Resumo P3 – Controle de Qualidade Biológico

Aula 11
TESTE DE ESTERILIDADE
Os testes de esterilidade aplicam-se a insumos farmacêuticos, medicamentos e produtos para
saúde que, de acordo com a Farmacopeia, devem ser estéreis, sendo adequados para revelar a
presença de bactérias e fungos.
Contudo, um resultado satisfatório indica que não foi encontrado micro-organismo contaminante
somente na amostra examinada. A extensão desse resultado ao restante do lote requer a segurança
de que todas as unidades do mesmo lote tenham sido preparadas de modo a garantir grande
probabilidade de que todo o lote passaria pelo teste. Obviamente, isso depende das precauções
tomadas durante os processos operacionais de fabricação, de acordo com as Boas Práticas de
Fabricação.

PRECAUÇÕES DURANTE O TESTE

Para a realização do teste de esterilidade é importante que as pessoas sejam adequadamente
treinadas e qualificadas. Os testes devem ser realizados sob condições assépticas, utilizando, por
exemplo, capela de fluxo laminar classe II tipo A (máximo 3520 partículas ≥ 0,5 μm/m3), que
deve estar instalada em sala limpa classe B - ISO 7 (máximo 352 000 partículas ≥ 0,5 μm/m3).
Para testes de esterilidade de fármacos oncogênicos, mutagênicos, antibióticos, hormônios,
esteroides e outros, os testes devem ser realizados na capela classe II tipo B2, que possui sistema
de exaustão externo ao ambiente do laboratório.
Não devem ser realizados testes sob exposição direta de luz ultravioleta ou em áreas sob
tratamento com aerossóis. As condições devem ser adequadas de forma a evitar contaminação
acidental da amostra durante o teste e, também, não afetar a detecção de possíveis contaminantes.
Controles ambientais das áreas de trabalho devem ser realizados regularmente (controle do ar e
de superfícies, contagens de partículas, determinação de velocidade e direção do fluxo de ar, entre
outros).

PADRONIZAÇÃO DO INÓCULO
Usualmente, são necessários ajustes para se obter densidade específica de células microbianas
viáveis (não mais que 100 UFC) no meio de cultura. Para estabelecer um volume que contenha
a densidade recomendada de células, diluições em série devem ser realizadas a partir de uma
suspensão estoque, procedendo-se a contagem em placas para determinar a densidade
microbiana obtida com cada diluição.
Se o procedimento estiver bem padronizado, é possível reproduzir os resultados com a mesma
cepa microbiana. É recomendável a utilização de subculturas de microorganismos até no máximo
5 transferências, a partir da cultura original.

ESTERILIDADE
Confirmar a esterilidade de cada lote de meio esterilizado incubando todos os frascos dos meios
nas condições especificadas por 14 dias. Não deve ocorrer crescimento microbiano.
 ➔ A ocorrência de crescimento microbiano inutiliza o lote de meio para o teste de
esterilidade.

PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO
Cada lote de meio de cultura esterilizado deve ser testado quanto à sua capacidade em promover
o crescimento de micro-organismos. Inocular, separadamente, em duplicata, tubos de cada meio
com volume de inóculo contendo não mais que 100 UFC de cada cepa microbiana listada na
Tabela 1 e incubar conforme as condições especificadas para cada meio.
O teste de promoção de crescimento é considerado válido se houver evidência de crescimento
microbiano, visualizado pela turvação e/ou por métodos microscópicos, após 3 dias de incubação
dos meios inoculados com bactérias e após 5 dias de incubação dos meios inoculados com fungos.

