SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOTECNOLOGIA

Determinação da cinética de biotransformação do guaiacol pela enzima

peroxidase contida no rabanete (Raphanus sativus L.) por meio da técnica
espectrofotométrica.

Andre da Luz de Freitas (201674440017)

Luís Eduardo de Oliveira Teixeira (201674440023)
Patrícia Oliveira Santos (201674440019)

Campus Belém — Maio de 2018

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 SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOTECNOLOGIA

Determinação da cinética de biotransformação do guaiacol pela enzima

peroxidase contida no rabanete (Raphanus sativus L.) por meio da técnica
espectrofotométrica.

Relatório apresentado como parte dos

critérios de avaliação da Atividade
Curricular EB01031 - Biotransformação
de Compostos Orgânicos em Escala.
Turma de Engenharia de Bioprocessos.
Dia de execução do experimento:
18/04/2018.
Professor: Dr. Antônio S C Carvalho.

Campus Belém — Maio de 2018

2
 RESUMO

Foi realizado um gráfico de cinética de atividade da enzima peroxidase

presente no extrato bruto de rabanete (Raphanus sativus L.) utilizando-se o guaiacol
como substrato. O guaiacol reage com o peróxido de hidrogênio na presença da
peroxidase formando o tetraguaiacol de coloração alaranjada. Nesta reação, o
peróxido de hidrogênio é reduzido e o guaiacol, oxidado, atua como doador de
prótons.

Palavras-chaves: Rabanete. Peroxidase. biotransformação do guaiacol em

tetraguaiacol.

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 SUMÁRIO

INTRODUÇÃO.............................................................................................................4
1. REFERENCIAL TEÓRICO....................................................................................6
1.1 RABANETE............................................................................................................6
1.2 ENZIMA PEROXIDASE..........................................................................................6
1.3 GUAIACOL.............................................................................................................7
2.. OBJETIVOS............................................................................................................7
2.1 OBJETIVO GERAL.................................................................................................7
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..................................................................................7
3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL.........................................................................8
3.1 REAGENTES E MATERIAIS.................................................................................8
3.1.1 Reagentes..........................................................................................................8
3.1.2 Materiais.............................................................................................................8
3.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL.....................................................................8
3.2.1 Tampão citrato-fosfato ph 5.............................................................................8
3.2.2 Solução de Guaiacol (10mM)............................................................................9
3.2.3 Solução do caldo enzimático...........................................................................9
3.2.4 Solução de Peróxido de Hidrogênio (10mM)..................................................9
3.3 ANÁLISES..............................................................................................................9
3.3.1 Obtenção do extrato enzimático......................................................................9
3.3.2 Determinação da atividade enzimática..............................................................10
3.4 VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA....................................................10
3.4.1 Especificidade.................................................................................................10
3.4.2 Linearidade.....................................................................................................10
3.4.3 Limites de detecção (LD) e quantificação (LQ)............................................10
3.4.4 Precisão...........................................................................................................10
3.4.5 Exatidão...........................................................................................................10
3.4.6 Robustez..........................................................................................................10
4. RESULTADOS.......................................................................................................11
5. DISCUSSÃO..........................................................................................................14
CONCLUSÃO............................................................................................................17
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................18
APÊNDICE................................................................................................................19

4
INTRODUÇÃO

O Brasil possui uma grande variedade de frutas e vegetais, sendo que a

maioria é de baixo custo e facilmente encontrada em todo o território nacional. Essas
frutas e vegetais são fontes inesgotáveis de enzimas que podem ser utilizadas in
natura ou como extrato bruto, obtido por procedimentos simples de extração.
(ZERAIK et al., 2008).
As peroxidases se destacam no cenário biotecnológico, por serem encontradas
em diversas fontes na natureza, não dependerem de co-fatores e atuarem sobre um
amplo número de substratos. Elas se incluem em um grupo de enzimas (E.C.
1.11.1.7) capazes de catalisar a transferência do hidrogênio de um doador para
H202. Em plantas, a ação constitui numa proteção antioxidativa. (Egley et al., 1983;
van Huystee, 1987; Gaspar et al. (1985).
Diversas são as fontes vegetais de peroxidase, como pêssego (Prunus
persica), inhame (Alocasia macrorhiza), mandioca (Manihot utilissima), alcachofra
(Cynara scolymus L.), batata doce (Ipomoea batatas (L.) Lam.), nabo (Brassica
campestre ssp. rapifera), rabanete (Armoracia rusticana), abobrinha (Cucurbita
pepo) e outras. (ZERAIK et al., 2008).Uma das reações mais conhecidas é a
desidrogenação oxidativa onde a enzima atua como catalisador. Um exemplo típico
é a oxidação do guaiacol, via radicalar, comumente utilizada no monitoramento da
atividade de peroxidases vegetais (DOERGE et al., 1997).
Assim, o objetivo desse relatório é demonstrar experimentalmente como
acontece a cinética da biotransformação do guaiacol por meio da enzima peroxidase
contida no rabanete, utilizando a técnica de espectrofotometria, possibilitando a
criação de uma curva de tendência relacionada à absorbância relativa a atividade
das enzimas envolvidas na resposta antioxidativa com o tempo.

