Testes de sensibilidade à

antimicrobianos
 TESTES DE SENSIBILIDADE À
ANTIMICROBIANOS

• Provas de sensibilidade aos antimicrobianos.

• Utilizado para microrganismos cuja

sensibilidade às drogas normalmente não seja
previsível.

• Realizado em um isolado bacteriano de

cultura recente
 Teste de sensibilidade - Métodos

• Kirby-Bauer: Difusão com disco (disco-difusão)

- Antibiograma

• Diluição em caldo

• E-test®

• Automação
 1- Kirby-Bauer: Disco-difusão ou
Antibiograma
• Utilização de discos de papel filtro impregnados com
concentração padrão de antibiótico

• Os discos são colocados na superfície do ágar

Mueller-Hinton semeado com uma suspensão
padronizada da bactéria a ser testada.

• O método informa se a bactéria é resistente,

sensível ou se possui sensibilidade intermediária à
determinado antibiótico pela medição do halo de
inibição
1- Kirby-Bauer: Difusão com disco
1- Kirby-Bauer: Difusão com disco
 Técnica

• Teste indireto: realizado com cultura pura de 24 horas

de crescimento de bactérias devendo ser feito Gram
antes do antibiograma.

• Teste direto: utilização do material pesquisado (urina,

sangue, pus, etc). A desvantagem da utilização direta
destes materiais dá-se pela dificuldade de controle da
quantidade de inócuo e o isolamento da bactéria.
 Técnica

• Com a alça de semeadura, transferir 3 a 4 colônias

(teste indireto) com a mesma morfologia e inocular em
2,0 a 3,0 mL de solução fisiológica estéril, caldo MH ou
caldo TSB.

• Esperar 15 minutos observando a turbidez da

solução.

• Utilizar como referência de turbidez o tubo 0,5 da

escala de McFarland
 Escala de McFarland
• Padrão de turvação utilizado para determinar a
intensidade de multiplicação bacteriana em meios de
culturas líquidos.

• O grau de turvação indica a [ ] das bactérias.

• O método consiste em uma escala de onze tubos 0,5 a

10 com diferentes quantidades de cloreto de bário e
ácido sulfúrico para se obter diferentes concentrações
de sulfato de bário.
Tubo 0,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
n.Bact x 108 1,5 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
- Padronização do inóculo
para Antibiograma, MIC, E-
Test.

- Usar sempre o tubo 0,5 da

escala
 Técnica
• Com um swab estéril, semear a solução no Agar
Mueller-Hinton.

• Aguardar 5 minutos à temperatura ambiente para que o

inócuo seja completamente absorvido pelo ágar.

• Colocar o disco com o auxílio de uma pinça

previamente flambada.
– Os discos devem ter uma distância de 2,5cm
– Máximo de 12 discos em placas de 15 cm e 5 discos em placas
de 9 cm
 Técnica
• Após 15 minutos da colocação dos discos, as
placas são invertidas e incubadas.

• Incubar de 18 a 24 horas à 35 +/- 1º C

• Medir o diâmetro dos halos.

• Classificá-los quanto a resistência,

sensibilidade intermediária e sensibilidade.
Resultado
 Leitura e interpretação

Leitura realizada no fundo da placa com auxílio de uma régua

 Fatores que influenciam o halo de inibição

• Composição do meio de cultura: algumas

substâncias presente no meio de cultura
podem atuar na diminuição do halo de
inibição.

– Timidina ou purinas antagonizam alguns fármacos

• Por este motivo, utiliza-se a padronização do

meio de cultura, utilizando-se para o
antibiograma o meio Mueller Hinton.
 Fatores que influenciam o halo
de inibição
• Inócuo com mais de um microrganismo

• Alteração de pH

• Espessura do meio menos do que 4 mm

– Ágar com menor profundidade aumenta a difusão e o
diâmetro do halo

• Tempo e temperatura de incubação

• Armazenamento inadequado dos discos

• Discos não pressionados no ágar

• Erro na medição do halo

• Densidade do inócuo: quanto maior o inócuo, menor a

sensibilidade e por este motivo é necessária a
utilização de uma padronização.
Difusibilidade do antibiótico: alguns antibióticos tais
como vancomicina e colistina não se difundem
rapidamente a partir do disco no ágar, por esta razão o
diâmetro do halo é extremamente pequeno
 2- Diluição em caldo
• Verificação quantitativa da atividade do antibiótico para
obtenção da concentração inibitória mínima capaz de
inibir o crescimento bacteriano.

