UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS

CURSO: ENGENHARIA QUÍMICA
DISCIPLINA: BIOQUÍMICA DE ALIMENTOS
DOCENTE: PROF. DRª. ALEXANDRA MARTINS DOS SANTOS SOARES
DISCENTE: RODRIGO PEREIRA VIEIRA
NÚMERO DE MATRÍCULA: 2014005307

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA PEROXIDASE

SÃO LUÍS – MA
2017
 1. INTRODUÇÃO

Enzimas são catalisadores biológicos altamente específicos, em geral de natureza

protéica, responsáveis por garantir que reações químicas indispensáveis à conservação e
à reprodução dos seres vivos aconteçam a velocidades adequadas, por meio da redução
da energia de ativação necessária à ocorrência dessas reações. As enzimas são sintetizadas
nas próprias células em que devem atuar, apresentam concentrações variáveis (que
dependem das condições fisiológicas) e podem ter suas atividades reguladas, o que
permite que o metabolismo de um ser vivo se altere em função das condições ambientais
em que está inserido.
A dosagem de enzimas é feita a partir da medida de sua atividade (ou seja, da
velocidade da reação que a enzima catalisa) em Unidades Internacionais (U). A
especificidade das enzimas permite que medidas desse tipo sejam realizadas mesmo na
presença de outras proteínas. Uma Unidade Internacional corresponde à quantidade de
enzima capaz de formar 1 μmol de produto por minuto em condições de medida
especificadas para cada caso. A atividade específica consiste no número de Unidades em
enzima por miligrama de conteúdo protéico total; trata-se de uma grandeza importante
quando a proteína de interesse não está presente isoladamente no material trabalhado.
A atividade enzimática pode ser afetada por fatores que possam provocar
mudanças conformacionais na estrutura protéica, pois a ação catalítica de determinada
enzima depende da manutenção de sua estrutura tridimensional característica. Dessa
forma, fatores como pH e temperatura podem alterar a atividade enzimática. O aumento
da temperatura, até certo ponto, aumenta a velocidade da reação catalisada pela enzima
devido ao aumento da energia cinética das moléculas componentes do sistema e,
consequentemente, ao aumento da possibilidade de choques efetivos entre elas;
entretanto, a partir de determinado valor, a elevação da temperatura acarreta alteração das
ligações químicas que são responsáveis pela estrutura tridimensional da enzima e provoca
a sua desnaturação, ou seja, à perda de sua estrutura nativa e, consequentemente, da sua
atividade catalítica.
O pH também influencia a atividade enzimática, porque grupos dissociáveis de
diversos aminoácidos se apresentam em formas protonadas ou não protonadas de acordo
com a concentração de íons hidrogênio do meio. Dessa forma, as enzimas apresentam
valores ótimos de pH (que otimizam a sua atividade), enquanto valores extremos de pH
podem fazer com que a sua estrutura se altere e deixe de apresentar ação catalítica.
A enzima analisada no experimento realizado é denominada peroxidase, presente
nos vegetais, que apresenta as funções de proteger os tecidos desses organismos contra a
ação tóxica do peróxido formado durante o seu metabolismo vegetal e de degradar ácidos
graxos insaturados através dos radicais livres gerados pela ação enzimática. Essa enzima
catalisa a reação entre guaiacol e peróxido de hidrogênio, que produz tetraguaiacol e água.
O tetraguaiacol é um produto colorido; portanto, a velocidade dessa reação pode ser
medida por meio de espectrofotometria, pois a intensidade da coloração observada é
diretamente proporcional à concentração do tetraguaiacol formado.

2
 2. OBJETIVOS

O experimento realizado visou determinar a atividade da enzima peroxidase em

uma amostra de material de origem vegetal e avaliar o efeito do aumento de temperatura
e da presença de ácido cítrico sobre a atividade dessa enzima.

3. MATERIAIS E REAGENTES

Os materiais utilizados na prática foram tubos de ensaio, micropipetas, ponteiras,

estantes, cubetas, espectrofotômetro, placas de Petri, maçãs, pipetas, micro-ondas, limões
e cronômetro.
Os reagentes empregados foram guaiacol a 10%, peróxido de hidrogênio a 30%,
tampão fosfato de potássio 75 mM, água destilada, peróxido de hidrogênio a 112,5 mM,
guaiacol e uma amostra de material de origem vegetal que continha peroxidase.

4. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Na primeira etapa do experimento, foram adicionados ao tubo de ensaio, com o

auxílio das micropipetas: 180 μl do tampão fosfato de potássio e 500 μl de solução
reacional (que consistia em partes iguais de guaiacol e peróxido de hidrogênio). A solução
resultante foi transferida para a cubeta e colocada no espectrofotômetro. A contagem do
tempo no cronômetro se iniciou no momento em que 20 μl da amostra que continha
peroxidase foram adicionados e a cubeta.
O valor da absorbância foi registrado a cada 10 segundos; a tabela correspondente
foi montada, e o gráfico correspondente foi construído com o auxílio do Microsoft Excel
2016. O comprimento de onda utilizado na espectrofotometria foi de 480 nm. O
procedimento foi realizado em duplicata.
Na segunda etapa do experimento, foram cortadas quatro fatias das maçãs, que
foram organizadas em dois pares. Cada um dos pares era composto por um teste e um
controle. Um dos testes foi colocado em contato com sumo de limão, e o outro foi
colocado em micro-ondas por 20 segundos.
Guaiacol e peróxido de hidrogênio foram adicionados às fatias de teste de
controle, e a diferença no comportamento do escurecimento desses materiais foi
observada e analisada.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados obtidos na primeira etapa se encontram dispostos na Tabela 1 e na

Figura 1.