5
 1. REFERENCIAL TEÓRICO
1.1 RABANETE

Rabanete é um vegetal apreciado há tempos na culinária mundial. Prova disso

é que os gregos e romanos o consumiam com mel e vinagre e que ele é
mencionado em livros chineses que datam de 2.700 a.C. O rabanete (Raphanus
sativus L.) é, entre as hortaliças, a de menor ciclo, pois, a colheita inicia-se 20 - 25
dias após a semeadura, prolongando-se por 10 dias. É intolerante ao transplante e,
portanto, a semeadura é feita diretamente no local definitivo. Pode ser cultivado
praticamente o ano todo, e é indicado como cultura intercalar junto a outras plantas
de crescimento mais lento. Como salada, é um importante complemento na nossa
alimentação. Além da boa palatabilidade, ele possui um alto valor nutritivo, pois,
segundo CRAWFORD (1966) e FRANCO (1960), quando comparado com outras
hortaliças, ele possui razoável quantidade de carboidratos, bom teor de cálcio, ferro
e fósforo, bom teor de ácido ascórbico e razoável teor de tiamina, riboflavina e
niacina. Além disso, o rabanete é fonte de altas concentrações de enzimas
peroxidases (POD).

1.2 ENZIMA PEROXIDASE

As peroxidases se destacam no cenário biotecnológico, por serem

encontradas em diversas fontes na natureza, não dependerem de co-fatores e
atuarem sobre um amplo número de substratos. (MOHAMED et al.,2011). O grupo
das peroxidases (POD) inclui enzimas (EC 1.11.1.7) capazes de catalisar a
transferência do hidrogênio de um doador para o H202. Em plantas, a ação desse
grupo de enzimas constitui uma proteção antioxidativa. A atividade da peroxidase
pode aumentar em plantas submetidas a diversos tipos de estresse (Siegel, 1993).

Podem ser consideradas enzimas bifuncionais, pois catalisam a oxidação de

uma ampla variedade de compostos por meio de peróxido de hidrogênio, mas
também produzem espécie reativa de oxigênio (MOHAMED et al.,2011). Existe um
grande interesse por esta enzima, devido as suas múltiplas aplicações em
laboratórios de pesquisa, como por exemplo, na construção de biossensores, na

6
indústria de papel e celulose, de alimentos, em análises bioquímicas, entre outras.
(ZERAIK et al., 2008).

1.3 GUAIACOL

Guaiacol ou gaiacol é um composto orgânico de ocorrência natural com a

fórmula C6H4(OH) (OCH3). Esta substância oleosa, incolor e aromático é derivada
do guaco ou do creosoto da madeira, especialmente da faia. É produzido
industrialmente da pirocatequina por metilação com potassa e sulfato de metila e
potássio, ou do anisol por nitração, redução do orto-nitroanisol resultante a 2-
aminoanisol, o qual é então diazotado e fervido com água.

Em laboratório é sintetizado pela di-metilação do catecol seguido por mono-

demetilação seletiva.

C6H4(OH)2 + 2 (CH3O)2SO2 → C6H4(OCH3)2 + 2 HO(CH3O)SO2

C6H4(OCH3)2 + C2H5SNa → C6H4(OCH3)(OH)
Por causa de sua natural habilidade em mudar de cor, é algumas vezes
usado como indicador em vários experimentos envolvendo enzimas.