• Diluições do antibiótico são incorporadas ao meio de

caldo ou ágar, o qual é inoculado com o organismo em
teste.

• A menor concentração que inibe o crescimento na

incubação de 12 horas é conhecida como CMI
(concentração inibitória mínima)
• Verificação quantitativa da atividade do antibiótico
para obtenção da concentração inibitória mínima
capaz de inibir o crescimento bacteriano.

• Diluições do antibiótico são incorporadas ao meio de

caldo ou ágar, o qual é inoculado com o organismo
em teste.
• Tubos de caldo ou placas de ágar são preparados
com diluições sequenciais com valores expressos em
µg/ml.

• Uma suspensão de bactérias padronizadas são inoculadas

e incubadas

• A leitura é realizada pela turvação do meio que

evidencia o crescimento bacteriano
 RESULTADO
MIC (Concentração inibitória mínima) - dose mínima de antimicrobiano
que, adicionada ao meio de cultura (líquido ou sólido), é capaz de inibir
totalmente o crescimento de um inócuo padrão.
 3- E-TEST®

• Método de quantificação para obtenção da

concentração inibitória mínima (CIM)

• Realizado através de utilização de uma fita (5 cm)

que apresenta concentrações diferentes do
antimicrobiano ao longo da fita.

• Método que combina os princípios de difusão e

diluição
E-TEST®
Evitar o uso de mais de 6 fitas em placas de
15 cm e mais de uma fita em placa de 9 cm.
 4- Automação
Walk Away Plus 96

•Identifica bactérias Gram-Negativas fermentadoras e

não-fermentadoras, Cocos Gram-Positivos e Listeria,
Anaeróbicos, Leveduras e microrganismos fastidiosos
como Neisseria e Haemophilus.

•Especifica a Concentração Inibitória Mínima com a

utilização de uma ampla variedade de antibióticos
Automação Walk
Away Plus 96
 Automação Walk
Away Plus 96
• Utiliza microplacas (painéis) de 96 poços,
impregnados com a série bioquímica (cerca de 30
substratos) para a identificação bacteriana

• Agentes antimicrobianos com suas respectivas diluições

para a susceptibilidade antimicrobiana com concentração
inibitória mínima.

• Contém cerca de 20 ou mais antibióticos por painel,

dependendo do tipo de painel.
Automação Walk
Away Plus 96
ANTIMICROBIANOS
Antimicrobianos

São drogas que têm a capacidade de inibir o crescimento de

microorganismos.

Considerar sempre:

Espectro de ação é o percentual de espécies sensíveis (número

de espécies/ isolados sensíveis);

Potência ou concentração inibitória mínima (MIC, MIC50,

MIC90) é a concentração de antimicrobiano necessária para inibir o
crescimento bacteriano, de forma que quanto menor o MIC, maior a
potência e, quanto maior a potência, maior a dificuldade da bactéria
em desenvolver resistência.
Antimicrobianos

Os antimicrobianos podem ser classificados de várias maneiras:

• Espectro de ação

• Tipo de atividade antimicrobiana

• Grupo químico ao qual pertencem

• Mecanismo de ação
Mecanismos de ação dos antibacterianos
 Mecanismos de ação de agentes antimicrobianos
nas células bacterianas

1 - Interferência no metabolismo de ácidos nucléicos: quinolonas,

rifampicina;

2 - Interferência em reações enzimáticas (análogos estruturais):

trimetropim e sulfas;

3 - Interferência nas funções da membrana: polimixinas, colistina,

daptomicina;

4 -Interferência na síntese protéica: tetraciclina, estreptomicina,

linezolida);

