MICROBIOLOGIA

MEIOS DE CULTURA
CULTURA E ANTIBIOGRAMA
1. Conceito
É a associação equilibrada, em quantidade e qualidade, de substancias nutritivas
necessárias para o desenvolvimento dos microorganismos fora de seu “habitat” ou meio
natural.
O cultivo artificial permite o desenvolvimento do microorganismo em condições
previamente fixadas e sempre reprodutíveis.

2. Finalidades
2.1 Isolamento
A partir de um material contaminado é possível obter os microrganismos em seu
estado de pureza. Ex.: Ágar nutriente, Ágar sangue, etc.

2.2 Identificação
Permite o estudo detalhado do microrganismo, de suas características culturais,
propriedades bioquímicas e outras, permitindo sua classificação em gênero e espécie.
Ex.: TSI, caldo lactosado, etc.

2.3 Conservação
Após identificação e tipagem podemos formar a coleção de bactérias
organizando uma característica cujas cepas podem ser mantidas durante longos
períodos. Ex.: Ágar nutriente, meio Stock, etc.

2.4 Obtenção de toxinas

Dos microorganismos toxígenos podemos obter as suas exotoxinas por serem
difusíveis em meios de cultura. Ex.: Meio Craig-toxina colérica.

2.5 Transporte
No caso de não ser possível realizar a cultura logo após a colheita de um
determinado material biológico, estes meios mantém estável a população microbiana
presente neste material. Ex.: Meio Cary Blair, etc.

3. Características Indispensáveis aos Meios de Cultura

3.1 Conter substâncias necessárias ao desenvolvimento dos microorganismos
As substâncias que compõem os meios de cultura são alimentos bacterianos
chamados nutrientes. Esses nutrientes devem fornecer á bactéria fonte de energia, água
e, suprimento de sais minerais, de vitaminas e fatores de crescimento.
* Ágar é um polissacarídeo, extraído de algas marinhas, que serve de base á
preparação dos meios sólidos e semi-sólidos. Funde-se a 98ºC e solidifica a 45ºC. Não
tem valor nutriente, é apenas base solidificante.

3.2 pH adequado
Deve ser ideal ao crescimento do microrganismo a cultivar, em geral, as
bactérias exigem para o seu desenvolvimento uma reação neutra ou ligeiramente
alcalina (pH=7.0-7.4) e os fungos uma reação ácida (pH=4.5).
 3.3 Estar previamente esterilizado
O meio deve está isento de formas microbianas vivas. A esterilização varia de
acordo com a constituição do meio, mas na maioria das vezes, é realizada em autoclave
sob pressão a 121ºC/15 minutos.
O uso de tampões de algodão cardado ou outro material e a proteção de papel
manilha nos recipientes onde estão contidos os meios esterilizados, faz manter a
proteção contra a contaminação ambiental.

3.4 Limpidez
A turvação é um dos indicativos do crescimento bacteriano em meios líquidos,
daí ser obrigatória a sua transparência líquida antes do uso.

4. Classificação
Os meios de cultura podem ser classificados nas seguintes categorias:

4.1 Quanto à composição:

a) Naturais: contém substancias de origem biológica. A composição não é bem
definida. Ex.: Extrato de carne, extrato de levedura, etc.
b) Sintéticos: são constituídos de substâncias químicas isoladas, em
quantidades desconhecidas, portanto, composição bem determinada. Ex.:
Citrato de Simmons, etc.

4.2 Quanto ao estado físico/consistência:

a) Líquidos: os nutrientes são dissolvidos em água. O crescimento bacteriano é
observado pela turvação do meio, pela formação de uma película sobre a
superfície ou formação de sedimento. Ex.: Caldo simples, caldo
tetratioanato, etc.

b) Sólidos: a princípio pela adição de gelatina e posteriormente pela adição de

ágar. Proporcionam um estudo mais detalhado das bactérias em cultura pura
através de seu crescimento característico, pelo aparecimento de Unidades
Formadoras de Colônias (UFC). O ágar é adicionado numa proporção de 1,5
a 2,0%. Ex.: Ágar simples, ágar chocolate, etc.

c) Semi-sólidos: são aqueles em que adicionamos uma quantidade muito menor

de ágar (0,4 a 0,5%) do que nos meios sólidos. Ex.: meio SIM para a
motilidade, meio de Fletcher, etc.

d) Mistos: são constituídos de parte líquida e sólida simultaneamente. Ex.:

meios de Tarozzi (caldo simples e pedaços de fígado), batata glicerinada, etc.

Nota: os meios sólidos e semi-sólidos são conhecidos como ágar (ex.: ágar sangue) e os
meios líquidos como caldo (ex.: caldo selenito).