TESTE DE VALIDAÇÃO PARA BACTERIOSTASE E FUNGISTASE

Antes de se estabelecer um procedimento para o teste de esterilidade de insumos farmacêuticos,
medicamentos ou produtos para saúde, deve-se garantir que qualquer atividade bacteriostática ou
fungistática inerente ao produto não tem influência adversa sobre a confiabilidade do teste,
demonstrando-se que o procedimento utilizado é adequado para o produto sob exame.
O teste de validação para bacteriostase e fungistase deve ser realizado quando o teste de
esterilidade for realizado pela primeira vez para um produto e sempre que houver modificações
na formulação do produto e/ou nas condições experimentais do teste. A validação deve ser feita
previamente ao teste de esterilidade do produto sob exame.
Procedimento
Para realizar o teste de validação, proceder conforme descrito em Procedimentos para o Teste de
Esterilidade, empregando exatamente os mesmos métodos, exceto para as modificações que se
seguem. Nota: para ambos métodos descritos a seguir, utilizar os micro-organismos previamente
especificados (Tabela 1).
Realizar testes de Promoção de crescimento como controle positivo. Incubar todos os frascos
contendo os meios por não mais que 5 dias.

Método de filtração em membrana

Após transferência do conteúdo do(s) frasco (s) a ser(em) testado(s) (conforme especificado na
Tabela 3) para o dispositivo de filtração, adicionar não mais que 100 UFC do micro-organismo
teste à última alíquota do fluido estéril utilizado para lavagem da membrana.
Método de inoculação direta
Após transferência do conteúdo do(s) frasco(s) a ser(em) testado(s) (conforme especificado na
Tabela 3) para frascos contendo os meios de cultura, adicionar não mais que 100 UFC dos
microorganismos testes aos meios.
Interpretação
Se o crescimento de micro-organismos obtido após a incubação é visivelmente comparável àquele
obtido no controle positivo (frasco sem adição de amostra), a amostra não apresenta atividade
antimicrobiana sob as condições do teste ou tal atividade foi satisfatoriamente eliminada.
O teste de esterilidade pode, então, ser conduzido sem necessidade de modificações. Se o
crescimento de micro-organismos não é obtido na presença da amostra, ou se ele não é
visivelmente comparável àquele obtido nos controles positivos, a amostra apresenta atividade
antimicrobiana que não foi satisfatoriamente eliminada, sob as condições do teste.
Nesse caso, devem ser feitas modificações nas condições do teste para eliminar a atividade
antimicrobiana, tais como diluição, uso de substâncias neutralizantes, aumento do número de
lavagens no método de filtração em membrana ou uma combinação delas.
➔ O teste de validação deve ser repetido para verificar se a atividade antimicrobiana foi
eliminada pela modificação proposta.

PROCEDIMENTOS PARA O TESTE DE ESTERILIDADE

O teste de esterilidade pode ser realizado utilizando os métodos de filtração em membrana ou de
inoculação direta conforme a natureza do produto, exceto quando um dos métodos for
especificado na monografia individual. Em ambos casos, controles negativos apropriados devem
ser incluídos.
Antes de proceder ao teste, efetuar assepsia das superfícies externas dos frascos e ampolas,
mergulhando-os em solução antisséptica adequada, ou utilizando outros procedimentos de
desinfecção externa das embalagens como por exemplo, vapores de peróxido de hidrogênio. No
caso de artigos cujas embalagens não resistam a esse tratamento, fazer assepsia das amostras por
meio de tecido não liberador de partículas embebido em solução antisséptica.
Amostragem
A menos que especificado de forma diferente na monografia individual, testar o número de
unidades da amostra especificado na Tabela 2. Se as unidades da amostra apresentam conteúdo
em quantidade suficiente (Tabela 3), o conteúdo de cada unidade pode ser dividido em duas
porções iguais para cada tipo de meio de cultura utilizado.
Se as unidades da amostra não apresentam conteúdo em quantidade suficiente para cada meio,
separar o dobro do número de unidades especificado na Tabela 2 para realização do teste.
 ➔ Resumo laudo:
Avaliação da Atividade (MO + Amostra + Caldo), validação do ensaio. Deve haver cresc.,
comprovando que a amostra não apresenta atv bacteriostática ou fungistática, permitindo o cresc.
de MO. O resultado deve ser comparado ao obtido pelo controle positivo (MO + Caldo, SEM
amostra).
Promoção do Crescimento (MO + Caldo), adc não mais que 100 UFC do inóculo no caldo. Deve
haver crescimento/turvação, capacidade do meio em promover cresc.
Esterilidade (Caldo), incubar cada caldo por 14 dias. Não deve haver crescimento.
Ensaio (Amostra + Caldo), não deve haver cresc., comprovando que de fato a amostra é estéril.