5 -Interferência na síntese de parede celular:

penicilinas, cefalosporinas, carbapenêmicos, monobactâmicos,
vancomicina.
 Mecanismos de ação dos antibacterianos

• Inibição da síntese de parede celular

• Inibição da síntese de proteínas e

enzimas

• Inibição da transcrição e replicação

• Lesão de membrana plasmática

 Antimicrobianos e
resistência bacteriana
 O primeiro antibacteriano Penicilina

Alexander Fleming – 1928

Penicillium chrysogenum
(notatum)
O primeiro antibacteriano descoberto pelo
homem: Penicilina
O primeiro antibacteriano Penicilina

Penicilina → muito importante durante a 2ª grande

guerra.
 Resistência a drogas antimicrobianas

• 1940 – uso de antibióticos – doenças prontamente

curadas e não representariam ameaça à vida

• Acentuado otimismo – médicos e pesquisadores

acreditaram que toda doença infecciosa seria
facilmente controlada

• Constatação – o emprego terapêutico de um

antimicrobiano é seguido em curto espaço de tempo,
pelo aparecimento de linhagens bacterianas resistentes
e capazes de resistir ao tratamento.
 Ceftaroline
2010

Levofloxacin
1996
Imipenem
Ceftazidima
1985
O processo de descoberta de novos antibióticos passou da simples observação dos
fenômenos naturais para projetos racionais que obedecem várias etapas, com um
tempo médio de descoberta e disponibilização de 10 a 15 anos, a um custo
aproximado de U$ 100 milhões.
 Os antimicrobianos constituem uma das mais
importantes classes de substâncias produzidas

Naturais:
Antibióticos: Composto químico produzido por
microrganismos, que inibem ou matam outros
microrganismos.

Sintéticos ou semi-sintéticos:
Quimioterápicos: Fármacos, sintetizado em
laboratório, inibem ou matam microrganismos
 Antibióticos

Quimioterápicos
Microrganismos produtores de antimicrobianos

Streptomyces
 Atividades antimicrobianas
Atividade Microbicida
-Diminuição acentuada do
número de células viáveis.
-Inibe o crescimento e a
divisão do microrganismo
sensível.

Atividade Microbiostática
- Paralisam o metabolismo
do micro-organismo sensível
- O número de células
viáveis permanece
constante por muitas horas
 ESCOLHA DO ANTIMICROBIANO

• Identificação bacteriana

• Cultura e antibiograma (CLSI)

 Propriedades desejáveis para um
agente antimicrobiano

• Toxicidade seletiva: destruir o patógeno sem atacar o

hospedeiro.

• Não induzir resistência bacteriana;

• Alcançar níveis bactericidas no organismo e por

longos períodos;

• Não ser alergênico;

• Capaz de atingir o sítio de infecção;

• Espectro de ação satisfatório (G+, G- e anaeróbios)

 Toxicidade seletiva
• Inibição seletiva do crescimento do microrganismo sem
danos ao hospedeiro.

• Obtida explorando as diferenças entre o metabolismo e a

estrutura da bactéria e as características das células
humanas.
 Combinações de antimicrobianos
Podem ser utilizadas para:
- Aumentar o espectro antibacteriano para a
terapia empírica
- Tratamento de infecções polimicrobianas
- Atingir um efeito letal sinérgico

Sinergismo
Combinações de dois antimicrobianos que produzem
juntos uma intensificada atividade quando comparada
com a atividade de cada antimicrobiano separado.

- Diagnóstico específico mais demorado

- Custo
 ➢Por que estudar as drogas
antimicrobianos?

➢Qual é o interesse da ciência

na compreensão das origens
e evolução da resistência
bacteriana?
Os antibióticos são essenciais para o tratamento de
infecções bacterianas e estão entre os
medicamentos mais importantes no arsenal médico.

Tem reduzido a mortalidade, mas não a persistência

das doenças infecciosas.