4.3 Quanto ao uso prático/finalidade:

a) Meios básicos: apropriados para cultivo e conservação das bactérias de
pouca exigência nutricional e que servem de base para o preparo de outros
meios. Ex.: Caldo simples, ágar simples, água peptonada, etc.
 b) Meios de enriquecimento: são obtidos pela adição aos meios básicos, de
substancias de maior valor nutritivo. Ex.: Caldo glicosado, caldo ascite, ágar
sangue, ágar chocolate, etc.

c) Meios seletivos ou de diagnóstico: através do uso de suas propriedades

bioquímicas selecionam um grupo de bactérias por conterem substancias
inibidoras para as outras bactérias, substancias essas chamadas de
bacterioimpedientes. Ex.: *Ágar Chapman usado para o isolamento e
estafilococos, que contém como substancias bacterioimpediente o excesso de
NaCl; *Ágar EMB usado para o isolamento de enterobactérias, que contém
como substancia bacterioimpediente a eosina amarela a 0,5% em solução
aquosa.

d) Meios diferenciais ou indicadores: proporcionam a distinção dos diversos

gêneros bacterianos de uma família atreves do estudo de suas propriedades
bioquímicas. Ex.: TSI, Citrato de Simmons, demais meios utilizados na Série
Bioquímica (identificação de gênero ou espécie).

e) Meios especiais: são aqueles que servem para dosagens microbiológicas de

vitaminas, enzimas, antibióticos, etc.

5. Teste de Esterilidade e Teste de Eficiência

5.1 Teste de Esterilidade:
Deve ser aplicado a todas as remessas de meios, sejam preparados no laboratório
ou adquiridos prontos para uso.
O lote inteiro não deve ser testado quanto a esterilidade, entretanto, uma amostra
representativa deve ser selecionada (ex.: lote de até 100 unidades – 5 a 10% é
suficiente). Os meios devem ser incubados a 35ºC/24h ou outra temperatura na qual o
meio é usado. Após esse tempo se for verificado qualquer crescimento o lote todo é
desprezado.
Mesmo que a remessa tenha passado pela prova de esterilidade, o técnico deve
examinar cada placa por ocasião da inoculação a fim de verificar se há colônias viáveis,
pois pode ocorrer uma contaminação superficial aleatória.

5.2 Teste de Eficiência:

Em cada novo lote de um meio, deve ser testado antes do uso em rotina, o
crescimento seletivo através de culturas estoques de características conhecidas.
Os meios devem ser testados com microrganismos para os quais eles são
destinados (ex.: meios seletivos tanto com microrganismos que devem crescer como
com os que devem ser inibidos; meios para provas bioquímicas com microrganismos
que apresentem prova positiva como microrganismos com prova negativa).

6. Preparo de Meios de Cultura – Segue a técnica preconizada pelo fabricante

Exemplo
6.1 Ágar Sangue::
 Em um balão de 250ml colocar 4,0g de meio base para ágar sangue e 100ml
de água destilada ou desmineralizada;
 Levar a aquecimento em banho-maria para completa dissolução;
 Autoclavar a 121ºC/15min.;
 Esfriar até 48-50ºC e adicionar 5ml de sangue (proporção de 5%);
  Agitar levemente até misturar bem;
 Distribuir assepticamente em placas de Petri esterilizadas;
 Deixar solidificar, acondicionar devidamente e guardar em geladeira.

6.2 Ágar Chocolate:

 Em um balão de 250ml colocar 4,0g de meio base para ágar sangue e 100ml
de água destilada ou desmineralizada;
 Levar a aquecimento em banho-maria para completa dissolução;
 Esfriar até 80ºC e adicionar 5ml de sangue (proporção de 5%);
 Agitar levemente até misturar bem;
 Distribuir assepticamente em placas de Petri esterilizadas;
 Deixar solidificar, acondicionar devidamente e guardar em geladeira.

Plaqueamento (distribuição de ágar sangue)

 TESTE DE SENSIBILIDADE A ANTIBIÓTICOS E QUIMIOTERÁPICOS –
ANTIBIOGRAMA

1. Conceito

Denomina-se antibiograma a técnica que estabelece “in vitro” a sensibilidade ou

resistência dos microrganismos aos diferentes antibióticos e quimioterápicos, cujos
resultados são aplicados “in vivos”. O resultado expressa uma indicação para se
conseguir a terapêutica racional em diferentes processos patológicos causados por
microrganismos.

2. Objetivos

 Verificar a sensibilidade e/ou resistência de um dado microrganismo à

concentrações conhecidas de diferentes antimicrobianos.
 Determinar o espectro de ação de um microbiano em solução.

