Meios de cultura e Técnicas

Microbiológicas
Professor: Fabio Rogerio Lopes de
Oliveira
 TÉCNICA DA MEMBRANA FILTRANTE OU DA FILTRAÇÃO POR MEMBRANA

• A filtração por membrana é uma técnica de inoculação que

utiliza membranas de ésteres de celulose, de porosidade
conhecida e homogênea. Os microrganismos, com diâmetro
superior aos poros, ficam retidos na superfície da membrana, a
qual é, então, transferida para a superfície do meio de cultura
selecionado, contido em placa de Petri. Após o período de
incubação, faz-se a conta-gem das colônias desenvolvidas para a
posterior determinação da concentração de microrganismos
presentes na amostra biológica.
• No presente capítulo são definidos os procedimentos para
manuseio e esterilização de filtros de membrana construídos em
aço inoxidável. A elaboração deste procedimento visa impedir
que microrganismos contaminantes possam interferir e
prejudicar os resultados analíticos.
Após o período de incubação, faz-se a conta-gem das colônias
desenvolvidas para a posterior determinação da concentração
de microrganismos presentes na amostra biológica.
No presente capítulo são definidos os procedimentos para
manuseio e esterilização de filtros de membrana construídos em
aço inoxidável. A elaboração deste procedimento visa impedir
que microrganismos contaminantes possam interferir e
prejudicar os resultados analíticos.
A técnica de membrana filtrante é um método rápido e preciso
para isolamento e identifica-ção de colônias de bactérias e de
leveduras.
Esta técnica é largamente utilizada por possibilitar a avaliação de
grandes volumes de amos-tras. É a técnica de escolha para a
análise de águas e recomendada pelo Standart of Methods for
the Examination of Water and Wasterwater, referência
internacional em análises de águas.
Antes de começar as análises, fazer a assepsia da capela de fluxo
laminar com álcool a 70%, e manter as lâmpadas germicidas
acesas por, no mínimo, 10 minutos.
Separar todo o material a ser utilizado: filtros, membranas, pinça,
sistema manifold de filtra-ção, placas de Petri com meios de
cultura, bico de Bunsen.
Desligar a lâmpada germicida e posicionar o material a ser
utilizado no interior da capela de fluxo laminar. Manter as
lâmpadas germicidas ligadas por, no mínimo, 15 minutos.
Na avaliação microbiológica de cervejas, água mineral, isotônico
e refrigerantes, filtrar 100mL de amostra para cada uma das
avaliações microbiológicas requeridas através de membrana
filtrante estéril, com porosidade de 0,45μ e quadriculadas.
A técnica da filtração por membrana permite a utilização de
meios de cultura sólidos.
A Tabela 45 mostra os principais passos da técnica de filtração
por membrana utilizando funis em aço inoxidável. A vantagem
de trabalhar com este tipo de material é que os funis não
precisam ser esterilizados em autoclave e a manipulação das
amostras pode ocorrer em bancada nas proximi-dades da chama
do bico de Bunsen.
 CULTIVO E MANUTENÇÃO
Meios de Cultura:

Mistura de nutrientes requeridos para a sobrevivência e crescimento dos

microrganismos em um sistema artificial.

Podem ser em caldo (líquido) ou ágar (sólido).

Meios líquidos - úteis para a obtenção de grande biomassa de microrganismos

 CULTIVO E MANUTENÇÃO
• Meios quimicamente definidos:
(Meios com finalidades especiais)

• Meios seletivos

• Meios diferenciais

• Meios de enriquecimento

• Meios para cultivo de anaeróbios

 MÉTODOS DE CULTIVO - ROTINA
• INOCULAÇÃO:
• Técnica de esgotamento por estrias
• Técnica da semeadura em superfície
• Técnica da filtração por membrana
• Técnica da inoculação direta em meio líquido
 MEDIDA DO CRESCIMENTO
MÉTODO QUANTITATIVO:
Avaliação do número de células/volume da amostra
Número de Unidades Formadoras de Colônias /volume da amostra Exemplo:
Contagem microscópica, contagem em placas ou na superfície da membrana
filtrante.

MÉTODO QUALITATIVO:
Avaliação do peso celular ou estimativa de unidades de absorbância da massa de
células em caldo ou suspensões (turbidez).
Alteração da coloração do meio de cultura.
IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS
• Características Culturais
• Microscopia Óptica
• Morfologia Colonial
• Características Metabólicas
• Características Morfológicas
• Coloração simples
• Coloração diferencial
• Características Fisiológicas
• Características Antigênicas
• Características patogênicas
• Características genéticas
• Coloração de Gram
 ESTOCAGEM
• CONSERVAÇÃO DE CULTURAS PURAS:

Conservação por um curto período (dias a meses):

Armazenagem à temperatura de refrigeradores (4°C a 10°C) –
exige
repiques frequentes.
Conservação por longos períodos:
Nitrogênio líquido a -196°C
Freezer a -70°C/ -120°C
Liofilização – congelamento a seco - viabilidade das culturas por
muitos anos - coleção de microrganismos como referência.
 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS

• Utilização de técnicas microbiológicas:

• Pesquisar presença de microrganismos;

• Estimar número de microrganismos;

• Identificar os microrganismos.
 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS
Detecção de microrganismos estressados:

A detecção é feita pelo cultivo dos microrganismos em meios seletivos e não

seletivos;

Os microrganismos isolados do produto geralmente são submetidos às condições

de injúria: aquecimento, refrigeração, presença de conservantes, acidificação, etc
que podem afetar as células presentes (morfológica e bioquimicamente).