2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL

Determinar a cinética da biotransformação do guaiacol pela enzima peroxidase

contida no rabanete por meio da técnica espectrofotométrica.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

a) Obtenção da concentração de peroxidase necessária para que a

biotransformação aconteça.

b) Realizar um estudo cinético da biotransformação do guaiacol por meio da técnica

espectrofotométrica em função do tempo.

7
c) Analisar os dados de cinética estatisticamente e graficamente.

3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
3.1 REAGENTES E MATERIAIS

3.1.1 Reagentes
- Tampão Citrato-Fosfato PH5
- Solução de Guaiacol (10mM)
- Solução de concentrado enzimático (10mM)
- Solução de peróxido -H2O2-(10mM)

3.1.2 Materiais

- Becker
- Balão volumétrico
- Cubetas para Spectro
- Rabanete fresco
- 0,4 g de Fosfato de Sódio dibásico
- 1,75 g de Ácido cítrico monohidratado
- Concentrado de peróxido(H2O2)
- Concentrado de Guaiacol
- Micropipetas
- Balança semi-analítica
- Espectrofotômetro
- Liquidificador
-PHmetro

3.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

3.2.1 Tampão Citrato-Fosfato PH 5

Utilizando-se de uma balança semi-analítica, pesou-se 0,4 g de Fosfato de

Sódio dibásico em um becker e o dissolveu com água destilada. Posteriormente a
solução foi repassada para um balão volumétrico de 250 ml e aferido em seguida.
8
(Solução A).Em seguida, o procedimento acima foi repetido para 1,75 g de Ácido
cítrico monohidratado(Solução B).

Com o auxílio de um becker de 1L e de um phmetro, adicionou-se

aproximadamente 200 ml da solução A e cerca de 20 ml da Solução B(foram feita
proporções entre as soluções até chegar ao PH 5).

3.2.2 Solução de Guaiacol (10mM)

Inicialmente foram feitos cálculos de molaridade, pois queríamos uma solução

de Guaiacol de 10mM. Em seguida, em um balão volumétrico de 50 ml, adicionou-se
56 microlitros do concentrado de Guaiacol e completou\aferiu com água destilada.

3.2.3 Solução do caldo enzimático

Pesou-se 100 g do rabanete fresco já cortado e adicionou dentro de um

liquidificador junto com 150 ml do tampão Citrato-Fosfato. Ao final da trituração, com
o auxílio de um papel filtro e um becker, filtramos o caldo e despejamos os resíduos
no lixo.

3.2.4 Solução de Peróxido de Hidrogênio (10mM)

Inicialmente foram feitos cálculos de molaridade, pois queríamos uma solução

de H2O2 de 10mM. Em seguida, em um balão volumétrico de 50 ml, adicionou-se 34
microlitros do concentrado de peróxido e completou\aferiu com água destilada.

3.3 ANÁLISES

3.3.1 Obtenção do extrato enzimático

O extrato vegetal contendo peroxidase foi obtido segundo o método descrito

por Fatibello-Filho et al.,26 com modificações. Após lavagem com água corrente,
100g de rabanete foram picados e homogeneizados em liquidificador com 150 ml de
uma solução de tampão citrato-fosfato pH 5. Em seguida, o homogêneo foi filtrado

9
através de algodão e centrifugado por 15 minutos a 15000 rpm. A solução
sobrenadante foi armazenada em refrigerador e utilizada no procedimento analítico.

3.3.2 Determinação da atividade enzimática

A atividade da peroxidase foi determinada medindo-se a variação da

absorbância durante a reação de oxidação do guaiacol. Em uma cubeta foram
adicionados 2,2 ml de solução tampão fosfato, 0,5 ml de guaiacol (10mM) e 0,1 ml
de peróxido de hidrogênio (10mM). Após a homogeneização dessa solução e a
obtenção do branco no espectrofotômetro, adicionaram-se 100 µL de extrato
enzimático do rabanete (armazenada em 4 °C para não degradação da enzima).
Posteriormente a solução foi incubada a 25 °C por 4 minutos e a leitura da
absorbância foi realizada em 470 nm.

3.4 VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA

O método foi validado conforme preconizado na Resolução RE nº 899 de

29/5/2003 (Anvisa) e de acordo com as recomendações da ICH (The International
Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human Use).34,35 As figuras de mérito avaliadas foram
especificidade, linearidade, limites de quantificação (LQ) e detecção (LD), precisão,
exatidão e robustez.