Aula 12
PIROGÊNIOS
O teste de pirogênios fundamenta-se na medida do aumento da temperatura corporal de coelhos,
após injeção intravenosa da solução estéril em análise. Para produtos bem tolerados pelos animais,
utilizar uma dose que não exceda 10 mL/kg, injetada em tempo não superior a 10 minutos. Para
os produtos que necessitem preparação preliminar ou condições especiais de administração,
seguir as recomendações estabelecidas na monografia.
CONDIÇÕES GERAIS
Usar coelhos do mesmo sexo, adultos, sadios, preferencialmente da mesma raça, pesando, no
mínimo, 1,5 kg. Após a seleção, manter os animais em gaiolas individuais em sala com
temperatura uniforme entre 20 e 23 ºC livre de perturbações que possam estressá-los. A
temperatura selecionada pode variar até ± 3 ºC.
Realizar condicionamento para determinação da temperatura dos animais, pelo menos uma vez,
até sete dias antes de iniciar o teste. Os animais deverão ser condicionados segundo o mesmo
procedimento do teste apenas sem inoculação do produto.
➔ Animais que apresentarem elevação de temperatura igual ou superior a 0,5 ºC, em relação
à temperatura inicial, não deverão ser utilizados no teste.
➔ Quando da realização do teste, usar apenas animais com temperatura igual ou inferior a
39,8 oC e que não apresentem, de um para o outro, variação superior a 1,0 ºC.
REGISTRO DA TEMPERATURA
Usar termômetro clínico calibrado com precisão de ± 0,1 ºC ou qualquer outro dispositivo de
registro de temperatura calibrado de igual sensibilidade. Introduzir o termômetro no reto do
animal em profundidade aproximada de 6 centímetros. Se for utilizado dispositivo registrador,
que deva permanecer no reto durante o período do teste, conter os coelhos de maneira que fiquem
em postura natural de repouso. Quando se empregar termômetro clínico, deixar transcorrer o
tempo necessário (previamente determinado) para que alcance a temperatura máxima, antes de
proceder à leitura.
Material
As seringas, agulhas e vidrarias estéreis e apirogênicas. Os diluentes e soluções extratoras ou de
lavagem devem, também, ser estéreis e apirogênicos.
Procedimento
Executar o teste em área especialmente destinada para o teste, sob condições ambientais
controladas, livre de perturbações que possam estressar os coelhos. Nas duas horas precedentes e
durante o teste, suprimir a alimentação. O acesso à água é permitido, mas pode ser restringido
durante o teste.
➔ No máximo 40 minutos antes da injeção da dose do produto a ser testado, registrar a
temperatura de cada animal mediante duas leituras efetuadas com intervalo de 30
minutos. A média das duas leituras será adotada como temperatura de controle
necessária para avaliar qualquer aumento individual de temperatura subseqüente à injeção
da amostra. Preparar o produto a ser testado conforme especificado na monografia e
aquecer a 37 ± 2 ºC.
Para o teste de pirogênios de materiais de uso hospitalar lavar, com solução fisiológica estéril, as
superfícies do material que entram em contato com o produto, local de injeção ou tecido interno
do paciente. Efetuar os procedimentos assegurando que a solução não seja contaminada. Injetar
pela veia marginal da orelha de três coelhos não menos do que 0,5 mL nem mais que 10 mL da
solução por kg de peso corporal ou a quantidade indicada na monografia.
A injeção não deve durar mais que 10 minutos, a menos que na monografia se especifique tempo
diferente. Registrar a temperatura de cada animal em intervalos de 30 minutos durante 3 horas
após a injeção → 6 resultados para cada animal.
Interpretação
Não considerar os decréscimos de temperatura apresentados pelos animais durante o teste. O
aumento de temperatura é verificado pela diferença entre a maior temperatura apresentada pelo
coelho durante o teste e a sua temperatura de controle.
➔ Se nenhum dos três coelhos apresentar aumento individual da temperatura igual ou
superior a 0,5 oC, em relação às suas respectivas temperaturas controle, o produto cumpre
com os requisitos do teste de pirogênios.