3
 Tabela 1 – Absorbância e variação de absorbância em função do tempo
decorrido
Tempo (s) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Absorbância 0,02 0,027 0,034 0,041 0,049 0,056 0,064 0,071 0,079 0,086 0,093 0,101
1
Variação de 0,007 0,014 0,021 0,029 0,036 0,044 0,051 0,059 0,066 0,073 0,081
absorbância
1

Absorbância 0,019 0,028 0,036 0,044 0,053 0,061 0,07 0,08 0,089 0,098 0,106 0,115
2
Variação de 0,009 0,017 0,025 0,034 0,042 0,051 0,061 0,07 0,079 0,087 0,096
absorbância
2

Absorbância x Tempo (s)

0.12
y = 0.0009x
0.1 R² = 0.9992

0.08

0.06
y = 0.0007x
0.04 R² = 0.9996

0.02

0
0 20 40 60 80 100 120

Delta Abs 1 Delta Abs 2

Linear (Delta Abs 1) Linear (Delta Abs 2)

Figura 1 – Ajuste linear da correlação entre variação de absorbância e tempo

decorrido

O coeficiente angular de cada reta fornece a variação de absorbância por segundo

para 20 μl de amostra; portanto, a variação obtida foi de aproximadamente 0,0007 𝑠 −1
no primeiro procedimento e de aproximadamente 0,0009 𝑠 −1 no segundo procedimento.
Como esse resultado deve ser calculado para um tempo 60 vezes maior (1 minuto) e um
volume 50 vezes maior (1 ml), ele deve ser multiplicado por 3000. Dessa forma, obtém-
se a atividade enzimática em U/ml. Para que se obtenha a atividade específica da enzima,
esse resultado deve ser dividido pelo seguinte fator: 1,23 mg de proteína por ml. Após
esse procedimento, obtém-se o resultado da atividade enzimática em U/mg de proteína.
A aplicação desses fatores de conversão fornece os seguintes resultados:
𝑈 𝑈
Para o primeiro procedimento: 𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 ≅ 2,100 𝑚𝑙 ≅ 1,707 𝑚𝑔𝑃

4
 𝑈 𝑈
Para o segundo procedimento: 𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 ≅ 2,700 𝑚𝑙 ≅ 2,195 𝑚𝑔𝑃

O segundo resultado apresenta maior exatidão porque houve maior cautela na

realização dos procedimentos experimentais, a fim de minimizar erros experimentais que
ocorreram anteriormente, como perdas de substrato nas micropipetas e atrasos na
contagem do tempo no cronômetro.
Na segunda etapa, o escurecimento (relacionado à conversão do guaiacol em
tetraguaiacol) foi significativamente mais lento nas fatias de teste em ambos os casos.
Essa diferença se deve à desnaturação da enzima pela temperatura alta, no caso da fatia
que foi submetida ao aquecimento no micro-ondas; na fatia que se encontrava em contato
com sumo de limão, o retardo no escurecimento se deve à ação redutora do ácido cítrico,
que converte o tetraguaiacol em guaiacol, o que diminui a intensidade da coloração
observada.

6. CONCLUSÃO

A partir dos procedimentos realizados e dos resultados obtidos, verifica-se que o

valor obtido para a atividade da peroxidase quando o experimento foi realizado pela
segunda vez apresenta maior exatidão, pois houve maior cautela com alguns fatores que
provocaram erros experimentais anteriormente. Portanto, o valor de 2,195 U/mg de
proteína é mais próximo da atividade real da enzima nas condições em que o experimento
foi realizado. As alterações da velocidade do escurecimento do material em decorrência
da alteração de temperatura e da adição de sumo de limão ocorreram de acordo com as
previsões teóricas: houve redução da velocidade da mudança de coloração em ambos os
casos. No primeiro caso, esse fato pode ser atribuído à perda de atividade da enzima
peroxidase devido à sua desnaturação; no segundo caso, essa alteração pode ser atribuída
à ação redutora do ácido cítrico, que converte o tetraguaiacol em guaiacol.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 BORZANI, W. et al. Biotecnologia industrial, volume 1: fundamentos. São

Paulo: Blucher, 2001.
 CLERICI, M. T. P. S.; CLARETO, S. S.; MORAES, A. L. L.; OLIVEIRA, L.
C.; SANTOS, M. S. dos; SEBASTIÃO, R. H. (2014) Escurecimento enzimático:
uma aula prática. Revista de Ensino de Bioquímica, 12 (2).