3. Métodos
3.1 Prova de sensibilidade por diluição:
Este método implica o uso de diluições seriadas de um antibiótico em meio de
cultura adequado ao crescimento de determinada bactéria.
Esta prova é muito mais sensível, porém mais complexa e menos prática. Requer
altas condições técnicas e maior tempo de execução. Não é usado em rotina, porque seu
custo inviabiliza a sua realização.
O teste é feito semeando-se a bactéria em estudo em tubos com meios líquidos
contendo a concentração sucessiva do antibiótico e após a incubação, verifica-se a
menor concentração (maior diluição) do antimicrobiano que inibe o crescimento da
bactéria. Esta concentração é geralmente chamada de concentração inibitória mínima ou
MIC (minimal inibitory concentration).
A leitura é feita pela turvação do meio (meio turvo=Resistente; meio
límpido=Sensível).
O resultado é expresso informando a concentração do antibiótico com a
resistência ou sensibilidade do microrganismo testado.

3.2 Prova de sensibilidade por difusão em meio sólido (Método Kirby-Bauer):

Este método baseia-se na capacidade d difusão do antibiótico, que se encontra
impregnado em discos de papel filtro, na superfície de um meio sólido previamente
inoculado com o microrganismo a ser testado, inibindo o crescimento microbiano,
evidenciado pela formação de halos de inibição em torno dos discos, para os suscetíveis.
É mais prático e simples, entretanto é menos sensível, pois testa apenas uma
concentração do antibiótico. È o método mais utilizado em rotina.

4. Critérios para Obtenção de Resultados Extratos e Reprodutíveis

Na aplicação do método de Kirby-Bauer usam-se critérios bacteriológicos
precisos para o isolamento, obtenção do inoculo e semeadura dos microrganismos.
 4.1 Escolha do meio de cultura:
 Meio ideal: ágar Mueller-Hinton, permite o crescimento irrestrito de
bactérias e não interfere na atividade do antibiótico;
 pH do meio: 7.2 a 7.4
 Espessura do meio na placa: 4 a 6mm, que corresponde a 20-25ml de
meio para uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro

4.2 Preparo do inóculo:

A turbidez da suspensão bacteriana deve ser ajustada a 108 bactérias/ml, que
corresponde ao tubo 0,5 da escala de Mac Farland (0,5 ml de cloreto de bário a 1% +
99,5 ml de uma solução de ácido sulfúrico a 1% ou 0,36N).
A suspensão não deve ser muita concentrada ou muito diluída, pois pode levar a
falsos resultados. Se for muito concentrada pode apresentar uma falsa resistência e
muito diluída uma falsa sensibilidade.

4.3 Escolha dos discos:

Os discos devem ser de material que permitam uma difusão homogênea para o
meio e não interfiram na atividade do antibiótico. Devem ser conservados a 4ºC.

4.4 Condições de incubação

 Atmosfera de O2: aerobiose, anaerobiose ou microaerofilia.
 Temperatura: 35 a 37ºC
 Tempo: 16-18h

5. Indicação do Antibiograma
5.1 Condições em que o antibiograma é “Dispensável”:
 Quando se conhece o comportamento de determinadas bactérias frente aos
antibióticos, sendo excepcional o aparecimento de cepas resistentes. Ex:
Penicilina para S. pyogenes.
 Doenças em que já tenham uma linha de tratamento instituída e
comprovadamente eficaz. Ex: Salmonelose – clorafenicol e sulfas.
 Doenças de curso rápido, fatais se não tratadas de imediato. Ex: meningite,
septicemia.
 Tratamento local de infecções de pele, olhos e ouvidos nestas condições é
muito comum, pelo menos no inicio, não ser feita o antibiograma.

5.2 Condições em que o antibiograma é “Indispensável”:

 Infecções estafilococcias graves ou moderadas, com microrganismo
produtor, ou não, de penicilinase, visto que muitas cepas destas bactérias
apresentam resistência a um ou vários antibióticos.
 Infecções por enterobactérias, muitas cepas apresentam resistência a um ou
vários antibióticos (plasmídios R).
 Infecções urinárias
 Infecções hospitalares.
 Aumento da infecção durante o tratamento, por infecção ou recidiva, ou
insucesso determinado por antibiótico teoricamente eficaz.
 5.3 Divergência com a resposta terapêutica (Antibiograma sensível e paciente
não responde ao tratamento):
 Mais de um microrganismo patogênico e foi administrado o antibiótico
apenas para um.
 Isolamento e teste do germe errado (não patogênico ou secundário).
 Aparecimento de um mutante resistente ausente no isolamento primário
despercebido no repique das colônias.
 A resposta é correta, o germe no entanto foi protegido da droga pela ação de
um germe secundário que é neutralizado por um produto metabólico (ex: a
penicilase).
 Fatores que não são de responsabilidade do laboratório, como: dosagem
incorreta e má administração da droga e características do paciente ou de
sua doença.
 O comportamento “in vitro” da bactéria é diferente de “in vivo”.

