MÓDULO I

CONTROLE DE QUALIDADE MICROBIOLÓGICO

INTRODUÇÃO A MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL FARMACÊUTICA

Prof. Tiago Rodrigues

 Agenda
Dias 10, 12, 17,19,24 e 26 de abril.
Microbiologia básica
Origem e manutenção CEPAS;
Métodos de isolamento e cultivo:
Micro-organismos in hause “cultivo e CQ ”
Identificação de micro-organismos

2
CONTROLE DE QUALIDADE
MICROBIOLÓGICO EM
MEDICAMENTOS ESTÉREIS
O conceito de Controle de Qualidade em uma indústria farmacêutica
refere-se a um conjunto de operações que tem como objetivo verificar e
assegurar que os produtos estejam dentro dos padrões de qualidade
exigidos pelo órgão competente. No Brasil, as indústrias devem cumprir
as exigências impostas pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA) em conjunto com a Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº
301, de 21 de Agosto de 2019.
O Controle de Qualidade tem a responsabilidade de fiscalizar e
organizar as seguintes etapas: amostragem de matéria prima e do produto
final, especificações, documentação e todos os procedimentos de liberação
que garantam que os testes realizados sejam executados e que os materiais
utilizados na fabricação do produto, bem como, os produtos finais, não sejam
aprovados até que a sua qualidade obtenha resultado satisfatório (BRASIL,
2010).
 CONTROLE DE QUALIDADE MICROBIOLÓGICO

A qualidade microbiológica dos produtos farmacêuticos é definida por

padrões microbianos descritos em compêndios oficiais, farmacopeias e
normas regulamentadoras. Quando nos referimos aos produtos estéreis,
estes devem estar ausentes de micro-organismos para que possam ser
aprovados para comercialização (PINTO, T.; KANEKO; PINTO, A., 2015).
 TIPOS DE PRODUTOS ESTÉREIS
➢ Produtos parenterais:
Medicamentos administrados via intradérmica, subcutânea, intramuscular e
intravenosa.
➢ Produtos oftálmicos
➢ Produtos de irrigação:
Para uso cirúrgico e pós-cirúrgico
TIPOS DE PRODUTOS ESTÉREIS
 ENSAIOS MICROBIOLÓGICOS PARA PRODUTOS ESTÉREIS

Análise de Biocarga – Bioburden

➢ Este método é capaz de determinar a carga microbiana em produtos que serão submetidos a
processo de esterilização, seja por filtração esterilizante ou esterilização terminal;
➢ Consiste em medir o número total de micro-organismos viáveis (bactérias,
fungos/leveduras) que podem aparecer visivelmente em cinco dias (período de incubação)
em ágar caseína-soja;
Bomba milliflex Placa milliflex com amostra contaminada
Teste de Esterilidade
➢ Aplicam-se a insumos farmacêuticos, medicamentos e produtos para saúde que, de acordo com a
Farmacopeia Brasileira 6ª edição, devem ser estéreis, sendo adequados para revelar a presença de
bactérias e fungos;
➢ Um resultado satisfatório indica que não foi encontrado micro-organismo contaminante na amostra
examinada, ou seja, o produto cumpre com o requisito do teste: estéril;
➢ O Teste de Esterilidade não é suficiente para garantir a esterilidade da totalidade do lote. A condição
estéril é assegurada através da validação do processamento asséptico (Media Fill);
➢ Para a realização do teste, é importante que as pessoas sejam adequadamente treinadas e qualificadas;
➢ O Teste de Esterilidade deve ser realizados sob condições assépticas utilizando cabine de segurança
biológica Classe II tipo A, instalada em área limpa, de classificação compatível com os requerimentos
de controle ambiental exigidos para a realização do teste de esterilidade.
 Meios de cultura e fluidos de diluição e/ou lavagem
➢ Caldo caseína-soja (TSB): é adequado para a cultura de fungos, leveduras e bactérias
aeróbias;
➢ Fluido Thioglicolato: utilizado especificamente para bactérias anaeróbicas, porém, pode
detectar também bactérias aeróbias;
➢ Neutralizantes: adicionado nos meios de cultura no momento do teste. Penicilinase para
produtos penicilânicos e Lactamator para produtos cefalosporínicos;
➢ Fluido A: água peptonada 0,1%;
➢ Fluido D: fluido A com adição de polissorbato 80 – destinada aos produtos oftálmicos.
1. Método de inoculação direta
Consiste na transferência asséptica de volumes preestabelecidos da amostra
para meios de cultura. Posteriormente, são incubados a 20-25ºC e 30-35ºC por
um período de 14 dias.

