UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARABA CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS E DA SADE DEPARTAMENTO DE FARMCIA E BIOLOGIA

Doseamento Microbiolgico de Antibiticos

Prof. ANA FLVIA OLIVEIRA SANTOS

Dosagem Microbiolgica de Antibiticos

Substncias

qumicos;

no quantificveis por mtodos fsico-

1929 Penicilina (Fleming); 1948 Farmacopia Britnica; 1955 United States Pharmacopea (USP); Procedimentos gerais

Padro USP;
Cepas ATCC (American Type Culture Collection);

Dosagem Microbiolgica de Antibiticos

Avaliao comparativa, frente a um padro biolgico de referncia;

Padro USP;
Cepas ATCC (American Type Culture Collection);
P2 - 5g 17 mm P1 - 2,5 g 13,22 mm

P3 - 10g 19,11 mm P4 - 20g 22,11 mm

Placa com os padres de Ciprofloxacina e o microrganismo-teste

Staphylococcus aureus
ATCC 25923.

Doseamento microbiolgico de antibiticos

A quantificao microbiolgica de substncias ativas demanda

sempre no emprego de uma avaliao comparativa frente a um padro biolgico de referncia.

Mtodos microbiolgicos para determinao da potncia dos

antibiticos so indicados para substncias ou preparaes, em que o seu teor no poder ser determinado por mtodos fsicoqumicos.
A atividade (potncia) de antibiticos pode ser demonstrada

sob condies adequadas atravs de seu efeito inibitrio sobre o crescimento microbiano.
Uma

reduo na atividade antimicrobiana pode revelar alteraes sutis no demonstrveis por mtodos qumicos.

Mtodos biolgicos para determinao de Potncia de Antibiticos

Difuso em gar Ensaio de difuso em gar ou cilindro em placas (este mtodo fundamenta-se na determinao da potncia do antibitico em estudo, com relao a potncia do seu padro internacional de referncia, atravs de halos de inibio do crescimento do microrganismo sensvel a este antibitico, em meio de cultura especfico e condies adequadas. Mtodo Turbidimtrico

Mtodo turbidimtrico (considera a relao entre a proporo de crescimento da populao microbiana no meio lquido e a concentrao da substncia ensaiada, sendo mais empregado no doseamento de vitaminas e aminocidos).

Difuso em Agar fundamentalmente um mtodo fsico, no qual um microrganismo usado como Revelador. Relaciona o tamanho da zona de exibio (fatores de crescimento) ou inibio (antibitico) de crescimento com a dose da substncia ensaiada. Emprega meio de cultura slido inoculado, distribudo em placas, em sistema mono ou bicamadas, atravs do qual a substncia teste se difunde. A soluo teste aplicada sobre a superfcie do meio, em rea restrita, e as placas so ento incubadas. O crescimento do microrganismo ocorre respeitando, porm, reas onde tenha ocorrido a difuso do antibitico, gerando contraste e resultando a chamada zona de inibio de crescimento.

Soluo teste nas placas Semeadas

Cilindros ou furos no gel;

Mtodos dependentes da concentrao da soluo teste; Disco de papel ou mtodos nos quais a soluo amostra transferida na forma de micro gotas; Mtodos dependentes da quantidade testada em cada unidade de suporte.

Desvantagens do mtodo de cilindro em placa

No formao de halos ntidos; Ocasional deficincia de contato do cilindro com a superfcie do gar provocando o aparecimento de halos deformados.

Fatores que influenciam a Dosagem microbiolgica

pH; Condies de incubao; Composio do meio; Espessura; Uniformidade do gar; Fatores que afetam o tamanho do halo de inibio de crescimento Escolha do microrganismo e sua sensibilidade; Condio do microrganismo teste, se na forma vegetativa ou esporulada; Densidade de semeadura; Espessura do gel e tamanho do halo so inversamente proporcionais; Potncia da soluo-teste; Volume da soluo teste no cilindro ou disco deve ser grande suficiente para ser considerado constante, ou ser padronizado; Tempo de aplicao da soluo-teste; Temperatura de incubao, sendo importante a sua uniformidade.

Consideraes para o ensaio por Difuso em Agar

Cada placa de 10 cm de dimetro comporta at 6 cilindros ou igualmente 6 furos.

No caso dos cilindros a colocao pode ser manual com auxlio de pina ou atravs de dispensadores que simultaneamente colocam todos os cilindros por placa. Os solventes, diluentes, preparao da amostra e faixas de concentrao devem seguir orientao da monografia especfica. Aplicar solues nos cilindros (ou outro dispositivo) por meio de pipeta que libere volume uniforme da ordem de 0,2mL. Cuidados dizem respeito a randomizao das placas na distribuio de solues-padro e de amostras, dentro do menor tempo possvel para transferncia das solues, a fim de que a difuso inicie ao mesmo tempo.

