REGIANE CRISTINA CAMARGO ZANICHELLI (8040980)

Bacharelado em Biomedicina

RELATÓRIO ESTÁGIOS PRÁTICOS MICROBIOLOGIA

 Prof. Lívia Furquim de Castro

Claretiano - Centro Universitário

RIO CLARO

2021
 INTRODUÇÃO

A iniciação de estágio supervisionado no laboratório multiuso na Faculdade

Claretiano de Rio Claro, propôs a metodologia prática junto com o conteúdo teórico e
clínico já estudado em microbiologia clínica, contribuindo para identificação de
microrganismos patógenos através de técnicas de semeadura e provas bioquímicas,
entendimento dessas técnicas.
Conforme já estudado a microbiologia entende os microrganismos, são seres
vivos que apresentam pequenas formas celulares visualizados com microscópio óptico
ou eletrônico, são encontrados em vários tipos de ambientes, são caracterizados como
mais simples ou mais exigentes, variam de várias formas e tipos de reações
bioquímicas conforme suas características específicas (VERMELHO, 2019).
O principal objetivo das análises microbiológicas foram identificar as
características e aspectos que envolvem esses microrganismos estudados, constituído
pelas bactérias e fungos (filamentosos, leveduras), através das análises direta, meios
de cultura e provas bioquímicas e efetuar e interpretar antibiogramas. As amostras
utilizadas foram materiais biológicos (secreções orofaringe, urina, amostras
microrganismo já cultivados) (VERMELHO, 2019).
Após receber a amostra a etapa inicial para identificar o microrganismo é
observar as estruturas do material pelo exame direto, onde é confeccionado um
esfregaço com uma fina camada de material e analisar no microscópio. (Figura 1).

Figura 1. Estruturas bactérias. (Fonte: Educação biologia)

 A coloração de gram é uma técnica que permite a visualização microscópica das
bactérias na lâmina corada pela técnica de coloração. As bactérias gram positivas
(Figura 2) tem parede celular de peptídeo glicano e retem a coloração de violeta de
genciana sendo visualizados de azul violeta, as bactérias gram negativas (Figura 3)
tem fina camada de peptídeo glicano não absorvendo a coloração da violeta, se coram
posteriormente com a fucsina e assumem o tom róseo avermelhado.

Figura 2. Bactérias gram positivas. Fonte: autoria própria aulas práticas

Figura 3. Bactéria gram negativa. Fonte: autoria própria aulas práticas

Técnica coloração de gram:

 Confeccionar uma lâmina com esfregaço do material a ser analisado

 Cobrir o esfregaço com violeta de genciana deixe por 1 minuto
 Cobrir a lâmina com reagente lugol e aguardar 1 minuto
 Lavar a lâmina com cuidado em água corrente
 Adicionar álcool absoluto e após lavar com água
 Cobrir a lâmina com lugol e deixe por 1 minuto
 Lavar com água corrente e deixar secar
 Observar no microscópio óptico

Figura 4. Técnica coloração de gram. Fonte: Kasvi, 2019

Coloração de Ziel Neilsen

A técnica de coloração De Ziel Neisen é mais agressiva, utiliza-se para bactérias
do gênero Mycobacterium e Nocadia são resistentes a essa coloração, mesmo quando
descoradas com ácidos e álcool absoluto são denominados bacilos álcool-ácido
resistentes (BAAR).
Utilizamos como material a escarro de alunos para coloração e pesquisa da
técnica, onde se ressalva que não foi seguido as orientações de coleta do material.
Técnica:
 Preparado um esfregaço com o material o
 Colocar a lâmina sob suporte apropriado e cobrir todo o esfregaço com a
solução de fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen
 Aquecer a lâmina durante 5 minutos, cuidando para que o líquido não entre em
ebulição ou ainda que seque
 Retirar a lâmina do suporte e lavar rapidamente em água corrente com cuidado
  Descorar os esfregaços usando a solução descorante, gotejando-a sobre a
lâmina inclinada até que não remova mais corante
 Lavar a lâmina em água corrente com cuidado
 Cobrir todo o esfregaço com azul de metileno Loeffler por 1 minuto
 Lavar em água corrente e deixar secar
 Observar a presença no microscópio.