A resistência aos antimicrobianos tem sido reportada

para todas as classes de drogas em uso clínico.
 Resistência aos antimicrobianos
Capacidade do microrganismo crescer na presença de uma droga, que,
normalmente, limitaria o crescimento ou provoca a morte do microrganismo.
Microrganismo resistente cresce na concentração sérica da droga no corpo do
hospedeiro.
 Resistência aos antimicrobianos
• Se uma população de bactérias com poucos individuos resistentes for
exposta a um antimicrobiano, as bactérias susceptíveis morrerão, mas
as resistentes irão sobreviver, ou seja, populações resistentes são
selecionadas pelo uso do antibiótico.

• As bactérias resistentes a um determinado antimicrobianos são

selecionadas pelo uso desse antibiótico.
 Resistência aos antimicrobianos
Intrínseca ou natural
• Capacidade de resistir a ação de um antibiótico como
resultado de características estruturais e funcionais
inerentes.
• Presente na maioria dos representantes que compõe um
grupo.
Ex: resistência dos Gram negativos à vancomicina

Adquirida

• Uma espécie anteriormente sensível torna-se resistente

• Mutações ou transferência horizontal de genes.
Ex: bactéria sensível a tetraciclina – por conjugação recebe o
gene tet.
 Mecanismos de resistência aos antibacterianos

5. Alteração de vias metabólicas

Transferência de genes de resistência
• A resistência a drogas frequentemente é carreada por
plasmídeos;

• Fatores R – plasmídeos que apresentam genes que

conferem resistência a vários antibióticos.
 INTERFERÊNCIA DAS DROGAS ANTIMICROBIANAS NO
HOSPEDEIRO

Podem interferir nos microrganismos da microbiota, quando

são usadas de forma inadequada pelo hospedeiro.

Quantidades residuais podem ser detectadas nos fluídos

corporais e podem interferir no balanço ecológico da
microbiota residente local, principalmente no intestino.

Quando lançadas no meio ambiente interferem no

equilíbrio ecológico dos grupos microbianos pertencentes
àquele nicho.
 Devido à grande promiscuidade e variabilidade genética
microbiana, a resistência a drogas tem se tornado um problema
grave, dos pontos de vista ecológico e clínico.
 Bactérias multirresistentes

Possuem resistência a dois ou mais grupos de

antimicrobianos
- S. aureus (MRSA)
- Enterococcus (VRE)
-Bacilos Gram-negativos (Pseudomonas,
Acinetobacter, Enterobacter, Klebsiella, Escherichia
coli)
-Streptococcus pneumoniae
-Mycobacterium tuberculosis
Infecções por bactérias multirresistentes

• Pacientes em UTI
• Idade avançada
• Infecções recorrentes

• Exposição hospitalar prolongada ou

repetitiva
• Grandes queimados
• HIV positivos
 Fatores chave na rápida disseminação de genes
de resistência
• Localização de genes de resistência em elementos genéticos móveis (plasmídeos,
transposons)

• Contato entre bactérias em ambientes polimicrobianos (mucosa do trato

respiratório e intestinal, pele; solo e hospitais)

• Diagnóstico inadequado

• Uso inadequado dos antimicrobianos

• Uso de antimicrobianos em animais

World Health Assembly in May 2015
Combate à resistência
microbiana

OMS alerta para

proliferação de
microrganismos
resistentes a drogas
antimicrobianas
Plano de Ação Global - WHO
Objetivos:

1) Melhorar a sensibilização e compreensão sobre o aumento da

resistência microbiana.

2) Vigilância epidemiológica e pesquisa.

3) Reduzir a incidência de infecções por medidas preventivas

4) Otimizar o uso de antimicrobianos (humana e animal)

5) Aumentar o investimento em novos medicamentos,

diagnóstico, vacinas e outras intervenções
 IMPACTO NA SAÚDE PÚBLICA
✓ Aumento da
✓ Aumento da morbidade complexidade
e mortalidade diagnóstica
laboratorial
✓ Redução das
possibilidades ✓ Aumento nos custos
terapêuticas de tratamento