3.4.1 Especificidade

A especificidade do método, definida como a capacidade de um método

analítico em medir exatamente um analito na presença de outros componentes da
matriz, foi avaliada através de análises espectrofotométricas.

3.4.2 Linearidade

A linearidade do método foi determinada através da obtenção da curva de

tendência da cinética enzimática com concentrações diferentes pontos de
10
absorvãmncia. A equação da reta foi determinada através da regressão linear pelo
método dos mínimos quadrados.

3.4.3 Limites de detecção (LD) e quantificação (LQ)

Os valores de LD e LQ foram calculados matematicamente através das curvas

de calibração, utilizando os valores de desvio padrão da resposta (σ) e coeficiente
angular (s), segundo as Equações 1 e 2:

LD = 3* σ /s (1)

LQ = 10* σ / s (2)

3.4.4 Precisão

A precisão (repetibilidade) foi avaliada através da análise das mesmas

soluções/amostra com diferentes pontos de absorbância em um mesmo dia e pelo
mesmo analista. Foram feitas várias absorbâncias da mesma amostra em cubetas
no equipamento.

3.4.5 Exatidão

A exatidão do método foi determinada através do ensaio de adição de

soluções padrão de guaiacol (10mM).

3.4.6 Robustez

A robustez do método proposto foi determinada por meio da análise de

soluções amostra (400 μg mL-1) em três diferentes valores de pH (6,2, 6,4 e 6,6).

4. RESULTADOS
Os resultados de cinética com o extrato bruto do rabanete contendo peroxidase
e diferentes substratos estão descritos na literatura. Pode-se observar que na a
atividade enzimática de um extrato pode variar com a fonte vegetal, a natureza do
substrato e as condições experimentais (pH e temperatura) do ensaio. Neste
trabalho, foi escolhido apenas uma fonte de peroxidase (rabanete). A atividade
11
enzimática do extrato (Tabela 1) foi avaliada utilizando-se uma solução de guaiacol
(10mM). Uma unidade de atividade (unidade mL-1) é definida como a quantidade de
enzima capaz de gerar um aumento de 0,001 unidades de absorbância por minuto.
Em comparação com outros trabalhos, o extrato de rabanete realmente apresenta
uma maior atividade enzimática.

Para o cálculo da atividade enzimática, U mL-1, foi empregada a Equação 1.

sendo: U mL-1 = unidade de atividade da peroxidase por mL; A = absorbância; Î =

absortividade molar do tetraguaiacol (26.600 L mol-1 cm-1); Ve = volume da solução
de enzima utilizada no ensaio (mL); t = tempo de reação em min e FD = fator de
diluição (diluição do extrato bruto enzimático).

Durante a reação notamos a presença da cor alaranjada (figura 1):

Fonte: turma Eng. Bioprocessos 2016

Figura 1: Reação da enzima peroxidase na biotransformação do Guaiacol

12
Figura 2: Curva da cinética enzimática da peroxidade em pontos de absorbância em
função do tempo.

Utilizando-se de softwares estatísticos, a curva de cinética da

biotrasnformação do guiacol em tetraguaiacol (figura 2) apresentou um
comportamento de uma função de terceiro grau, com um desvio padrão entre os
pontos do experimento de 0.2 aproximadamente. Em termos cinético, notamos uma
semelhança da curva obtida experimentalmente com a curva de cinética enzimática
de Michaelis-Menten. No qual, temos a relação entre a velocidade enzimática em
função do tempo tendo apenas um tipo de substrato específico (guaiacol).
Inicialmente observamos que a atividade da enzima aumenta consideravelmente, já
que no meio tem todos os fatores que propicie sua catalisação. Ao passar do tempo,
a enzima chega em sua velocidade máxima e posteriormente estabiliza por um certo
período de tempo. Nos últimos pontos do experimento, a atividade enzimática
diminui devido a mesma está saturada ou talvez exista a presença de algum tipo de
inibidor catalítico.

13
 5. DISCUSSÃO
Como discutido na parte introdutória, o guaiacol reage com o peróxido de
hidrogênio na presença da peroxidase formando o tetraguaiacol de coloração
alaranjada (Figuras 1, 3). Nesta reação, o peróxido de hidrogênio é reduzido e o
guaiacol, oxidado, atua como doador de prótons.