Preparo dos meios de cultura

Os meios de cultura são constituições de substâncias e nutrientes, que em

condições adequada promove o crescimento de bactérias e fungos (filamentosos ou
leveduras) cultivados em laboratório para identificação das diversas espécies que são
caracterizadas por suas e necessidades próprias de crescimento nos diversos meios
de cultura. As condições que os meios de cultura oferecem para o cultivo desses
microrganismos são: Carbono e Nitrogênio, fonte de energia, sais minerais, fatores de
crescimento e condições físicas. São classificados em líquidos, semi sólidos e sólidos.
Nas atividades práticas preparamos diferentes tipos de meios de cultura para
serem utilizados para o cultivo de microrganismos. Para cada meio foi utilizado:
béqueres; balões Volumétricos; água destilada; balança; placas de Petr; tubos com
tampa de rosca; meio desidratado (figura 5). Calculado o peso do pó a ser pesado
conforme a sua diluição necessária no volume a ser reconstituído seguindo o protocolo
indicado de cada meio, e adicionar separadamente à água destilada quente,
homogeneizar. Após autoclavar no Erlenmeyer tampado com algodão por 15 minutos a
121º C. Distribuir em placas ainda quente, antes de solidificar.
 Figura 5. Agar BHI e Sabouraud. Fonto: autoria própria aulas práticas

“ciência”), a microbiologia é a ciência responsável pelo estudo de seres de

Àgar BHI:

Brain Heart Infusion (BHI) é uma agar para a cultura utilizado para vários tipos
de microrganismos. É constituído de nutrientes dos componentes da infusão de
cérebro-coração de animal, da peptona e da glucose
Patógenos cultivados: Streptococcus pneumoniae, Trichophyton mentagrophytes,
Candida albicans, Listeria monocytogenes, Shigella flexneri
Caracteristicas macroscópicas: colónias isoladas nas áreas estriadas com o
crescimento.

Àgar sangue:
O ágar sangue tem a finalidade de isolar microrganismos como base para os
meios que contêm sangue de animais. É também utilizado para realizar teste CAMP
Patógenos cultivados e características macroscópicas: Escherichia coli (crescimento
beta hemolítico), Enterococcus faecalis, Shigella flexneri, Staphylococcus aureus (beta-
hemólise), Streptococcus agalactiae (beta-hemólise), Streptococcus pneumoniae
(colônias verdes acizentadas com alfa-hemólise), Streptococcus pyogenes (beta-
hemólise).
Àgar EMB:
É um meio seletivo utilizado para isolamento e diferenciação de bacilos entéricos
gram negativos (Enterobacteriaceae e outros bastonetes gram-negativos) pela
formulação de Holt-Harris e Teague.
Patógenos cultivados e características macroscópicas: Escherichia coli (colónias pretas
azuladas com reflexo verde metalizado), Salmonella Typhimurium (colónias cinzentas
claras a âmbar), Shigella flexneri (colónias incolores a âmbar claro), Enterococcus
faecalis (colônias incolores).

Àgar Mac Conkey:

É um meio de seleção utilizado para diferenciar e isolar enterobacteriaceae e
bastonetes gram-negativo, com grande concentração de sais biliares, que inibe os
microrganismos gram-positivos.
Patógenos cultivados e características macroscópicas: Escherichia coli (coloração
rosa), Proteus mirabilis (coloração incolor a bege), Salmonella Typhimurium (coloração
incolor a bege), Salmonella Abony (coloração incolor a bege), Shigella flexneri
(coloração incolor),

Meios de cultura para análises bioquímicas:

Àgar Bile Esculina:

O Ágar de bílis esculina é um meio utilizado para identificação de Enterococcus

e de estreptococos do grupo Streptococcus bovis, por meio de hidrolise do glicosídeo
esculina em esculetina e dextrose.
Patógenos cultivados e características macroscópicas: Enterococcus faecalis
(escurecimento
No redor das colônias),

Àgar Citrato de Simmons:

O Simmons Citrate Agar é um meio de cultura utilizado para diferenciação de
bactérias gram negativas com sua formulação de base o citrato.
Patógenos cultivados e características macroscópicas: Enterobacter aerogenes
(coloração azul),
Àgar Fenilalanina:
O ágar Fenilalanina é usado para a diferenciação de bacilos entéricos com base
na sua capacidade de produzir ácido fenilpirúvico por desaminação oxidativa.
Patógenos cultivados e características macroscópicas: Proteus e Morganella
(coloração verde)

Àgar manitol salgado:

O ágar manitol salgado é um meio utilizado para selecionar estafilococos e para
identificar Staphylococcus aureus após o resultado de coagulase negativa.
Patógenos cultivados e características macroscópicas: Staphylococcus aureus
(Colónias medias amarelas e meio amarelo), Staphylococcus epidermidis (Colónias
brancas de dimensão pequena a média e meio vermelho).