➔ Se algum coelho apresentar aumento da temperatura igual ou superior a 0,5 oC, repetir o
teste utilizando outros cinco animais.

➔ O produto em exame cumpre os requisitos para ausência de pirogênios se no máximo três

dos oito coelhos apresentarem aumentos individuais de temperatura iguais ou superiores
a 0,5 oC, e se a soma dos aumentos individuais de todos os coelhos não exceder a 3,3
oC.

Aula 13
ENDOTOXINAS BACTERIANAS
O teste de endotoxina bacteriana é usado para detectar ou quantificar endotoxinas de bactérias
gram negativas presentes em amostras para qual o teste é preconizado. Utiliza-se o extrato aquoso
dos amebócitos circulantes do Limulus polyphemus ou do Tachypleus tridentatus preparado e
caracterizado como reagente LAL.
Há duas técnicas com sensibilidade diferente para este teste:
1. MÉTODO DE COAGULAÇÃO EM GEL: baseado na formação de coágulo ou gel (método
semi-quantitativo)
2. MÉTODOS FOTOMÉTRICOS quantitativos que incluem:
O MÉTODO TURBIDIMÉTRICO, (baseado no desenvolvimento de turbidez após quebra de um
substrato endógeno);
O MÉTODO CROMOGÊNICO (baseado no desenvolvimento de cor após quebra de um
complexo peptídeo sintético cromógeno).
Qualquer um destes procedimentos pode ser realizado, a menos que indicado contrário na
monografia. No método de coagulação em gel, a determinação do ponto final da reação é feita a
partir de diluições da substância sob teste em comparação direta com diluições paralelas da
endotoxina padrão. As quantidades de endotoxinas são expressas em unidades de endotoxina
(UE) definidas.
O reagente LAL (lisado de amemócito de Limulus sp.) é preparado para as leituras turbidimétricas
ou colorimétricas e estes procedimentos podem ser utilizados se cumprirem os requisitos dos
métodos.
Para sua calibração é necessária a elaboração de uma curva padrão obtendo-se a sua regressão
linear, na qual se determina, por interpolação, a concentração de endotoxina da substância sob
teste.
O procedimento inclui incubação da endotoxina padrão para obtenção de uma curva de calibração
e das soluções controle com reagente LAL, por tempo pré-determinado e leitura
espectrofotométrica no comprimento de onda adequado.
No caso do procedimento do método turbidimétrico, a leitura é feita imediatamente após período
final de incubação, e para o procedimento colorimétrico a reação enzimática é interrompida no
final do tempo pré-determinado pela adição do reagente, antes das leituras.
Para os procedimentos cinéticos turbidimétricos e colorimétricos os valores de absorvância
medida durante o período da reação e valores de velocidades são determinados para aquelas
leituras.
PREPARAÇÃO DA ENDOTOXINA PADRÃO DE REFERÊNCIA E DO PADRÃO DE
ENDOTOXINA
O padrão de endotoxina de referencia tem uma potência definida de 10.000 UE (unidades de
endotoxina) por frasco. Reconstitua o frasco com 5 mL de agua grau reagente LAL (livre de
pirogênio) e agite em vórtex intermitentemente por 30 minutos. Use esta solução concentrada
(conservada em refrigerador por não mais que 14 dias) para fazer diluições seriadas. Agite
vigorosamente antes do uso por pelo menos 3 minutos e proceda às diluições seriadas, agitando
no mínimo 30 segundos antes das próximas diluições. Após o uso desprezar as diluições devido
à perda de atividade por adsorção. Para a preparação do padrão de endotoxina (siga as orientações
do fornecedor, certificados no laudo de endotoxina).