6. Critérios para a Escolha do Antimicrobiano

Para a escolha do antimicrobiano mais indicado para o tratamento da infecção
em questão, deve-se considerar alguns critérios:
 O mais eficaz, contra a bactéria isolada na cultura;
 O menos tóxico, Ex: se a bactéria é sensível ao clotrimoxazol,
cefalexina, gentamicina, amicacina; é preferível usar clotrimoxazol e
cefalexina, que não tem o risco toxicidade renal existente com o uso de
aminoglicosídeos (gentamicina e amicacina);
 Ser o paciente é ambulatorial deve-se dar preferência aos
antimicrobianos que tem apresentação para uso oral.
 O sítio ou localização da infecção, pois um determinado
antimicrobiano pode penetrar e atingir maiores concentrações que os outros
na bile, urina ou liquor. O norfloxacino, por exemplo, um antimicrobiano do
grupo das quinolonas, atinge boa concentração apenas na urina e não em
outros fluidos orgânicos ou tecidos.
 O estado clínico do paciente, quando por exemplo, é nefropata,
hepatopata, alérgico a penicilina ou encontra-se gestante.
 O custo relativo do tratamento deve ser pesado, tendo em vista as
condições econômicas precárias da maior parte da população.

7. Prova de Kirby-Bauer
7.1 Técnica:
 Fazer uma suspensão em caldo Muller Hinton ou caldo de soja
tripticase (+- 4 a 5 colônias do cultivo puro em 2 ml do meio); incubar a
36ºC (+/- 10C) por 2 a 6 horas;
 Acertar a turbidez da suspensão comparando-a à turbidez do tubo 0,5
da escala de Mac Farland; se necessário, dilui a suspensão para ficar de
acordo com o padrão;
 Homogeneizar a suspensão (leve agitação) e umedecer um “swab”
esterilizado na mesma. Pressionar a “swab” contra a parede do tubo para
remover o excesso e semear em toda a superfície da placa com o meio ágar
Muller Hinton, em várias direções. Deixar secar a temperatura ambiente por
3-5 minutos;
 Com uma pinça esterilizada colocar os discos na superfície do meio
fazendo uma leve pressão para aderir bem, deixando uma distância de um
 disco para o outro e dos discos para as bordas das placas de + ou – 2 cm.
Caso seja utilizado o sistema multi-disco de antibiótiocos, colocá-lo sobre o
meio e osbervar a aderência de todos os discos presentes no sistema.
 Incubar as placas em posição invertida por 35ºC/18-24h;

7.2 Leitura:
Medir o diâmetro do halo de inibição formado ao redor do disco, com uma régua
em mm. Interpretar o resultado de acordo com a tabela de padrões interpretativos de
sensibilidade ou resistência pra cada antibiótico.
A tabela de padrões interpretativos de sensibilidade ou resistência levam em
consideração a carga antibiótica dos discos, a difusibilidade e o peso molecular.

7.3 Interpretação:

 R (resistente): não apresenta o halo de inibição ao redor do disco ou

apresenta o halo de inibição menor que o padrão de sensibilidade.
 S (sensível): apresenta o halo de inibição ou redor ao redor do disco
igual ou maior que o padrão de sensibilidade.

A presença de colônias isoladas no halo de inibição, indica a presença de

mutantes resistentes ao antibiótico. O aparecimento desses mutantes na população
bacteriana acorre devido aos fenômenos de mutação espontânea, mecanismos de
recombinação.
Se aparecerem dois halos de inibição superpostos, sendo um halo nítido e outro
menos límpido, considera-se somente o diâmetro do halo bem nítido.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

GILLESPIE, S. Diagnóstico Microbiológico 1ª Ed. Editora Premier 2006

JAWETZ, E. et al. Microbiologia Médica. 18 ed. Rio de Janeiro : Guanabara Koogan,

2000

KONEMAN, E. W. et al. Diagnóstico microbiológico. 5.ed. Rio de Janeiro: Medsi

2001.

MINS, C. et al. Microbiologia Médica. 2 ed. São Paulo : Manole, 2000.

OPLUSTIL, Carmem P. Procedimentos básicos em Microbiologia Clínica. São

Paulo: Sarvier, 2000.

OPLUSTIL, Carmem P. Procedimentos básicos em Microbiologia Clínica. São

Paulo: Sarvier, 2004.

PELCZAR JR. , M. J. et al. Microbiologia conceitos e aplicações. 3.ed. Makron

Books, 2001.

SOARES, M. M. S. R et al. Microbiologia Prática – Roteiro e Manual. Ed. Atheneu,

2005.

TRABULSI, L et al. Microbiologia. 4 ed. São Paulo: Atheneu, 2005.