Àgar salmonella-shigella:
O ágar Salmonella Shigella Agar (SS Agar) é um meio seletivo utilizado para
diferenciar no isolamento de bacilos entéricos patogénicos, especialmente os que
pertencem ao género da Salmonella.
Patógenos cultivados e características macroscópicas: Escherichia (colónias cor-de-
rosa a vermelhas com precipitado), Salmonella Typhimurium (colônias bege e centro
pretos).

Ágar Tríplice Açúcar Ferro:

O ágar Triple Sugar Iron (TSI), quando utilizado como um meio em placas, é
utilizado para diferenciação de Enterobacteriaceae, especialmente para diferenciar a
Salmonella de outras bactérias entéricas.
Patógenos cultivados e características macroscópicas: Escherichia coli (colónias
amarelas, meio amarelo à volta das colónias), Salmonella Typhimurium (colónias cor-
de-rosa com centros pretos e meio vermelho), Salmonella Abony (colónias rosa com
centros pretos e meio vermelho), Shigella flexneri (colônias rosa e meio vermelho).

Meio SIM (sulfato/indol/motilidade Ágar):

 O ágar Indol Sulfeto Motilidade (SIM) é um meio semi sólido usado para
diferenciar bacilos entéricos com base o sulfeto, observando a formação de indol e
motilidade.
Patógenos cultivados e características macroscópicas: Listeria monocytogenes
(Motilidade Positiva apresentando formato de"guarda-chuva" no terço superior do
ágar), Listeria innocua (H2S Positivo, Motilidade Positivo e Indol Negativo)

Meio de cultura para o antibiograma:

Àgar Mueller Hinton.
O ágar de Mueller Hinton é utilizado para testar a sensibilidade antimicrobiana
isolados de microrganismos patógenos exigentes, após a inoculação da amostra no
ágar são implantadas os discos com antimicrobiano são colocados na superfície do
ágar.
Características macroscópicas são observadas as dimensões das zonas dos
raios de inibição e de crescimento microbiano ou não determinado pela sensibilidade
(S) e resistência (R).

Tipos de semeio
A inoculação dos microrganismos no meio de cultura é chamada de semeio,
sempre perto do raio de um bico de busen, com uma alça estéril ou alça de platina. A
estria simples pode ser realizada na placa petri ou tubo de ensaio, na placa realiza o
movimento de zig zag. A estria por esgotamento, tenta-se esgotar pequenas
quantidades do material na tentativa de isolar as colônias. Também utilizamos a técnica
de semeio de pique central para meio sim e cultura de fungos. A técnica de
espelhamento utiliza-se uma porção de amostra diluída e se espalha com a alça de
Drigaslsk por toda a placa até ficar homogénea para inoculação de discos de
antibióticos para realizar antibiograma.

Teste de Pyr

O teste de PYR determina a atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase produzida

pelo S. pyogenes, mas não pelos demais estreptococos β-hemolíticos. Colônias β-
hemolíticas de enterococos podem ser confundidas com S. pyogenes, pois ambas
apresentam positividade neste teste.

Procedimento:
  Com auxílio de uma pinça, retirar um disco de PYR do frasco e colocá-lo sobre
uma lâmina ou placa de Petri vazia;
 Pingar uma gota de água destilada estéril (não utilizar salina, pois torna a reação
mais lenta e menos intensa);
 Realizar um esfregaço com a bactéria a ser testada, recém-isolada, sobre o
disco de PYR umidecido;
 Aguardar alguns minutos e colocar uma gota do reagente PYR. A reação
ocorrerá em até 1 minuto.

Interpretação: Teste de PYR positivo apresenta o desenvolvimento de cor vermelha; O

aparecimento de coloração amarela ou alaranjada indica resultado negativo; S.
pyogenes e Enterococcus spp. são PYR positivos.