Bepeben, exceção, por quê?

Amostras do produto Bepeben
1.200.000 UI analisado no Teste de
Esterilidade.
2. Método de Filtração por membrana

➢ Sistema Steritest: Teste de Esterilidade ocorre em um sistema fechado;

➢ Não há manipulação da membrana filtrante;
➢ Diminui os riscos de contaminação durante os testes;
Meios de Cultura e fluidos de lavagem Bomba Steritest Equinox
Dispositivos para o teste Término da análise
Estufa de 20-25°C Estufa de 30-35 °C
Meios de cultura apresentam turvação
Realiza-se o repique em placas de Petri
para identificação do micro-organismo
TESTE DE ESTERILIDADE REPROVADO
Ausência de crescimento microbiano nos meios de cultura, o
teste cumpriu com os requisitos de esterilidade.
Pesquisa de Endotoxina bacteriana

➢ É usado para detectar ou quantificar endotoxinas de bactérias gram

negativas presentes em amostras para qual o teste é preconizado;
➢ Utiliza-se o extrato aquoso dos amebócitos circulantes do Limulus
polyphemus ou do Tachypleus tridentatus preparado e caracterizado como
reagente LAL;
➢ A pesquisa de endotoxina bacteriana é realizada em produtos estéreis
parenterais.
Pesquisa de Endotoxina bacteriana

➢ Howell, em 1885, observou que o sangue do caranguejo ferradura (Limulus polyphemus)

gelificava quando retirado do animal. Um ano mais tarde, relatou que quando as células
sanguíneas eram coletadas e expostas a uma substância estranha, elas se liquefaziam e em
seguida coagulavam.

➢ Posteriormente, Shirodkar et al., informaram que uma bactéria marinha gram-negativa

causava uma doença fulminante no animal caracterizada por uma coagulação
intravascular e morte.
Pesquisa de Endotoxina bacteriana

➢ Em 1964, Levin e Bang verificaram que preparações de endotoxina termoestáveis

isoladas de Escherichia coli induziam à coagulação extracelular da hemolinfa (sangue) do
Limulus. Embora a endotoxina não causasse a coagulação do soro livre, a atividade
coagulante podia ser restaurada com a adição dos amebócitos ao soro.

➢ O ensaio de LAL foi introduzido pela primeira vez na USP XX em 1980. No Brasil, o
método foi descrito na farmacopeia brasileira 4ª edição em 1996.
 Endotoxina Bacteriana

➢ São um componente de lipopolissacarídeo (LPS) das membranas

celulares de bactérias gram-negativas. A presença das endotoxinas pode
ser detectada por um método específico e eficiente, conhecido como o
teste de Lisado de Amebócito Limulus (LAL).
➢ São toxinas contidas nas bactérias e que são liberadas depois da
destruição da membrana celular.
Esquema do lipopolissacarídeo (LPS) de uma bactéria gran negativa.
Limulus polyphemus Reagentes utilizados no teste
Os caranguejos-ferradura estão entre as criaturas mais antigas do mundo. Eles
sobreviveram aos dinossauros e acredita-se que estejam no planeta há pelo menos
450 milhões de anos. São artrópodes e estão mais próximos às aranhas e
escorpiões que caranguejos.

O sangue na ferradura é um dos líquidos mais caros do mundo: um litro de sangue azul
pode ser vendido por até US$ 15 mil (cerca de R$ 80 mil, na cotação atual).

A cor azul vem do cobre presente no sangue do animal — no sangue humano, os

átomos de ferro desempenham a mesma função, gerando a cor vermelha.
• Uma vez que suas conchas são perfuradas perto do coração,
cerca de 30% do sangue é colhido.

