A. R.;

PADILHA, P. M.; OLIVEIRA; D. E.; FLEURI, L. F. Production of milk peptides with
antimicrobial and antioxidant properties through fungal proteases. Food
Chemistry, 278, 823-831, 2019.
ZHANG, G.; MA, Y. Mechanistic and conformational studies on the interaction of

food dye amaranth with human serum albumin by multispectroscopic methods.
Food Chemistry, 136, 442–9, 2013.
ZHANG, D., CHENG, X., SUN, D., DING, S., CAI, P., YUAN, L., ... & HU, Q. N.
AdditiveChem: A comprehensive bioinformatics knowledge-base for food additive
chemicals. Food chemistry, 308, 125519, 2020.
102
ANEXO I Concentração máxima de aditivos permitida em bebidas não alcoólicas à

base de água, de acordo com o Codex Alimentarius (Adaptado de FAO/WHO, 2016)
Aditivo Codex Alimentarius
Acessulfame de potássio (INS 950) 350 mg.kg-1 (NF, NV, CNF, CNV);
600 mg.kg-1 (BFNA, BFCA, BFIA)
Ácido acético glacial (INS 260) BPF (BFIA)
Ésteres acéticos e ácidos graxos de BPF (BFIA)

glicerol (INS472a)
Adipato de amido acetilado (INS 1422) BPF (BFIA)
Fosfato de amido acetilado (INS 1414) BPF (BFIA)
Amido tratado por ácido (INS 1401) BPF (BFIA)
Agar (INS 406) BPF (BFIA)
Ácido algínico (INS 400) BPF (BFIA)
Alitame (INS 956) 40 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Amido tratado por álcali (INS 1402) BPF (BFIA)
Vermelho Alura AC (INS 129) 300 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Ácido ascórbico, L- (INS 300) BPF (SF, SV, CSF, CSV, NF, NV, CNF,
CNV, BFIA)
Ésteres ascórbicos (INS 304-5) 1000 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Aspartame (INS 951) 600 mg.kg-1 (NF, NV, CNF, CNV, BFNA,
BFCA, BFIA)
Cera de abelha (INS 901) BPF (BFIA); 200 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Benzoatos (INS 210-13) 1000 mg.kg-1 (SF, CSF, NF, CNF,

BFIA); 600 mg.kg-1 (CNV), 250 mg.kg-1
(BFNA, BFCA)
103
Amido branqueado (INS 1403) BPF (BFIA)
Azul brilhante FCF (INS 133) 100 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Ascorbato de cálcio (INS 302) BPF(SF, CSF, NF, CNF)
Carbonato de cálcio (INS 170(i)) BPF (BFIA)
Cloreto de cálcio (INS 509) BPF (BFIA)
Lactato de cálcio (INS 327) BPF (BFIA)
Cera de candelila (INS 902) 200 mg.kg-1 (BFNA, BFCA); BPF (BFIA)
Cantaxantina (INS 161g) 5 mg.kg-1 (BFNA, BFCA, CBFA)
Caramelo III (INS 150c) 5000 mg.kg-1 (BFNA, BFCA);

10000 mg.kg-1 (BFIA)
Caramelo IV (INS 150d) 50000 mg.kg-1 (BFNA, BFCA);

10000 mg.kg-1 (BFIA)
Dióxido de carbono (INS 290) BPF (SF, CSF, NF, CNF, BFIA)
Carminas (INS 120) 100 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Cera de carnaúba (INS 903) 200 mg.kg-1 (BFNA, BFCA, BFIA)
Goma caroba (INS 410) BPF (BFIA)
Carotenos, beta-, vegetais (INS 160a) 2000 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Carotenoides (INS 160a, e, f) 100 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Carragena (INS 407) BPF (BFIA)
Clorofilas e clorofilinas, complexos de 300 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)

cobre (INS 141)
Ácido cítrico (INS 330) BPF (SV, CSV, NV, CNV, BFIA);
3000 mg.kg-1 (SF, CSF); 5000 mg.kg-1
(NF, CNF)
104
Ésteres cítricos e ácidos graxos de BPF (BFIA)

glicerol (INS 472c)
Ciclamatos (INS 952) 400 mg.kg-1 (NF, NV, CNF, CNV);