Preparação para o teste

Usar reagente LAL com sensibilidade declarada confirmada. A validade dos resultados do teste
para endotoxinas bacterianas requer a demonstração de que as amostras, soluções de lavagens ou
extratos sob teste não inibem ou potencializam a reação e tampouco interferem com o teste. A
validação é realizada por meio de teste de inibição ou potencialização descrito para cada uma das
técnicas indicadas. São incluídos controles negativos apropriados. A validação deve ser repetida
se houver mudança na origem do reagente LAL, no método de produção ou na formulação da
substancia sob teste.
Preparação da amostra
Prepare a solução de amostra dissolvendo a mesma em água grau reagente LAL. Se necessário
ajuste o pH da solução da amostra para que a mistura reagente LAL mais amostra caia na faixa
de pH de 6 a 8. O pH pode ser justado usando um tampão adequado recomendado pelo fornecedor.
Ácidos e bases podem ser preparados com água grau reagente LAL e ser validados para serem
livres de endotoxinas e fatores de interferentes.
DETERMINAÇÃO DA MÁXIMA DILUIÇÃO VALIDA (MDV)
A máxima diluição válida é a máxima diluição permitida da amostra em análise onde o limite de
endotoxina pode ser determinado.
Ela se aplica para injeções ou soluções de administração parenteral na forma reconstituída ou
diluída para administração, quantidade de fármaco por peso, se o volume da forma da dosagem
for variável.
TÉCNICA DE COAGULAÇÃO EM GEL
A técnica da coagulação em gel permite a detecção e quantificação de endotoxinas baseada na
reação de gelificação do reagente LAL. A sensibilidade do LAL rotulada é a concentração de
endotoxina necessária para causar uma gelificação do reagente LAL
Para garantir a precisão e validade do teste são necessários testes para confirmar a sensibilidade
do LAL rotulada assim como testes para verificação de fatores interferente, como descrito na
preparação da amostra para o teste.

➔ Teste para confirmação de sensibilidade do LAL

Confirmar a sensibilidade declarada do LAL usando no mínimo 01 frasco de reagente LAL e
preparar uma série de diluições de endotoxina usando o padrão de Endotoxina de referência (RSE)
ou o padrão de Endotoxina (CSE), com razão geométrica igual a 2 para obter as concentrações de
0,25 λ, 0,5 λ, λ e 2 λs, onde λ é a sensibilidade declarada do LAL em UE/mL.
Executar o teste com as quatro concentrações do padrão de endotoxina em quadruplicata e incluir
controles negativos (água + LAL → não forma gel). A média geométrica da concentração do
ponto final cujo cálculo e interpretação encontram-se a seguir deve ser maior ou igual a 0,5 λ e
menor ou igual a 2 λ. A confirmação da sensibilidade do LAL deve ser realizada para cada novo
lote de LAL.
➔ Testes de interferências no método coagulação em gel (Inibição/Potencialização)
Realizar o teste em alíquotas da
amostra na qual não há endotoxina
detectável e em diluições que não
exceda o MDV (máxima diluição
válida).
Executar o teste, como no
procedimento do teste, na amostra
sem adição de endotoxina (solução
A) e na amostra com endotoxina
adicionada (solução B), nas
concentrações de ¼ λ, ½ λ, 1 λ e 2
λ, em quadruplicatas, e testando também em paralelo as mesmas concentrações de endotoxina
em água (solução C) e controle negativo em água grau reagente LAL (solução D) em
duplicata.
O teste é válido para a amostra sob análise se a média geométrica desta concentração for
maior ou igual a 0,5 λ e menor ou igual a 2 λ → solução B
 Se o resultado obtido nas amostras nas quais foram adicionadas endotoxina estiver fora do
limite especificado, o teste de inibição ou potencialização de endotoxina deverá ser repetido
após neutralização, inativação ou remoção das substancias interferentes ou após a diluição da
amostra por fator que não exceda a MDV. Repetir o teste numa diluição maior não excedendo
a MDV ou usar um LAL de sensibilidade maior para que a interferência possa ser eliminada
na amostra analisada. Interferências podem ser eliminadas por um tratamento adequado como
filtração, neutralização, diálise ou aquecimento.