• Depois, os caranguejos são devolvidos à natureza.

• Mas estudos mostram que entre 10% e 30% morrem nesse

processo, e as fêmeas sobreviventes têm mais dificuldade
para procriar,
Caranguejo ferradura – um fóssil vivo
Processo de extração do sangue do caranguejo
Existem pelo menos 30 empresas trabalhando com vacinas, então cada uma delas
precisa passar por muitos testes de esterilidade", afirmou Barbara Brummer, da The
Nature Conservancy, ONG internacional de conservação da biodiversidade, em Nova
Jersey, estado americano onde muitos caranguejos são retirados da natureza.

Portanto, as empresas que desejam vender medicamentos, incluindo vacinas para covid-19,
vão precisar usar cada vez mais sangue dos caranguejo-ferradura para realizar os testes.
O teste de endotoxina bacteriana possui três técnicas com sensibilidade diferentes
➢ Método Gel Clot
Baseado na formação de coágulo ou gel (método semi-quantitativo);
➢ Método turbidimétrico
Baseado no tempo de reação (onset time) necessário para a mistura da reação atingir uma
absorvância pré-determinada ou na relação de desenvolvimento de turbidez.
➢ Teste Aprovado: os resultados são considerados aprovados se todos os parâmetros do
teste estiverem dentro do especificado;

➢ Teste Reprovado: formação de gel ou coágulo na presença de endotoxina. O produto é

reprovado se todos os parâmetros do teste estiverem válidos e o limite de endotoxina
estiver superior ao validado conforme compêndios ou valor calculado.
➢ Método cromogênico – colorimetria

Cada lote de cartucho possui um código de calibração que está relacionado com uma curva
padrão do log do tempo de reação pelo log da concentração de endotoxina. Depois que a
reação ocorre, a intensidade da cor é medida e a densidade óptica é comparada com a curva
padrão arquivada internamente para cada lote do cartucho.
Dúvidas?
 CONTROLE DE QUALIDADE
MICROBIOLÓGICO EM
MEDICAMENTOS NÃO ESTÉREIS
Formas de apresentação dos produtos:

Sólidos;
Líquidos;
Pastas;
Géis;
Pomadas,
Aerossóis;
• Executar o método da contagem utilizando o método de escolha
o Pour plate e, caso não seja possível obter recuperação
satisfatória por esse método, utilizar a filtração por membrana.
• Método pour plate

➢ Adicionar 10g/mL do produto a 90 mL de diluente (solução

fisiológica, peptona, caldo leethen, TAT, tampão fosfato) obtendo-se
assim a diluição 1:10;

➢ Adicionar 1 mL, em duplicata, a placas de petri estéreis previamente

identificadas;

➢ Verter de 15-20 mL o meio de cultura previamente fundido e

resfriado a 45-48ºC.
Contagem do numero total de micro-organismos mesofílicos e pesquisa de
patógenos
Contagem do numero total de micro-organismos mesofílicos e pesquisa de
patógenos
Contagem do numero total de micro-organismos mesofílicos e pesquisa de
patógenos
Contagem do numero total de micro-organismos mesofílicos e pesquisa de
patógenos
Especificação Contagem Microbiana e Pesquisa de Patógenos

Teste Especificação

3
Contagem total de bactérias aeróbias 10 UFC/g

2
Contagem total de fungos/leveduras 10 UFC/g

Pesquisa de Escherichia coli Ausente 1g

Pesquisa de Staphylococcus aureus Ausente 1g

Pesquisa de Salmonella spp. Ausente 1g

Bactérias Gram-negativas bile tolerantes Máximo 100 UFC/g

Contagem do numero total de micro-organismos mesofílicos e pesquisa de
patógenos
Teste de pesquisa de micro-
organismos patogênicos

Micro-organismos utilizados

S. aureus ATCC 6538;

P. aeruginosa ATCC 9027;
E. coli ATCC 8739;
Salmonella typhimurium ATCC 14028;
Candida albicans ATCC 10231.
Pesquisa de micro-organismos
patogênicos
Pesquisa de micro-organismos
patogênicos
Pesquisa de micro-organismos
patogênicos
Obrigado!