350 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Ciclodextrina, beta- (INS 459) 500 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Dextrinas, amido tostado (INS 1400) BPF (BFIA)
Ésteres diacetiltartáricos e ácidos graxos 5000 mg.kg-1 (BFNA, BFCA);

de glicerol (INS 472e) 500 mg.kg-1 (BFIA)
Dimetil dicarbonato (INS 242) 250 mg.kg-1 (BFNA, BFCA, BFIA)
5’-guanilato dissódico (INS 627) BPF (BFIA)
5’-inosinato dissódico (INS 631) BPF (BFIA)
5´- ribonucleotídeo dissódico (INS 635) BPF (BFIA)
Fosfato de amido (INS 1412) BPF (BFIA)
Etileno diamina tetra acetatos (INS 385- 200 mg.kg-1 (BFNA, BFCA);
86)
35 mg.kg-1 (BFIA)
Verde rápido FCF (INS 143) 100 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Citrato de amónio férrico (INS 381) 10 mg.kg-1 (CBFA)
Ácido fumárico (INS 297) BPF (BFIA)
Goma gelana (INS 418) BPF (BFIA)
Glicerol (INS 422) BPF (BFIA)
Éster de glicerol de colofónia da madeira 150 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)

(INS 455)
Extrato de casca de uva (INS 163) 300 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Goma guar (INS 412) BPF (BFIA)

105
Goma arábica (INS 414) BPF (BFIA)
Hidroxibenzoatos, para- (INS 214, 218) 450 (BFIA); 500 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Hidroxipropil celulose (INS 463) BPF (BFIA)
Hidroxipropil fosfato de amido BPF (BFIA)

(INS 1442)
Hidroxipropil metil celulose (INS 464) BPF (BFIA)
Hidroxipropilamido (INS 1440) BPF (BFIA)
Indigotina (INS 132) 100 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Óxidos de ferro (INS 172) 100 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Citratos de isopropila (INS 384) 200 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Goma caraia (INS 416) BPF (BFIA)
Goma konjac (INS 425) BPF (BFIA)
Ésteres láticos e ácidos graxos de BPF (BFIA)

glicerol (INS 472b)
Éster etílico de arginato láurico (INS 243) 50 mg.kg-1 (BFNA, BFCA, CBFA)
Lecitina (INS 322(i)) BPF (BFIA)
Carbonato de magnésio (INS 504(i)) BPF (BFIA)
Cloreto de magnésio (INS 511) BPF (BFIA)
Hidróxido de magnésio (INS 528) BPF (BFIA)
Hidroxicarbonato de magnésio BPF (BFIA)

(INS 504(ii))
Ácido málico, DL- (INS 296) BPF (SF, SV, CSF, CSV, NF, NV, CNF,
CNV, BFIA)
Metilcelulose (INS 461) BPF (BFIA)

106
Metiletilcelulose (INS 465) BPF (BFIA)
Celulose microcristalina (INS 460(i)) BPF (BFIA)
Ésteres de mono e diglicerídeos com BPF (BFIA)

ácidos graxos (INS 471)
L-glutamato monossódico (INS 621) BPF (BFIA)
Fosfato monoamido (INS 1410) BPF (BFIA)
Neotame (INS 961) 50 mg.kg-1 (BFIA); 65 mg.kg-1 (NV,

CNV); 33 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Nitrogênio (INS 941) BPF (BFIA)
Amido oxidado (INS 1404) BPF (BFIA)
Pectinas (INS 440) BPF (SF, CSF, NF, NV, CNF, CNV,
BFIA)
Fosfato de amido fosfatado (INS 1413) BPF (BFIA)
Fosfatos (INS 338-43; 450-52; 542) 300 mg.kg-1 (BFIA); 1000 mg.kg-1 (SF,
CSF, NF, CNF, BFNA, BFCA)
Polidimetilsiloxano (INS 900a) 20 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Polietilenoglicol (INS 1521) 1000 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Polivinilpirrolidona (INS 1201) 500 mg.kg-1 (CBFA)
Polisorbatos (INS 432-36) 500 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Ponceau 4R (INS 124) 50 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Carbonato de potássio (INS 501(i)) BPF (BFIA)
Cloreto de potássio (INS 508) BPF (BFIA)
Citrato monobásico de sódio (INS 332(i)) BPF (BFIA)
Celulose em pó (INS 460(ii)) BPF (BFIA)

107
Algas Eucheuma processadas (INS 407) BPF (BFIA)
Galato de propila (INS 310) 1000 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Ésteres de propilenoglicol de ácidos 500 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)

graxos (INS 477)
Pululano (INS 1204) BPF (BFIA)
Extrato quilaia (INS 999) 50 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Riboflavinas (INS 101) 50 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Sacarinas (INS 954(i)-(iv)) 80 mg.kg-1 (NF, NV, CNF);200 mg.kg-1