➔ Coagulação em gel - Teste Limite

Este teste é usado quando a monografia contém requerimentos para limite de endotoxina.

Procedimento: realize os testes em

duplicatas com as soluções A, B, C,
D como se segue. Prepare solução
de amostra diluída sem adição de
endotoxina (solução A); com adição
de endotoxina (controle positivo do
produto) a 2 λ (solução B); água
grau reagente LAL com adição de
endotoxina a 2 λ (solução C) e água
grau reagente LAL sem adição de endotoxina (solução D - controle negativo). A diluição da
solução A e B não deve ultrapassar o MDV.
Interpretação: o teste somente será valido se as réplicas dos controles positivos das soluções B
e C formarem gel, e a réplicas dos controles negativos das soluções A e C não formarem gel.
Resultados contrários, não serão válidos e deverão ser repetidos.
Ensaio do teste pela coagulação em gel
Misture um volume (ex. 100 µL) de LAL
com igual volume das soluções acima,
amostra, padrões, e controle negativo do
teste em tubos de ensaio 10 x 75mm, em
duplicatas. Incubar os tubos por 1 hora a
37 ºC ± 1 ºC, evitando vibrações.
Após este período retire os tubos um a
um, virando a 180 graus e verificando a integridade do gel; se o gel permanecer firme após a
inversão dos tubos considere o resultado como positivo, e se não houver formação de gel ou
o mesmo não se apresentar firme considere como negativo.
O teste somente será válido se as seguintes condições forem obedecidas: se ambas as réplicas
do controle negativo (D) apresentarem reações negativas; se ambas as réplicas do controle
positivo do produto (B) apresentarem reações positivas; se a média geométrica da solução C
estiver dentro da faixa de 0,5 λ a 2 λ. Para calcular a concentração de endotoxina da solução
A, calcule a concentração do ponto final de cada réplica da serie de diluições, multiplicando
cada fator de diluição do ponto final pela sensibilidade rotulada do reagente LAL (λ).
A concentração de endotoxina na solução teste é a média geométrica da concentração do
limite das replicas. Se o teste é realizado na amostra diluída, determine a concentração de
endotoxina na solução original multiplicando o resultado pelo fator de diluição da amostra.
Se nenhuma das diluições da amostra teste for positiva, expresse o resultado da concentração
de endotoxina como menor que a sensibilidade do LAL (λ) ou menor do que a sensibilidade
do LAL multiplicado pelo menor fator de diluição da amostra.
Se todas as diluições da amostra apresentarem reações positivas, a concentração de
endotoxina é expressa como igual ou maior que λ multiplicado pelo mais alto fator de diluição
da amostra. A amostra encontra os requerimentos do teste se a concentração de endotoxina
for menor do que o limite individual especificado na monografia.
TÉCNICAS FOTOMÉTRICAS
Os métodos fotométricos quantitativos incluem:
A. Método cinético turbidimétrico: baseado no desenvolvimento de turbidez após quebra de
um substrato endógeno.
B. Método cinético cromogênico: baseado no desenvolvimento de cor após quebra de um
complexo peptídeo sintético cromógeno.
C. Método cromogênico limite (endpoint).
D. método turbidimétrico limite (endpoint).
Técnica turbidimétrica: baseia-se na medida de aumento de turbidez. O teste é realizado numa
temperatura de incubação recomendada de 37 ºC ± 1 ºC. Dependendo do principio
empregado, pode ser classificado em 2 tipos:
A. Limite Turbidimétrico: baseado na relação entre a concentração de endotoxina e a turbidez
(absorvância ou transmissão) da reação
B. Cinético Turbidimétrico: método baseado no tempo de reação (onset time) necessário para
a mistura de a reação atingir uma absorvância pré-determinada ou na relação de
desenvolvimento de turbidez.
Técnica cromogênica: é baseada na medida de um cromóforo liberado por um peptídeo
cromogênico pela reação da endotoxina com o lisado. O teste é realizado numa temperatura
de incubação recomendada de 37 ±1 ºC. Dependendo do principio empregado pode ser