✓ Prolongamento da
permanência hospitalar
ESTRATÉGIAS DE PREVENÇÃO

Prevenção da disseminação cruzada

Vigilância Uso racional de

epidemiológica antimicrobianos
 Resistências bacterianas de importância
clínica

• Klebsiella pneumoniae resistentes à cefoxitina e ceftazidima

(cefalosporinas)
• Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium resistentes à
vancomicina;
• Staphylococcus – resistente a  - lactâmicos e vancomicina;
• Streptococcus -hemolíticos – resistente à penicilina;
• Streptococcus viridans - vancomicina;
• Neisseria gonorrhoeae - resistente à ceftriaxona;
• Neisseria meningitidis - resistente à penicilina;
• Enterobactérias - resistentes ao imipenem.
Resistência intrínseca
Resistência intrínseca
Década de 60 – resistência à penicilina – produção de beta-lactamases

Década de 70 – surgiram cepas resistente à meticilina (MRSA) ou à oxacilina

(ORSA)

S. aureus resistente à todos s beta-lactâmicos;

Ocorre uma alteração do sítio de ação dos beta-

lactâmicos

Alteração das proteínas ligadoras de penicilinas denominadas PBPs-

(importantes na síntese da parede bacteriana)

A presença de enzima alterada, denominada PBP2a ou PBP2’, leva a

baixa afinidade da oxacilina pelo local de ligação na parede celular da
bactéria com consequente inatividade.

Gene mecA
Detecção de beta-lactamase (ESBL)
 Detecção de ESBL
• ESBL: betalactamases de espectro ampliado
– Podem ser produzidas durante a terapêutica
antimicrobiana
• hidrolisam todos os β-lactâmicos, à exceção dos
carbapenems e cefamicina

– Triagem para E.coli. K. pneumoniae, K.oxytoca e

P.mirabilis

– Os inóculos devem ser padronizados para escala 0,5 de

McFarland

– Discos utilizados: cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona, etc.

 Detecção de ESBL
• Na rotina diária, faz-se necessária a realização das
duas etapas:
– Teste de triagem por disco-difusão, cujo resultado é
alcançado através da leitura do diâmetro dos halos de
inibição

– Teste confirmatório baseia-se na inibição da atividade da

enzima na presença do ácido clavulânico.

– Realização de comparação do halo de inibição do β-

lactâmico àquele do mesmo antimicrobiano associado ao
ácido clavulânico.
Detecção de beta-lactamase (ESBL)
Detecção fenotípica de uma amostra de
K. pneumoniae produtora de ESBL

O resultado positivo com

aumento do halo de inibição
≥ 5 mm em comparação
àquele do β-lactâmico
sozinho
Detecção de beta-lactamase (ESBL)
Teste de aproximação dos discos:
 ceftazidima, cefotaxima ou
cefepima associado ao ácido ceftazidima, cefotaxima e cefepima
clavulânico

Observar que houve uma redução da CIM > 3

diluições para associação de ceftazidima/ácido
clavulânico, CIM 0,125 µg/mL.
 Detecção de Resistência

• Resistência de S.aureus a oxacilina/meticilina - MRSA

– Amostras de Staphylococcus spp. resistentes à oxacilina, são

resistentes a todos os β-lactâmicos

– Realizada com disco de cefoxitina 30µg

– Amostras de S. aureus e S. lugdunensis com halo de

inibição ≤ 21 mm para cefoxitina devem ser reportadas como
resistentes à oxacilina
 Resistência de S.aureus a
oxacilina/meticilina

Sensibilidade a cefoxitina : ≥22 mm Resistência a cefoxitina: ≤ 21 mm

 Meio cromogênico
destinado ao isolamento e
diferenciação de
Staphylococcus aureus
resistente à meticilina
(MRSA).
 KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase)

• As enzimas KPC são inibidas por ácido clavulânico e

tazobactam e, possuem a habilidade de hidrolisar
uma grande variedade de ß-lactâmicos como
cefalosporinas, penicilinas, aztreonam e inclusive, os
carbapenêmicos.
 KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase)

• Encontrada pela primeira vez em K. pneumoniae

• Atualmente já foram descritos casos de resistência

pela presença de KPC em Salmonella enterica, K.
oxytoca e Enterobacter spp, entre outros.

• Apresenta alto potencial de disseminação devido à

sua localização em plasmídio
FIM