(BFIA);300 mg.kg-1 (BFNA, BFCA,
CBFA)
Sais de ácidos mirístico, palmítico e BPF (BFIA)

esteárico com amônia, cálcio, potássio e
sódio (INS 470(i))
Sais de ácido oleico com cálcio, potássio BPF (BFIA)

e sódio (INS 470(ii))
Goma laca, branqueada (INS 904) BPF (BFIA)
Dióxido de silício, amorfo (INS 551) BPF (BFIA)
Acetato de sódio (INS 262(i)) BPF (BFIA)
Alginato de sódio (INS 401) BPF (BFIA)
Ascorbato de sódio (INS 301) BPF (SF, CSF, NF, CNF, BFIA)
Carbonato de sódio (INS 500(i)) BPF (BFIA)
Carboximetilcelulose sódica (INS 466) BPF (BFIA)
Citrato monossódico (INS 331(i)) BPF (BFIA)
Malato dissódico D, L- (INS 350(ii)) BPF (BFIA)

108
Fumarato de sódio (INS 365) BPF (BFIA)
Gluconato de sódio (INS 576) BPF (BFIA)
Bicarbonato de sódio (INS 500(ii)) BPF (BFIA)
Lactato de sódio (INS 325) BPF (BFIA)
Sorbatos (INS 200-03) 1000 mg.kg-1 (SF, CSF, NF, CNF);

500 mg.kg-1 (BFNA, BFCA, BFIA)
Cloreto estanhoso (INS 512) 20 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Octenilsuccinato de amido sódico BPF (BFIA)

(INS 1450)
Amidos, tratados com enzimas BPF (BFIA)

(INS 1405)
Citrato de estearila (INS 484) 500 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Esteviosídeo (INS 960) 200 mg.kg-1 (NF, NV, BFNA, BFCA,

BFIA)
Sucralose (INS 955) 300 mg.kg-1 (NF, NV, CNF, CNV, BFNA,
BFCA, BFIA)
Sucroglicerídeos (INS 474) 200 mg.kg-1 (BFNA, BFCA);

1000 mg.kg-1 (BFIA)
Acetato isobutirato de sacarose 500 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)

(INS 444)
Sulfitos (INS 220-25, 539) 50 mg.kg-1 (SF, SV, CSF, CSV, NF, NV,
CNF, CNV); 70 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Amarelo crespúsculo FCF (INS 110) 100 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Goma tara (INS 417) BPF (BFIA)
Tartaratos (INS 334-5, 337) 4000 mg.kg-1 (SF, CSF, NF, CFN)
109
Tiodipropionatos (INS 388-89) 1000 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Goma tragancanto (INS 413) BPF (BFIA)
Citrato tripotássico (INS 332(ii)) BPF (BFIA)
Citrato trietílico (INS 1505) 200 mg.kg-1 (BFNA, BFCA)
Citrato trissódico (INS 331(iii)) BPF (BFIA)
Goma xantana (INS 415) BPF (BFIA)
Descrição das abreviações: Boas Práticas de Fabricação (BPF), Sucos de Fruta (SF), Sucos de
Vegetais (SV), Concentrados para Sucos de Fruta (CSF), Concentrados para Sucos de Vegetais
(CSV), Néctares de Frutas (NF), Néctares de Vegetais (NV), Concentrados para Néctares
Vegetais (CNV), Concentrados para Néctares de Frutas (CNF), Bebidas Flavorizadas Não-
carbonatadas à base de Água (BFNA), Bebidas Flavorizadas Carbonatadas à base de Água
(BFCA), Concentrados para Bebidas Flavorizadas à base de Água (CBFA), Bebidas
Fermentadas ou Infusionadas à base de Água (BFIA).

Marselle Marmo Do Nascimento Silva

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MARSELLE MARMO DO NASCIMENTO SILVA

BEBIDAS NÃO ALCOÓLICAS: AVALIAÇÃO DA QUALIDADE

BEBIDAS NÃO ALCOÓLICAS: AVALIAÇÃO DA QUALIDADE

Tese de Doutorado apresentada ao

Orientadores: Profa. Dra. Maria Alice Zarur Coelho

BEBIDAS NÃO ALCOÓLICAS: PANORAMA SOBRE QUALIDADE

Tese de Doutorado apresentada ao

SILVA, Marselle Marmo do Nascimento. Bebidas não alcoólicas: avaliação da

O mercado de bebidas não alcoólicas é um nicho a ser explorado, com potencial

A grande maioria das bebidas não alcoólicas possui aditivos em suas

Ao longo do tempo e com o uso indiscriminado, diversas linhagens de micro-

Palavras-chave: benzeno, deterioradores, bactérias acidófilas, conservantes,

SILVA, Marselle Marmo do Nascimento. Non-alcoholic beverages: evaluation

The vast majority of non-alcoholic beverages have additives in their formulations,