Prova de Catalase:

A presença da catalase permite separar os estreptococos catalase negativa de outros

cocos Gram-positivos produtores de catalase, por exemplo, estafilococos. A enzima
catalase converte o peróxido de hidrogênio em oxigênio e água. A liberação do
oxigênio se observa pela formação de bolhas.

Procedimento:

 Colocar sobre uma placa de Petri, ou uma lâmina, uma porção do isolado de
uma cultura 18 - 24 horas, evitando tocar no meio de cultura. Repetir o
procedimento com cepas controle positivo e negativo;
 Adicionar uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%;
 Observar a formação de bolhas de ar, indicativo de teste positivo para catalase.

Interpretação: Não havendo formação de bolhas, o teste é negativo e indicativo

de Streptococcus. Reações falso positivas podem ocorrer quando o teste é realizado
em meio de cultura ágar sangue.

Prova de Coagulase:

Verificar se o microrganismo possui a coagulase (ou fator aglutinante) ligada na

superfície da parede celular, que reagindo com o fibrinogênio do plasma, causa a
coagulação do mesmo.

Procedimento:
  Colocar 2 gotas de salina em uma lâmina;
 Colocar uma porção da colônia isolada a ser testada;
 Colocar uma gota de plasma e misturar.

Não se recomenda realizar o teste a partir de um ágar com grande concentração de sal
como, por exemplo, o ágar manitol.

Leitura:
Formação de grumos em 10 segundos.

Interpretação:

 Formação de coágulo ou grumos, identifica Staphylococcus aureus.

 Não há formação de coágulo ou grumos, identifica Staphylococcus coagulase
negativa.

Técnica de microcultivo

Material necessário: placa petri estéril, tubo em U, lâmina, lamínula, agar batata 1 cm²,
papel absorvente no fundo da placa, agulha de inoculação.
Procedimento:
 Com auxílio de uma espátula flambada ou bisturi cortar um quadrado de agar
batata.
 Colocar a lâmina sobre o tubo U dentro da placa petri, e colocar o pedaço de
agar batata sobre a lamina.
 Com auxílio de uma agulha de inoculação flambar a agulha, coletar uma
pequena porção do fungo e tocar no agar batata.
 Cobrir com a lamínula
 Umidecer um chumaço de algodão com água destilada estéril para umidificar
a camera
 Deixar na estufa de 7 a 10 dias e observar o crescimento de fundo no meio
agar sob a lâmina e a lâmínula
 Retirar a lamínula com cuidado e sob uma lâmina pingar uma gota de azul de
lactofenol e também sob a lâmina utilizada.
 Observar no microscópio a presença de esporos e hifas aderidos à lâmina
(tipo e cor da hifa, forma disposição e formato dos esporos)
Resultados:

Coloração de Ziel Neilsen (figura 6), amostra de escarro aluna Helen.

Observação: não foram seguidas as orientações de coleta do material

Resultado: Não foram observadas estrutura de bacilos de micobacterium, apenas

observado presença de células epiteliais.

Figura 6. Coloração de Ziel Neilsen. Fonte: autoria própria das aulas práticas

Resultados identificação Microbiologica:

Semeio de colônias de material de orofaringe aluna Lais e aluna Francy, foi

inoculado uma maostra de S. Aureus em placas de meio VJ (Figura 7).
Resultado: Placa meio VJ Francy: crescimento sem fermentação.
Placa meio VJ Lais: crescimento com fermentação
 Figura 7. Semeio em agar VJ. Fonte: autoria própria

Crecimento em Meio BHI, amostra orofaringe (Lais), crescimento em meio BHI

amostra orofaringe Francy. (Figura 8)

Figura 8. Semeio ágar BHI

Semeio em Agar manitol amostra (Lais) houve fermentação e crescimento.

Amostra S.Aureus crescimento e fermentação. Amostra Francy sem crescimento,
provavelmente não foi semeado colônia possível alça quente.
 Figura 8. Semeio em ágar Manitol. Fonte: autoria própria

Resultado do antibiograma: placa Francy: (Sensível para amicacina-penicilina;

resistente para oxacina). Placa Aureus tubo: (sensível para amicacina e resistente para
outros). Placa aureus (resistente a vancomicina e oxacina, sensível a penicilina e
amicacina) Figura 9.