Alguns cuidados devem ser tomados quando for empregada esta técnica para
análise da peroxidase, uma vez que o desenvolvimento da cor alaranjada indicativa
da presença de peroxidase ocorre em um intervalo tempo de 3 a 4 min, sendo que a
intensidade de cor diminui gradativamente após esse tempo reacional. PEREIRA
(2015), fez um estudo sobre atividade da peroxidase do extrato de rabanete por um
período de 60 dias, estabelecendo ligações com os volumes de H2O2 no meio, pois
tem sido evidenciado que a oxidação de compostos fenólicos catalisada pela enzima
peroxidase depende da concentração de H2O2, com ocorrência de inativação da
enzima na presença de excesso do reagente.

14
 Os estudos dos efeitos da concentração e do volume da solução de H2O2
foram realizados mantendo-se constante o volume da solução do extrato de
rabanete (1 mL). Da mesma forma, nas avaliações dos efeitos do volume e da
diluição do extrato foram mantidos fixos o volume (1 mL) e a concentração da
solução de peróxido de hidrogênio (6,0 × 10-2 mol L-1). Os resultados estão
resumidos na Tabela 2. Foram selecionados os parâmetros em que ocorreu a
melhor combinação entre a quantidade de peroxidase e a concentração de H2O2,
resultando na máxima intensidade de absorção em 480 nm.

15
16
CONCLUSÃO
Este trabalho confirma a potencialidade do uso de extrato do rabanete como
fonte de enzimas peroxidases para a biotransformação do guaiacol em tetraguaiacol.
O procedimento de extração da peroxidase do rabanete é muito simples e rápido,
exigindo apenas uma etapa de filtragem antes da utilização como reagente analítico.
É notória, devidos os resultados apresentados, que a peroxidase contida no
rabanete tem um alto potencial de biotrasnformador. No entanto, o tempo de meia
vida da peroxidase contida no rabanete é muito curta, pois em ph 5 á 25 a sua
atividade é extremamente elevada, convertendo os substratos em produto em um
curto período de tempo.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Araujo P. A. D. Obtenção de peroxidasse de rabanete e potencial de aplicação

no tratamento de efluentes Universidade Tiradentes/Engenharia de
Petróleo/Aracaju, SE, 2016.
Bueno N. G. e Pereira A. V. COMPRIMIDOS UTILIZANDO EXTRATO DE
RABANETE COMO FONTE DE PEROXIDASE Quim. Nova, Vol. 38, No. 8, 1107-
1111, 2015
MOHAMED, S.A.; ABULNAJA, K. O.; ADS, A.S.; KHAN, J. A.; KUMOSANI, T.A. cv
Caracterisation of na anionic peroxidase from horseradish. Food Chemistry, v.
128, 725-730, 2011.
LIMA, Natália Bispo. Extração e determinação de atividade da peroxidase do
rabanete em diferentes estágios de crescimento e analise da influencia dos
íons cálcio, cobalto (ii) e cobre (ii) no crescimento in vitro. Seminário de
Iniciação Científica, n. 21, 2017.

DOERGE, D. R.; DIVI, R. L.; CHURCHWELL, M. I. Identification of the Colored

Guaiacol Oxidation Product Produced by Peroxidase, Analytical Biochemistry,
250, p. 10-17, 1997.

HIRATA, T.; IZUMI, S.; OGURA, M.; YAWATA, T. Epoxidation of styrenes with the
peroxidase from the culture cells of Nicotianatabacum, Tetrahedron, 54, p.15993
- 16003, 1998.

ZERAIK, Ana Eliza et al. Desenvolvimento de um spot test para o

monitoramento da atividade da peroxidase em um procedimento de
purificação. 2008.
LIMA et al. Atividade de peroxidases (ec 1.11.1.7) e teor de prolina em feijoeiro
phaseolus vulgaris l. cultivado em condições de salinidade. 2004

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APÊNDICE
ANEXO 01 – GRÁFICO DEMONSTRATIVO DA CINÉTICA ENZIMÁTICA DA
PEROXIDASE

Figura 2 : Curva da cinética enzimática da peroxidade em pontos de absorbância em

função do tempo.

ANEXO 2 – TABELA COM DADOS DE EXPERIMENTO

Tabela 1: Dados do experimento em unidade de absorbância em função do tempo

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