PEREIRA, K. S.; SILVA, M. M. N; HOLANDA, V. L.; COELHO, M. A. Z. Case

PEDROSA, L.; LOURENCO, H. S.; SILVA, M. M. N; PEREIRA, K. S; COELHO,

ALMEIDA, D. M. M.; Souza, C. R.; SILVA, M. M. N.; PEREIRA, K. S. Avaliação

SILVA, M. M. N; SILVA, R. S.; CRUZ, T. A.; PINHO, M. B.; PEREIRA, K. S.;

Trabalhos completos em congresso

SILVA, M. M. N; PEREIRA, K. S; COELHO, M. A. Z. Benzoic acid and benzene

Artigos publicados em revistas científicas

SILVA, M. M. N; SILVA, R. S.; CRUZ, T. A.; PINHO, M. B.; PEREIRA, K. S.;

SILVA, M. M. N; ALBUQUERQUE, T. L.; PEREIRA, K. S.; COELHO, M. A. Z.

SILVA, A. R. A.; SILVA, M. M. N., RIBEIRO, B. D. Nutritional and Color

Borges, T. J.; SILVA, M. M. N; PEREIRA, K. S. Identificação de Deterioradores

Corrêa, D. S.; GULAO, E. S.; SILVA, M. M. N.; COELHO, M. A. Z.; ROCHA-

ALMEIDA, D. M. M.; SILVA, M. M. N; PEREIRA, K. S. Comparação de

SALES, J. C. S.; SILVA, M. M. N; LAZARO, C. C.; PEREIRA, K. S.; RIBEIRO, B.

ALMEIDA, D. M. M.; SILVA, M. M. N; PEREIRA, K. S. Comparação de

Trabalhos completos em congresso

MORETTI, L. K.; ALMEIDA, D. M. M.; Borges, T. J.; SILVA, M. M. N; PEREIRA,

ALMEIDA, D. M. M.; SILVA, M. M. N.; PEREIRA, K. S. Análise comparativa de

SILVA, ALINE R.A.; SILVA, M. M. N.; RIBEIRO, BERNARDO D. Health Issues

Borges, T. J.; MORETTI, L. K.; SILVA, M. M. N; PEREIRA, K. S.; TONDO, E. C.

SILVA, M. M. N.; PEREIRA, K. S.; RIBEIRO, B. D. Grupos microbianos de

Figura 1. Esquema simplificado da amostragem realizada para avaliação de soluções

Alimentos e bebidas são matrizes bioquímicas complexas que muitas vezes

Estudar matrizes tão únicas abordando mais de uma vertente se prova um

Bebidas não alcoólicas são amplamente consumidas mundialmente e, por

Tal estudo, além de responder a questionamentos importantes sobre a

O objetivo deste trabalho foi avaliar a segurança química e a qualidade

Capítulo 1: Identificar os principais micro-organismos contaminantes de diversas

Capítulo 2: Determinar os perfis de degradação dos ácidos orgânicos mais

Capítulo 3: Avaliar a capacidade antimicrobiana dos ácidos orgânicos já

1. Bebidas não alcoólicas

O grupo das bebidas é dividido em bebidas alcoólicas e não alcoólicas. O

Refrigerantes Quentes Lácteas Cerveja

Águas Chá Leite Vinho

Carbonatados Leite Destilados

Concentrados Outras Outros

Figura 1. Categorias de bebidas atualmente adotadas (Fonte: ROETHENBAUGH, 2005).

No âmbito brasileiro, segundo o Decreto nº 6.871 de 2009, bebida não

segmentação e definição das bebidas não alcoólicas em sucos, polpas, água de

Já a RDC nº 18 de 2010, que dispõe sobre alimentos para atletas,

As bebidas à base de leite são geralmente incluídas nos produtos lácteos,

Devido ao ritmo de atividades que o mundo globalizado tem imposto às

Bebidas não Descrição

2. Mercado mundial de consumo de bebidas não alcoólicas

Bebidas não alcoólicas comerciais estão disponíveis na maioria dos países

O Quadro 2 apresenta a segmentação desse setor por categoria de bebida,

Categoria de Volume de produção Produção em Consumo per capita

Refrigerantes 12,84 42,1 61,82

Segundo a Associação Brasileira das Indústrias de Refrigerantes e de