classificado em dois tipos:
A. Teste cromogênico limite: é baseado na relação entre a concentração de endotoxina e a
quantidade do cromóforo liberado no final de um período de incubação.
B. Teste cinético cromogênico: baseado na medida do tempo de reação (onset time)
necessário para a mistura de a reação atingir uma pré-determinada absorvância ou na
velocidade de desenvolvimento de cor.
Preparação do teste
Para assegurar a precisão e validade dos testes turbidimétricos e cromogênicos, testes
preparatórios são realizados para assegurar os critérios para a curva padrão são satisfatórios
e a amostra em teste não interfere com o teste. A validação do método é requerida quando
qualquer mudança nas condições experimentais é realizada e pode interferir no teste.
Critérios para a curva padrão
Prepare uma curva padrão utilizando três concentrações de endotoxina, usando uma solução
preparada de padrão de endotoxina, e realize o teste, no mínimo em triplicata de cada
concentração, como recomendado pelo fornecedor do LAL (relação de volume, tempo de
incubação, temperatura e pH,etc.) Se for desejado uma faixa maior que 2 logs, uma
concentração padrão deverá ser adicionada para aumentar a faixa da curva padrão. O valor
absoluto de correlação linear R deverá ser maior ou igual a 0,980 para a faixa. De
concentração de endotoxina indicada pelo fornecedor de LAL.
➔ Teste para fatores de interferência para as técnicas fotométricas
Prepare soluções de amostra diluída
sem exceder a MDV (máxima diluição
válida) sem endotoxina (solução A) e
com endotoxina adicionada (solução
B) na concentração igual ou próxima
do ponto médio da curva padrão.
Prepare também uma série de controle
positivo com soluções de endotoxina
(solução C) com três concentrações
diferentes, e também o controle
negativo com água apirogênica (solução D) e realizar os testes adicionando reagente LAL, no
mínimo em duplicata (siga as orientações do reagente utilizado com relação ao volume de
amostra e do reagente, tempo de incubação), o ponto mais baixo da curva é considerado λ.
Calcule a média de recuperação da endotoxina adicionada à amostra subtraindo-se a média
da concentração de endotoxina na solução teste (solução A) (se houver) da média da solução
cuja endotoxina foi adicionada (solução B).
A solução teste é considerada livre de interferentes se a medida da concentração de
endotoxina adicionada á solução teste (solução B) estiver na faixa de 50 a 200% de
recuperação, após subtração de qualquer endotoxina detectada na solução sem adição de
endotoxina. Quando a recuperação de endotoxina estiver na faixa de especificação, fatores
interferentes devem ser removidos conforme descritos na seção da técnica de coagulação em
gel.
Procedimento: siga os procedimentos descritos acima nos itens Preparação para o teste e
Testes para fatores interferentes
Cálculos para técnicas fotométricas
Calcule a concentração de endotoxina para cada replicata da solução A, usando a curva padrão
gerada pela série de controle positivo solução C.
O teste somente é válido se os três requisitos abaixo forem encontrados:
✓ O resultado obtido da solução D (controle negativo) não exceda o limite do valor do
branco requerido na descrição do lisado empregado;
 ✓ O resultado obtido com a série de controle positivo, solução C, estiver de acordo com
os requerimentos para validação definidos nos critérios para curva padrão;
✓ A recuperação de endotoxina, calculada a partir da endotoxina encontrada na solução
B após subtração da concentração de endotoxina encontrada na solução A estiver
dentro da faixa de 50 a 200%.
Interpretação dos resultados em ensaios fotométricos
A solução de amostra a ser examinada estará de acordo com o teste se a média da concentração
de endotoxina encontrada nas replicatas (solução A), após correção para diluição e
concentração for menor que o limite de endotoxina do produto testado.