Consideraes para o ensaio por Difuso em Agar

Incubar as placas na temperatura indicada, com variao mxima de 0,5C durante o perodo de 16 a 18horas. Medir o dimetro das zonas de inibio do crescimento e calcular a potncia da substncia a partir dos resultados.

% A/P = Antilog [2 + F/E x log (rd)] Onde: F = ( A total P total) /3 E = [ (Total A3 Total A1) + ( Total P3 Total P1)] / 4 Rd = razo das doses ou % A/P= 102 (Rd
F/E)

Farmacopia Brasileira

Meio de cultura a ser usado (conforme 3. Antibitico Microrganismo Meios de cultura).

Base

Superfcie 11

Volume (mL) de meio a ser Volume de aplicado nas Temperatura inculo camadas. de incubao mL/100 das placas C ml
Base 21 Superfcie 4 0,5 32 a 35

Amoxilina

Micrococcus luteus (ATCC- 9341)

11

Ampiclina Anfomicina

Micrococcus luteus (ATCC - 9341) Micrococcus flavus resistente neomicina (ATCC 14452)
Micrococcus luteus (ATCC - 7468) Micrococcus luteus (ATCC - 10240)

11 2

11 1

21 21

4 4

0,5 0,5

32 a 35 36 a 38

Bacitracina Bacitracina

2 2

1 1

21 21

4 4

0,3 0,3

32 a 35 32 a 35

Condies para o ensaio de Cefalexina Produto em anlise: Cefalexina. Forma farmacutica: Drgeas Mtodo empregado: Difuso em gar Microrganismo teste: Micrococcus luteus Soluo diluente: Tampo fosfato de potssio pH 6,0 Meios de cultura Camada base - gar Muller Hinton Camada semeada - gar Muller Hinton Volume do inculo: 0,2 mL Concentrao inicial: 1000 l/mL

Concentraes finais: 10, 20 e 40 l/mL

Temperatura de incubao: 35-37 C Tempo de incubao: 18 horas

Mtodo Turbidimtrico
Caracteriza-se por sries de tubos contendo concentraes muito prximas do antibitico, alm do meio de cultura lquido e microrganismo teste. O princpio do mtodo simples... A substncia teste adicionada a suspenso do organismo teste presente em meio nutriente, e aps incubao da mistura procede-se a leitura da resposta. Consideraes para o ensaio por Turbidimetria Empregar para cada antibitico o microrganismo e caldo nutritivo indicado pela Farmacopia; Determinar experimentalmente o volume de inculo a ser adicionado a 100mL de Caldo a partir da quantidade sugerida; O meio inoculado deve ser preparado e utilizado imediatamente;

Consideraes para o ensaio por Turbidimetria

Distribuir em tubos idnticos, volumes igual de cada uma das solues amostra e padro; Pelo menos 18 tubos so usados para o ensaio;Trs tubos para cada concentrao do padro e da amostra; Incubar em banho maria, temperatura adequada, de 3 a 4 horas; Tomando a preocupao de assegurar temperatura uniforme e tempo de incubao idntico para todos os tubos;

Aps o perodo de incubao, interromper a multiplicao dos microrganismos pela adio de 0,5mL de soluo de formaldedo, a 12% em cada tudo;
Determinar a absorvncia para cada tubo em fotocolormetro apropriado, no comprimento de onda de 530 nm; A partir dos resultados, calcular a potncia da amostra e seus limites de confiana.

Dosagem Microbiolgica de Antibiticos

Difuso em gar Mtodo fsico

Microrganismo revelador
Zona de Inibio de crescimento Mtodo Turbidimtrico

Inibio de crescimento
Soluo uniforme do antibitico Caldo

Referncias
Farmacopia brasileira 4 ed., 1988. Frehlich, P. E.; Schapoval, E. E. S. Doseamento microbiolgico do norfloxacino, mtodo da difuso em gar (cilindro em placas). Rev. Cinc. farm. So Paulo. v.12, p.161-65, 1990. Lachman, L.; Lieberman, H.A.; Kanig, J.L. Teoria e prtica na indstria farmacutica. V.2, lisboa: fundao calustre gulberman, 2001. Pinto, T. J.; Kaneko, T. M.; Ohara, M. T. Controle biolgico de qualidade de produtos farmacuticos e correlatos. So paulo: atheneu, 2000. Cezaretto, d. C.; Controle da qualidade microbiolgica medicamentos. So Joo da Boa Vista; So Paulo, 2005. de