Figura 9. Antibiograma ágar Muller Hinton. Fonte: autoria própria

Prova de catalase positiva realizada das amostras de orofaringe (Lais) (Figura 10)
 Figura 10. Prova de catalase

Inoculação de amostra com Alça de Drigalski, para inoculação de disco de

antibióticos para antibiograma(Figura 11).

Figura 11. Semeio com alça de Drigalski

 Teste de Pyr positiva (coloração vermelha) para S. pyogenes e negativa par P.
alruginosa (coloração amarela) (Figura 12).

Figura 12. Teste de Pyr. Fonte: autoria própria

Prova de coagulase positiva (S. aureus) (Figura 13)

Figura 13. Prova de coagulase. Fonte: autoria própria aulas práticas

Microcultivo de fungos (Aspergillus)

 Após três tentativas de realizar microcultivo do fungos Aspergillus, conseguimos
observar a formação do crescimento do fungo. (Figura 14)

Figura 14. Micro cultivo Aspergillus. Fonte: autoria própria estágios

Observação microscópica aumento 40X, lâmina do microcultivo de fungos

Aspergillus, foi observada a presença de conídios, vesícula, hifas e conidióforos e
coloração azul.

Figura 15. Lâmina microcultivo com corante azul de lactofinol

Provas Bioquímicas

Meios Sim Presença de diferentes bactérias

: motilidade, H2S, indol negativo, indol positivo

Figura 16. Meios SIM com diferentes bactérias. Fonte: autoria própria estagios, 2021

Provas bioquímicas meios ágar tubo inclinada (uréia, TSI, citrato de Simmons e
lisina).

Figura 17. Meios bioquímicos (Fonte: autoria própria, 2021).

Discussão e conclusões
 Ao desenvolver as atividades no laboratório prático nas técnicas de
microbiologia e entendimento e a interpretação dos resultados, conseguimos aprimorar
maior compreensão do estudo teórico, clínico e patológico. Os resultados obtidos nas
análises tiveram algumas variações não esperadas ou inconclusivas, podendo observar
algumas causas como erro na técnica como por exemplo o aquecimento da alça sem
deixar esfriar para realizar estria, matando o microrganismo.
As diversas análises de microbiologia desenvolvidas no estágio, desde o
prepara do meio, até as técnicas de semeio, exame direto, provas bioquímicas e
técnicas adicionais, auxiliaram na compreensão e o melhor entendimento desses
diferentes tipos de microrganismos relacionando com a patologia clínica, sendo um
fator importante para auxílio na identificação e na liberação do resultado.
A utilização dos laboratórios multiuso da faculdade Claretiano nos auxiliou para
o primeiro passo de iniciação na rotina laboratorial, revisando os conceitos teóricos e
clínicos em microbiologia, o desenvolvimento prático capacitou a termos princípios
básicos nas atividades técnicas, com certeza de grande valor de aprendizagem para a
capacitação profissional e o mercado de trabalho.

REFERÊNCIAS

VERMELHO, A. B; et al. Práticas de microbiologia. 2. ed. Rio de Janeiro : Guanabara

Koogan, 2019. Disponível em bibliioteca virtual
<https://integrada.minhabiblioteca.com.br/#/books/9788527735575/cfi/6/10!/4/16@0:25.
2> Acessado em: 17/06/2021.

BD INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO – MEIOS EM PLACAS PRONTOS A USAR. BD

Salmonella Shigella Agar. Rev.: April 2013. Disponível em:
<https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=9082#:~:text=BD%20Salmonella%20Shigella
%20Agar%20(SS,Salmonella%2C%20provenientes%20de%20amostras%20cl
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Meios de cultura Prolab. Disponível em:

<https://www.prolab.com.br/blog/curiosidades/o-que-e-meio-de-cultura-e-para-
que-serve/> Acesso em: 13/06/2021.

ANVISA. Prova de coagulase. Disponível em: <

https://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/modulo
4/id_sta2.htm> Acesso em: 13/06/2021.

ANVISA. Prova de catalase. Disponível em:

<https://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/modul
o4/id_stre2.htm > Acesso em: 13/06/2021.

ANVISA. Teste de Pyr. Disponível em: <

https://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/modulo
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LABTEST. Bulas procedimento Bula Bilirrubina. Disponível em:
<https://labtest.com.br/wpcontent/uploads/2016/09/Bilirrubina_31_Port.pdf> Acesso em;
16/06/2021.